Articolo metodologico

Metodo per studiare il metabolismo nelle cellule linfoidi utilizzando la chimica per misurare l'incorporazione della puromicina mediante citometria a flusso

973 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/67377

⸱

15 agosto 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Il protocollo mostra un metodo basato sulla citometria a flusso che utilizza la chimica per studiare il metabolismo energetico nelle cellule.

Abstract

Dopo la stimolazione dell'antigene, le cellule T naive subiscono una rapida proliferazione ed espansione in cellule T effettrici. Il metabolismo svolge un ruolo importante nella generazione della biomassa necessaria per queste cellule in rapida proliferazione e per la generazione di molecole necessarie per la differenziazione e la funzione delle cellule T effettrici, che influenzano l'esito della risposta immunitaria adattativa nelle infezioni o nei tumori. Le cellule T naive riprogrammano il loro metabolismo in seguito a stimolazione antigenica per aumentare la generazione di ATP, necessaria per sostenere la loro crescita, biosintesi e funzioni effettrici. L'ATP può essere generato in una cellula sia dalla via della fosforilazione mitocondriale-ossidativa (OXPHOS) sia dalla via glicolitica. Poiché la maggior parte dell'ATP generato in una cellula in divisione e in crescita viene utilizzato per la sintesi delle proteine, la sintesi proteica è stata utilizzata come surrogato dei livelli di ATP. La sintesi proteica può essere misurata mediante l'incorporazione della puromicina, che imita l'adenosina 3' di un tRNA caricato con una tirosina modificata e porta alla cessazione spontanea della traduzione proteica. Inibitori metabolici come il 2-desossiglucosio (2DG), che blocca la via glicolitica, e l'oligomicina (O), che blocca il complesso 5 della catena di trasporto degli elettroni (ETC), possono essere utilizzati per studiare le dipendenze della generazione cellulare di ATP su queste due vie in combinazione con la valutazione della sintesi proteica in un metodo chiamato SCENITH. Descriviamo qui una variante di questo metodo che rileva l'incorporazione della puromicina mediante citometria a flusso utilizzando la chimica. Questo metodo di studio del metabolismo è relativamente semplice e può essere utilizzato per valutare popolazioni cellulari rare, nonché campioni di pazienti, mediante citometria a flusso.

Introduzione

Negli ultimi anni, c'è stato un crescente apprezzamento dell'importante ruolo del metabolismo nella regolazione delle cellule T. Il metabolismo cellulare regola molte funzioni critiche nei linfociti, tra cui l'espansione clonale delle cellule T patogeno-specifiche e la loro differenziazione in sottogruppi di cellule effettrici, che sintetizzano una varietà di molecole effettrici, tra cui citochine infiammatorie e granzimi citolitici necessari per uccidere i patogeni1. Lo studio del metabolismo delle cellule T è quindi importante sia per valutare la normale funzione delle cellule T sia per lo sviluppo di potenziali terapie.

Le cellule T naïve sono metabolicamente quiescenti e si affidano al metabolismo catabolico e alla fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per il loro fabbisogno energetico 1,2. Dopo l'attivazione del recettore delle cellule T (TCR), le cellule T subiscono una rapida riprogrammazione metabolica guidata in parte dalla sovraregolazione dei trasportatori di nutrienti sulla superficie delle cellule, che aumentano l'assorbimento di glucosio e di più aminoacidi, tra cui la glutammina, dall'ambiente. Questi elementi costitutivi dei nutrienti vengono poi utilizzati nelle vie anaboliche per produrre macromolecole che contribuiscono alla crescita cellulare e supportano l'aumento delle richieste di energia associate all'aumento della crescita e della divisione cellulare 1,2,3. La riprogrammazione metabolica nelle cellule T attivate rende le cellule più dipendenti dalla glicolisi aerobica e dalla glutamminolisi per il loro fabbisogno energetico 1,2,3. Dopo la stimolazione del TCR, l'assorbimento dei nutrienti svolge anche un ruolo critico nell'attivazione delle vie molecolari a valle3. Ad esempio, l'assorbimento di aminoacidi e l'aumento della concentrazione locale di aminoacidi attivano la segnalazione mTORC14. Al contrario, la riduzione della disponibilità di aminoacidi intracellulari diminuisce la via di segnalazione mTORC1 2,3,5,6,7. Pertanto, il metabolismo e la funzione cellulare sono strettamente collegati in una cellula T effettrice.

Il grande aumento della biomassa necessaria per la rapida divisione delle cellule T richiede l'upregolazione della sintesi/traduzione proteica8. La sintesi proteica può essere quantificata in una cellula studiando l'incorporazione della puromicina9, un imitatore del tirosil-tRNA che blocca la traduzione incorporando, marcando e rilasciando catene polipeptidiche allunganti dai ribosomi traducenti9. La traduzione delle proteine è un processo altamente dipendente dall'energia; infatti, la maggior parte dell'ATP generato nella divisione e nella crescita delle cellule viene utilizzato per la sintesi delle proteine. Pertanto, la sintesi proteica è stata utilizzata come misura surrogata dell'ATP10 cellulare. Per generare ATP, le cellule si affidano comunemente alla glicolisi e/o alla via mitocondriale OXPHOS11. La glicolisi genera due molecole di ATP per molecola di glucosio. La via OXPHOS genera 36 ATP per glucosio12,13, ma la glicolisi può generare ATP più velocemente14. Pertanto, le cellule T attivate in rapida divisione, come le cellule tumorali, dipendono fortemente dalla via glicolitica per la generazione di ATP.

La dipendenza di una cellula da ciascuna via metabolica può essere studiata mediante l'uso di inibitori specifici. L'inibitore della via glicolitica 2-desossiglucosio (2-DG), che è un analogo del glucosio, agisce come un inibitore competitivo per l'enzima glicolitico esochinasi15. Il 2-DG è fosforilato a 2DG-fosfato (2DG-P) dall'esochinasi. La 2DG-P non può essere ulteriormente metabolizzata dalla fosfoesoso isomerasi, che normalmente converte il glucosio-6-fosfato (G-6-P) in fruttosio-6-fosfato16. Il 2DG-P è, quindi, intrappolato e si accumula nelle cellule, portando all'inibizione della glicolisi e alla deplezione dell'ATP cellulare, bloccando così la sintesi proteica17. In modo simile, la dipendenza delle cellule dalla via mitocondriale OXPHOS può essere studiata utilizzando l'oligomicina, che si lega al canale protonico dell'ATP sintasi della catena di trasporto degli elettroni (ETC)18, bloccando così la sintesi mitocondriale dell'ATP (Figura 1). L'uso di questi inibitori in combinazione con una valutazione della sintesi proteica può fornire un quadro dello stato metabolico delle cellule ed è stato utilizzato in un potente metodo a singola cellula noto come SCENITH che valuta l'incorporazione della puromicina utilizzando la citometria a flusso10. Tuttavia, la disponibilità di reagenti SCENITH può essere limitante. Altre tecniche comunemente utilizzate per valutare la glicolisi e l'OXPHOS includono le analisi del flusso extracellulare del cavalluccio marino, che richiedono un numero maggiore di cellule, che potrebbero non essere praticabili sperimentalmente. In questo articolo, descriviamo un metodo alternativo per valutare l'incorporazione della puromicina utilizzando un reagente chimico Click-it disponibile in commercio. La facilità di questo metodo consente una rapida valutazione dello stato metabolico dei linfociti, comprese le popolazioni cellulari rare e i campioni di pazienti.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

L'allevamento degli animali e gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il protocollo approvato G98-3 dal National Human Genome Research Institute's Animal Use and Care Committee, NIH, e con il protocollo approvato LISB 22E dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases Animal Care and Use Committee, NIH. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 6 e 12 settimane, allevati e alloggiati in condizioni specifiche prive di patogeni (SPF). Risultati simili sono stati ottenuti con topi femmine. Il sangue intero umano è stato ottenuto dalla banca del sangue NIH nell'ambito del protocollo 99-CC-0168 approvato dal NIH Clinical Center IRB Raccolta e distribuzione di componenti del sangue da donatori sani per uso di ricerca in vitro. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.

1. Isolamento e coltura di cellule T CD4+ naïve al topo

  1. Purificare le cellule T CD4+ naive mediante selezione negativa da sospensioni unicellulari raggruppate di milza o linfonodi di topo da topi maschi di 6-12 settimane utilizzando un sistema di separazione cellulare magnetica secondo il protocollo del produttore.
  2. Cellule di coltura (come descritto di seguito) in terreni IMDM contenenti L-alanil-L-glutammina dipeptide e integrate con siero fetale bovino al 10%, 2 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina e 0,05 mM di 2-β-mercaptoetanolo.
  3. Co-coltura di cellule T CD4 naïve in un rapporto di 1:8 con splenociti T-depleti trattati con mitomicina C (descritti di seguito) come APC in piastre a 48 pozzetti in condizioni non polarizzate (1 μg/mL di anti-CD3 [clone 2C11] e 3 μg/mL di anti-CD28 [clone 37.51]) e Th0 (1 μg/mL di anti-CD3, 3 μg/mL di anti-CD28, 10 μg/mL ciascuna di anti-IFNg [clone XMG1.2], anti-IL-12 [clone C17.8] e anti-IL-4 [clone 11B11]) per 72 ore a 37 °C. Impostare le colture utilizzando 1 x 10,6 APC e 0,13 x 10,6 cellule T CD4 naive per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti (Tabella dei materiali)
  4. Generazione di splenociti T-depleti trattati con mitomicina C come APC: in breve, colorare una sospensione di una singola cellula di milza di topo con anticorpi CD4 e CD8 coniugati con FITC. Successivamente, etichettare magneticamente le celle con microsfere Anti-FITC (vedi Tabella dei materiali). Quindi, utilizzando un sistema di separazione magnetica delle celle secondo il protocollo del produttore, selezionare negativamente le APC dalle cellule T. Successivamente, trattare le APC con 50 μg/mL di mitomicina C per 40 minuti a 37 °C dell'incubatore, quindi lavare 3 volte con 1 PBS.

2. Isolamento e cultura delle PBMC umane

  1. Isolare le PBMC dal sangue intero utilizzando mezzi di separazione linfocitaria e secondo il protocollo del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
  2. PBMC di coltura in terreni RPMI integrati con 2 mM di L-glutammina, 0,01 M HEPES, 1 mM di piruvato di sodio, 1% di aminoacidi non essenziali, 100 U/mL di penicillina e streptomicina, 0,05 mM di 2-β-mercaptoetanolo e 5% di siero umano.
  3. Coltura 1 x 106 PBMC per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U con 5 μg/mL di fitoemoagglutinina-L (PHA-L) per 18-24 ore a 37 °C.

3. Dosaggio metabolico

NOTA: È importante mantenere tutte le cellule, gli inibitori [oligomicina (O), 2-desossiglucosio (2-DG), DMSO (Co)] e il reagente O-propargil-puromicina (OPP) il più vicino possibile a 37 °C. Aliquotare le cellule, gli inibitori e il reagente OPP su 96 piastre con fondo a U e lasciare le piastre in un incubatore a 37 °C il più possibile. Aliquotare gli inibitori 2-DG e O in volumi più piccoli per evitare il congelamento-disgelo multiplo.

  1. Preparare una soluzione madre 2 M (20x) di 2-DG e una soluzione madre 40 μM (40x) di O. Per l'OPP, diluire 1 μL di OPP in 49 μL di terreno in modo che la concentrazione sia di 400 μM: questa sarà la soluzione madre 20x.
  2. Assicurarsi che tutti gli altri componenti del kit di sintesi proteica OPP (vedere la Tabella dei materiali) siano a temperatura ambiente (RT), prima di iniziare l'esperimento.
  3. Preparare 1x tampone di reazione OPP diluendo un'aliquota dal flacone del Componente C 1:10 con acqua deionizzata. Dopo l'uso, conservare la soluzione 1x rimanente a 2-8 °C.
  4. Seminare 0,1-2 x 106 cellule per pozzetto di piastra a 96 pozzetti a fondo tondo per ogni condizione (Co / DG / O / DGO) in 100 μL di IMDM completo (per cellule T CD4 di topo) o RPMI completo (per PBMC umane) o qualsiasi mezzo completo a scelta. Conservare il piatto nell'incubatrice il più possibile.
  5. Aggiungere 1x inibitori da soluzioni madre (5 μL di 20x DG, Co), (2,5 μL di 40x O) e incubare per 15 minuti a 37 °C, 5% CO2. Le concentrazioni finali sulle cellule sono 100 mM DG e 1 μM O. Mescolare accuratamente gli inibitori con le cellule con una pipetta. Per facilità, aliquotare gli inibitori in una piastra a 96 pozzetti e aggiungere cellule agli inibitori e mescolare bene pipettando su e giù alcune volte.
  6. Nel campione DGO, aggiungere 1 volta di DG (5 μL), mescolare accuratamente con una pipetta e incubare per 10 minuti a 37 °C, 5% CO2. Quindi, aggiungere 1x O (2,5 μL), pipettare un paio di volte e incubare per 5 minuti a 37 °C, 5% CO2.
  7. Senza lavare via gli inibitori, aggiungere 5 μL di OPP dalla soluzione madre 20x (400 μM) a ciascun campione in modo che la concentrazione sia di 20 μM nelle cellule, pipettare su e giù più volte e incubare per 30 minuti a 37 °C, 5% CO2. Per facilità, aliquotare l'OPP su una piastra a 96 pozzetti, aggiungere cellule con inibitori al reagente OPP e mescolare bene.
    NOTA: Per le cellule meno attive dal punto di vista metabolico e le cellule isolate direttamente ex vivo, aumentare il tempo di incubazione dopo l'aggiunta di OPP. Il tempo di incubazione con OPP deve essere standardizzato per ogni tipo di cellula.
  8. Dopo l'incubazione con OPP, aggiungere 100-150 μL di tampone FACS ghiacciato (2% FBS e 1 mM EDTA in 1x PBS). Centrifugare a 750 x g per 2 min a 4°C. Eliminare il surnatante e ripetere la fase di lavaggio.
  9. Colorare le cellule con opportuni marcatori di superficie, anticorpo CD4 di topo (utilizzato a diluizione 1/200) o anticorpo CD4 anti-umano (utilizzato a diluizione 1/50), reagente vivo/morto (utilizzato a diluizione 1/600), in presenza di Fc Block (utilizzato a diluizione 1/200). Incubare per 25-30 minuti a 4 °C al buio.
  10. Lavare la piastra con 150-200 μl di tampone FACS e centrifugare a 750 x g per 2 minuti a 4 °C. Muovi delicatamente la piastra per eliminare il surnatante, quindi ripeti la fase di lavaggio. In questa fase, le cellule vengono colorate sulla superficie.
  11. Risospendere le cellule in PFA all'1% in PBS, mescolare bene e incubare per 10-15 minuti a 4 °C. Proteggere dalla luce.
  12. Lavare con FACS Buffer e centrifugare a 750 x g per 2 min a 4 °C e ripetere il lavaggio.
  13. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di freddo 1x tampone di permeabilizzazione delle saponine (0,1% (wt/vol) Saponina + 3% FBS in 1x PBS). Incubare a RT, al riparo dalla luce per 5-15 minuti. Le cellule sono fissate e permeabilizzate in questo momento.
  14. Preparare 1x additivo tampone di reazione OPP (Componente E) diluendo la soluzione 10x 1:10 in acqua deionizzata. Prepara questa soluzione fresca e usala lo stesso giorno.
  15. Preparare il cocktail di reazione OPP secondo la Tabella 1. Utilizzare il cocktail di reazione entro 15 minuti dalla preparazione.
  16. Centrifugare i campioni dal passaggio 3.13 a 750 x g per 2 minuti. Scartare il surnatante. Lavare le cellule 2 volte con 200 μL di 1 tampone di permeabilizzazione delle saponine. Girare e scartare il surnatante.
  17. Aggiungere 50-100 μl di cocktail di reazione OPP (preparato al punto 3.12) in ciascun pozzetto e mescolare bene. Incubare per 30 minuti a RT, al riparo dalla luce. Quindi, centrifugare le piastre a 750 x g o 2 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
  18. Risospendere il pellet in 200 μl di 1x tampone di permeabilizzazione delle saponine e centrifugare i campioni a 750 x g per 2 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
  19. Risospendere in 50 μl di tampone di risciacquo di reazione (componente F) per pozzetto e centrifugare a 750 x g per 2 minuti a 4°C. Risospendere le cellule colorate in 200 μL di tampone FACS.
  20. Analizzare i campioni mediante citometria a flusso (vedere la Figura 1 supplementare) lo stesso giorno, oppure conservare le cellule al buio a 4 °C e analizzarle il giorno successivo.

4. Analisi del dosaggio metabolico

  1. Misurare l'incorporazione della puromicina (OPP) come surrogato della sintesi proteica nelle seguenti condizioni: 1) condizione di controllo (Co); 2) nelle cellule in cui la via glicolitica è bloccata dal 2-DG; 3) nelle cellule in cui la via mitocondriale dell'OXPHOS è bloccata da O; e 4) in cellule in cui sia la via glicolitica che quella mitocondriale sono bloccate da inibitori (DGO), valutando l'intensità media di fluorescenza (MFI) dell'OPP (Figura 2).
  2. Analizza la dipendenza delle cellule verso un particolare percorso osservando l'MFI di OPP in ciascuna condizione. Valutare direttamente l'MFI come misura della sintesi proteica. Calcolare la dipendenza dal glucosio, la capacità glicolitica, la capacità di ossidazione degli acidi grassi (FAO) e degli amminoacidi (AAO) e la dipendenza mitocondriale secondo10.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Le cellule T CD4+ naive sono state isolate dalla milza e dai linfonodi dei topi e differenziate in linee Th0 o non polarizzate (NP) per 72 ore. Le cellule sono state raccolte dopo 0 ore, 48 ore e 72 ore di coltura e l'incorporazione dell'OPP è stata misurata osservando l'MFI dell'OPP. Le cellule T CD4+ naive erano meno sintetiche delle cellule T attivate, come si vede dall'MFI dell'OPP (Figura 3). Le cellule naive erano parzialmente dipendenti dalla glicolisi, ma soprat...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo articolo fornisce un metodo per studiare il metabolismo nelle cellule linfoidi mediante citometria a flusso, basato sulla tecnologia SCENITH, ma utilizzando la marcatura chimica della puromicina incorporata. Sebbene ci siamo concentrati sui linfociti, questo protocollo può essere adattato per studiare il metabolismo in qualsiasi tipo di cellula. Questo metodo è anche vantaggioso per studiare il metabolismo in rare popolazioni di cellule e campioni di pazienti, dove altre tecniche,...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Qin Xu e il Dr. Avik Dutta per aver fornito campioni di PBMC e preziosi suggerimenti sperimentali. Questa ricerca è stata supportata in parte dalla Divisione di Ricerca Intramurale del NIAID, NIH.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-MercaptoetanoloThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 anticorpo anti-Puromicina Biolegend381506Diluizione utilizzata: 1/100
Alexa Fluor 647 anticorpo CD4 umanoBiolegend357422Diluizione utilizzata:  1/50
BD Horizon BUV737 Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences612761Diluizione utilizzata:  Kit
analisi della sintesi proteica 1/200 Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488Thermo FisherC10456
HEPES (1 M)Thermo Fisher15630080
siero umanoMillipore SigmaH4522
IMDM, integratore GlutaMAX, 500 mlThermo Fisher31980030
InVivoMAb anti-topo CD28, clone:  37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb anti-topo CD3ε, Clone:  145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb anti-topo IFNγ, Clone:  XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb anti-topo IL-12 p40, Clone:  C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb anti-topo IL-4, Clone:  11B11BioXcellBE0045
L-Glutammina (200 mM)Thermo Fisher25030081
Kit di colorazione Aqua Dead Cell fissabile LIVE/DEAD, per eccitazione a 405 nmThermo FisherL34966Diluizione utilizzata:  Mezzo
separazione dei linfocitiMP Biomedicals50494X
aminoacidi non essenziali MEM (100X)Thermo Fisher11140050
Mitomicina C da Streptomyces caespitosusSigmaM0503-10X2MG
Kit di isolamento CD4 Naive, topoMiltenyi Biotec130-104-453
Paraformaldeide 16% Soluzione acquosa Scienze della microscopia elettronica15710
PBS (1X), pH 7,4, 500 mLQualità Biologici114-058-101
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL). 100mLThermo Fisher15140122
Fitoemoagglutinina-L (PHA-L)Millipore Sigma11249738001
Siero fetale bovino di prima qualità (FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 Medium, senza glutamminaThermo Fisher21870076
SaponinaThermo FisherA18820.22
Piruvato di sodio (100 mM)Thermo Fisher11360070
di di 1/600 LSM Soluzione di di grado EM

Riferimenti

  1. Saravia, J., Raynor, J. L., Chapman, N. M., Lim, S. A., Chi, H. Signaling networks in immunometabolism. Cell Res. 30, 328-342 (2020).
  2. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 20, 55-70 (2020).
  3. Raynor, J. L., Chi, H. Nutrients: Signal 4 in T cell immunity. J Exp Med. (221), e20221839(2024).
  4. Shimobayashi, M., Hall, M. N. Multiple amino acid sensing inputs to mTORC1. Cell Res. 26, 7-20 (2016).
  5. Huang, H., et al. In vivo CRISPR screening reveals nutrient signaling processes underpinning CD8(+) T cell fate decisions. Cell. 184, 1245-1261.e21 (2021).
  6. Pollizzi, K. N., et al. Asymmetric inheritance of mTORC1 kinase activity during division dictates CD8(+) T cell differentiation. Nat Immunol. 17, 704-711 (2016).
  7. Verbist, K. C., et al. Metabolic maintenance of cell asymmetry following division in activated T lymphocytes. Nature. 532, 389-393 (2016).
  8. Marchingo, J. M., Cantrell, D. A. Protein synthesis, degradation, and energy metabolism in T cell immunity. Cell Mol Immunol. 19, 303-315 (2022).
  9. Enam, S. U., et al. Puromycin reactivity does not accurately localize translation at the subcellular level. Elife. 9, e60303(2020).
  10. Argüello, R. J., et al. SCENITH: A Flow Cytometry-Based Method to Functionally Profile Energy Metabolism with Single-Cell Resolution. Cell Metab. 32, 1063-1075.e7 (2020).
  11. Dunn, J., Grider, M. H. Physiology, Adenosine Triphosphate. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
  12. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9, 18699(2019).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  14. Pfeiffer, T., Schuster, S., Bonhoeffer, S. Cooperation and competition in the evolution of ATP-producing pathways. Science. 292, 504-507 (2001).
  15. Brown, J. Effects of 2-deoxyglucose on carbohydrate metabolism: review of the literature and studies in the rat. Metabolism. 11, 1098-1112 (1962).
  16. Weindruch, R., et al. Caloric restriction mimetics: metabolic interventions. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 56 Spec No1, 20-33 (2001).
  17. Gronostajski, R. M., Pardee, A. B., Goldberg, A. L. The ATP dependence of the degradation of short- and long-lived proteins in growing fibroblasts. J Biol Chem. 260, 3344-3349 (1985).
  18. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicol In Vitro. 67, 104907(2020).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Metabolismo delle cellule linfoidiProliferazione delle cellule TSintesi proteicaRiprogrammazione metabolicaVia glicoliticaFosforilazione ossidativaInibitori metaboliciMetodo SCENITH
Video in arrivo

Articoli correlati