Analisi al microscopio confocale dello smistamento delle proteine in Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Summary

Questo protocollo descrive la selezione di marcatori plasmodesmici ottimali per analisi basate su microscopia confocale del targeting proteico dei plasmodesmi durante le interazioni virus-plasmodesmi o il trasporto plasmodesmico.

Abstract

I plasmodesmi sono nanopori membranosi che collegano il citoplasma delle cellule vegetali adiacenti e consentono il traffico da cellula a cellula di nutrienti, macromolecole e virus invasori. I plasmodesmi svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della comunicazione intercellulare, contribuendo allo sviluppo delle piante, alle risposte ambientali e alle interazioni con i patogeni virali. La scoperta della localizzazione plasmodesmale di proteine vegetali o virali potrebbe fornire utili informazioni funzionali sulla proteina ed è importante per comprendere i meccanismi delle interazioni pianta-virus. Per facilitare questi studi, descriviamo un protocollo per l'analisi basata sulla microscopia confocale di diverse proteine bersaglio plasmodesmale per selezionare il miglior marcatore plasmodesmale per studiare le interazioni virus-plasmodesma o il trasporto plasmodestmico. In particolare, le analisi di questi eventi sono illustrate utilizzando la proteina del movimento cellula-cellula (MP) del virus della vena di rapa (TVCV), la proteina localizzata 5 di Arabidopsis Plasmodesma (PDLP5) e la proteina legante il callosio 1 di Plasmodesmata. I dati di localizzazione dei plasmodami proteici sono analizzati in parallelo con la visualizzazione globale dei plasmodesmi utilizzando la colorazione con blu all'anilina dei tessuti campionati. Questi approcci possono essere facilmente adattati per analizzare la localizzazione plasmodesmale di qualsiasi proteina cellulare o patogena nelle planta.

Introduction

I plasmodesmi (PD) svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo delle piante, delle risposte ambientali e delle interazioni con i patogeni virali attraverso la regolazione della comunicazione intercellulare ^1,2. La PD si forma inizialmente durante la citochinesi, con centinaia di PD inserite nella nuova cellula tra le due cellule figlie, fornendo così i canali per la comunicazione cellula-cellula ^3,4. La PD è una struttura ricca di membrana, contenente la membrana derivata dal reticolo endoplasmatico (ER), un desmotubulo trans-PD, nella parte centrale dei pori che sono rivestiti dalla membrana plasmatica ^3,4. Gli approcci proteomici comparativi hanno identificato numerose proteine funzionali del PD, tra cui β-1,3-glucanasi (BG), calcosio sintasi (CALS), proteine localizzate nei plasmodesmi (PDLP), proteine leganti il callosio (PDCB), proteine della regione transmembrana di domini C2 multipli (MCTP)³ e chinasi simili al recettore ripetuto ricche di leucina (RLK)⁵. Recentemente, Kirk et al. hanno sviluppato uno strumento chiamato plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1), che ha reso possibile prevedere nuove proteine PD in 22 specie vegetali⁶. La PD varia in permeabilità e struttura durante lo sviluppo delle piante e la risposta a vari stress. La deposizione e l'idrolisi del callosio (β-1,3-glucano) nella regione del collo che circonda la PD è uno dei meccanismi ampiamente noti della regolazione della PD⁷.

Molti microbi patogeni, tra cui funghi, batteri e virus, possono manipolare la dilatazione o la struttura del PD durante la loro infezione ^2,8,9. Magnaporthe oryzae, l'agente eziologico del blasto del riso, dispiega ife invasive intracellulari per spostarsi da una cellula all'altra attraverso PD⁸. Un patogeno batterico Pseudomonas syringae pv. il pomodoro richiede una proteina effettrice HopO1-1 per il movimento intercellulare e la diffusione nella pianta ospite attraverso l'interazione e la destabilizzazione di PDLP7, aumentando così il flusso molecolare nelle cellule vicine in Arabidopsis⁹. Tuttavia, i virus delle piante sono più versatili nella regolazione del PD durante la loro trasmissione intercellulare, con la proteina del movimento virale (MP) che promuove il movimento da cellula a cellula². A causa della loro importante funzione nella regolazione dello sviluppo e della crescita delle piante, nonché della loro interazione con i microbi patogeni delle piante, la malattia di Parkinson ha guadagnato una crescente attenzione negli ultimi anni. In Arabidopsis thaliana, ci sono due tipi principali di proteine funzionali del PD, PDLP (1-8) e PDCB (1-5), e molte di esse, ad esempio PDLP5 ^1,10,11, PDLP1¹², PDLP6¹³, PDLP7¹⁴ e PDCB1¹⁵, hanno un ruolo nella manipolazione della permeabilità del PD attraverso la regolazione della deposizione di callosio. Tuttavia, è stato riscontrato che alcuni PDLP hanno una ridondanza funzionale, ad esempio, i mutanti knockout di pdlp1 e pdlp1,2 non hanno influenzato il traffico molecolare, sebbene i mutanti double knockout di pdlp1,3 e pdlp2,3 abbiano mostrato un aumento della permeabilità plasmodesmale¹⁶. È interessante notare che la sottoregolazione/knockout o la sovraespressione di PDLP5 da sola determinano un aumento o una diminuzione della permeabilità plasmodamale, rispettivamente ^1,17. Recentemente, Li et al. hanno scoperto che PDLP5 e PDLP6 funzionano in diverse interfacce cellulari¹³. Questi risultati indicano che PDLP5 potrebbe avere funzioni non ridondanti con altri PDLP.

A causa della funzione critica della PD nella comunicazione intercellulare, abbiamo sviluppato un protocollo per l'implementazione delle proteine PD PDLP5 e PDCB1 e della proteina virale del movimento cellula-cellula (MP) del virus della vena di rapa (TVCV) come marcatori PD semplici, convenienti e affidabili per la sperimentazione di biologia cellulare. Per ulteriori verifiche, la visualizzazione della PD utilizzando la colorazione blu all'anilina dei tessuti campionati è proceduta in parallelo. I protocolli descritti per la localizzazione PD di PDLP5, PDCB1 e TVCV MP possono essere facilmente adattati per analizzare la potenziale localizzazione PD di qualsiasi proteina cellulare o derivata da patogeni nelle piante viventi.

Protocol

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Crescita delle piante

1. Coltiva i semi di Nicotiana benthamiana in terreno umido in una camera in ambiente controllato a 23 °C sotto 16 ore di luce e 8 ore di buio.
2. Dopo circa 2 settimane, trasferisci con cura le piantine con i pellet di torba attorno alle loro radici in vasi più grandi e continua la crescita nelle stesse condizioni per 4-5 settimane per gli esperimenti di agroinfiltrazione.
   NOTA: Non utilizzare le piante quando iniziano a fiorire, poiché l'accumulo di GFP diminuirà allo stadio¹⁸ dell'infiorescenza.

2. Costruzione vettoriale

1. Utilizzare la PCR per amplificare le sequenze codificanti di interesse con la DNA polimerasi ad alta fedeltà Q5 e clonarle nel vettore di ingresso pDONR207 mediante la reazione BP¹⁹ utilizzando un kit di clonasi BP disponibile in commercio.
2. Trasferire i geni bersaglio nei plasmidi di ingresso risultanti nel vettore di destinazione pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 mediante la reazione LR¹⁹ utilizzando un kit di clonasi LR disponibile in commercio per produrre plasmidi con il tag EGFP fuso al C-terminale delle proteine bersaglio.
3. Verificare tutti i costrutti mediante PCR e sequenziamento¹⁹.

3. Agroinfiltrazione

1. Cellule Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105 contenenti diversi vettori su piastre di agar LB e incubate per 2 giorni a una temperatura inferiore a 28 °C.
2. Trasferire una singola colonia in 2 mL di brodo LB e incubare per una notte a 28 °C con agitazione (250 giri/min).
3. Rimuovere 1 ml dalla coltura notturna, seguito dall'aggiunta di 4 ml di brodo LB fresco e ricoltivare per 1 ora nelle stesse condizioni.
4. Regolare la sospensione batterica a OD₆₀₀ = 0,1 (OD₆₀₀ = 0,2 per la co-espressione di due proteine) con tampone di infiltrazione (MgCl₂, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5,6).
5. Mescolare diverse sospensioni batteriche in un rapporto di 1:1 (v/v) per ottenere una concentrazione finale di OD₆₀₀ = 0,1. (facoltativo).
6. Incubare la sospensione batterica a temperatura ambiente per 3 ore con agitazione delicata.
7. Infiltra la superficie aassiale delle foglie completamente espanse di diverse piante con una siringa monouso senza ago da 1 ml e contrassegna l'area infiltrata (di un colore più scuro rispetto al tessuto circostante non infiltrato) con una penna impermeabile.
8. Procedere alla sezione di microscopia confocale di questo protocollo (passaggio 5).
   NOTA: Possono essere utilizzati anche altri ceppi di Agrobacterium tumefaciens adatti alla trasformazione di specie vegetali di interesse.

4. Colorazione blu all'anilina

1. Aggiungere un'aliquota di 200 μl di blu anilina all'1% (in 50 mM di tampone fosfato di potassio, pH 8,0) a un vetrino da microscopio²⁰.
2. Asportare l'area infiltrata di circa 0,5 cm × 0,5 cm, lontano dalla vena, con una lama, e trasferire i campioni di tessuto fogliare nella soluzione di blu di anilina (lato abassiale rivolto verso l'alto) sul vetrino del microscopio, assicurarsi che i campioni di tessuto fogliare siano immersi nella soluzione di blu di anilina, quindi coprirla con un vetro di copertura (22 mm x 50 mm).
3. Posizionare i vetrini del microscopio con i campioni in un essiccatore collegato a una pompa a vuoto ed evacuare per 2 minuti (<0,8 Pa), seguiti da un lento rilascio della pressione e dall'incubazione al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Visualizza il segnale fluorescente del blu di anilina sotto un microscopio confocale a scansione laser con software compatibile.
   NOTA: Qui è stato utilizzato il metodo di colorazione blu all'anilina di Huang et ^al.20 . In una modifica di questa tecnica, lo stesso esperimento è stato eseguito senza la fase di vuoto di 2 minuti, producendo risultati simili e suggerendo che l'essiccazione sotto vuoto non è essenziale per la colorazione all'anilina. Inoltre, la concentrazione della colorazione blu all'anilina e il tempo di colorazione possono variare a seconda della fonte del tessuto fogliare, ecc.

5. Microscopia confocale

1. Raccogli due foglie da due piante in momenti diversi dopo l'infiltrazione. Tagliare la zona di infiltrazione a circa 0,5 cm × 0,5 cm di distanza dalla vena con una lama.
   1. Immergere i campioni di tessuto in una goccia di acqua sterile (con il lato abassiale rivolto verso l'alto) nella parte centrale di un vetrino da microscopio e coprirli con un vetro di copertura (22 mm x 50 mm), facendo attenzione a evitare bolle.
2. Assicurarsi che le lunghezze d'onda di eccitazione per il rilevamento dei segnali CFP, GFP e RFP siano rispettivamente di 405 nm, 488 nm e 561 nm e che i filtri di emissione per il rilevamento siano 410-602 nm per CFP e 400-602 nm per EGFP e RFP, con il foro stenopeico 1 AU e il guadagno master impostato su 769 V.
3. Visualizzare il segnale fluorescente dei tag autofluorescenti nell'area infiltrata utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con software compatibile a 1 giorno, 2 giorni, 3 giorni, 5 giorni, 7 giorni e 10 giorni dopo l'infiltrazione.
   1. Utilizzare una lente dell'obiettivo 10x e filtri GFP per localizzare le cellule con il segnale fluorescente, quindi passare a una lente dell'obiettivo 40x per la visualizzazione della localizzazione subcellulare e la registrazione delle immagini.
4. Raccogli 20 immagini per ogni condizione, utilizzando almeno due repliche biologiche indipendenti.
5. Punteggio Localizzazione PD della proteina testata in base all'aspetto diagnostico puntato del segnale alla periferia della cellula^21,22.
   NOTA: Quando si rileva la localizzazione subcellulare di una proteina sconosciuta, si consiglia di utilizzare almeno tre piante.

6. Analisi dei dati

1. Usa il software Fiji per dividere i canali e aggiungere la barra di scala alle immagini per la visualizzazione.
2. Utilizza il software Fiji per dividere i canali prima di misurare il valore medio della scala di grigi per ciascuna immagine per valutare l'intensità di fluorescenza GFP (per MP, PDCB1 e PDLP5) o CFP (per la colorazione blu all'anilina) in diversi punti temporali.
3. Utilizzare il software Fiji per dividere i canali prima della normalizzazione delle immagini di GFP (per MP, PDCB1 e PDLP5) o CFP (per colorazione blu all'anilina). L'area dell'immagine è stata misurata e i punti PD sono stati contati manualmente. È stato calcolato il numero di punti PD per 100 μm² .
4. Utilizza l'ANOVA bidirezionale con il test di confronto multiplo²³ di Tukey per determinare i valori P tra i diversi campioni e i diversi punti temporali con software statistici e grafici.
   NOTA: Per un'immagine a fluorescenza a canale singolo, il valore della scala di grigi di ciascun pixel rappresenta l'intensità di fluorescenza di quel punto²⁴. In questo caso, il valore medio della scala di grigi è stato utilizzato per valutare l'intensità della fluorescenza di ciascun campione in diversi punti temporali.

Results

Per facilitare gli studi sulla funzione della malattia di Parkinson nella fisiologia delle piante e nelle interazioni con i patogeni, sono state sviluppate tre proteine di riferimento semplici e affidabili per la localizzazione della malattia di Parkinson. Sono state selezionate due proteine PD cellulari e una proteina MP derivata da patogeni codificata dal tobamovirus vegetale TVCV. La localizzazione subcellulare di queste proteine è stata visualizzata utilizzando un reporter autofluorescente EGFP fuso al C-terminale di ciascuna proteina. In un approccio alternativo, le PD sono state visualizzate utilizzando la colorazione blu all'anilina dei depositi di callosio associati alla PD. Gli esperimenti hanno mostrato che sia PDLP5 che MP mostravano una localizzazione puntiforme di PD, con MP localizzato anche nel nucleo cellulare (Figura 1A), come precedentemente notato²⁵. Al contrario, PDCB1 sembrava partizionare tra PD ed ER (Figura 1A). Per i ricercatori meno esperti nell'interpretazione della localizzazione subcellulare delle proteine marcate con GFP, la Figura 1A illustra anche il caratteristico pattern nucleocitoplasmatico di EGFP espresso nelle cellule vegetali. Per confermare il segnale ER di PDCB1, abbiamo co-espresso PDCB1 con un marcatore ER e abbiamo scoperto che il segnale PDCB1 si sovrapponeva al segnale del marcatore ER (Figura 1B). Per valutare l'efficienza della localizzazione PD delle proteine testate, è stata calcolata la percentuale di cellule che esprimono il segnale fluorescente che mostravano una localizzazione PD di questo segnale (Tabella 1).

Per l'identificazione della localizzazione subcellulare mediante l'impiego di proteine di riferimento, è utile comprendere la scala temporale dell'espressione della proteina di riferimento e i potenziali cambiamenti della sua localizzazione. La Figura 2 mostra tale cinetica per MP, PDLP5 e PDCB1 quando le PD stesse sono state visualizzate mediante colorazione blu all'anilina. Sia MP che PDLP5 hanno iniziato ad accumularsi a PD già a un giorno dopo l'infiltrazione (dpi), e questo accumulo ha raggiunto un massimo apparente a 2 dpi, rimanendo stabile per altri 5 giorni, dopodiché l'intensità del segnale è diminuita, molto probabilmente a causa della degradazione della proteina. L'andamento temporale della selezione subcellulare di PDCB1 è stato più complesso: per i primi 3 dpi, PDCB1 ha mostrato un segnale ER comparabilmente forte, che ha quasi completamente oscurato la localizzazione del segnale PD-specifico, mentre a 5 dpi, quest'ultimo segnale è diventato più pronunciato (Figura 2), anche se in un minor numero di cellule. È interessante notare che l'emergere del chiaro pattern di localizzazione PD di PDCB1 dopo 5 dpi ha coinciso con un numero sostanzialmente inferiore di cellule che mostravano il segnale EGFP (Figura 1 supplementare). Pertanto, PDLP5 e MP possono funzionare come proteine di riferimento per la PD con scarso background nella maggior parte degli altri compartimenti cellulari, con una finestra temporale di visualizzazione ottimale di 2-5 dpi. PDCB1, d'altra parte, non è adatto come marcatore PD.

È stato quindi verificato che i marcatori PD mantengono la loro specificità di localizzazione subcellulare in presenza di altre proteine PD. A tal fine, MP-EGFP o PDLP5-EGFP è stato co-espresso con un²⁶ MP di un altro virus vegetale, il virus del mosaico del tabacco (TMV) marcato con CFP. La Figura 3 mostra che, in entrambi i casi, le proteine co-espresse hanno mostrato un chiaro pattern di localizzazione del PD. Allo stesso modo, la colorazione istologica con blu all'anilina specifica per la PD dei tessuti che esprimono MP-EGFP o PDLP5-EGFP non ha rilevato alcuna interferenza con la localizzazione PD dei segnali EGFP e blu all'anilina (Figura 3).

Gli studi di localizzazione della malattia di Parkinson spesso beneficiano di una stima più quantitativa dell'espressione complessiva della proteina di riferimento e del segnale della malattia di Parkinson. Questo approccio di quantificazione è illustrato nella Figura 4 e nella Figura 5. Per la quantificazione dell'espressione generale, è stata misurata l'intensità del segnale di PDLP5 e MP. Entrambe le proteine hanno mostrato segnali forti in tutti i punti temporali di visualizzazione durante il periodo di 10 dpi, con un'intensità massima del segnale a 3 dpi per PDLP5 e a 2 dpi per MP (Figura 4). Non ci sono state differenze statisticamente significative nell'intensità del segnale tra PDLP5 e MP in nessuno dei punti temporali di visualizzazione. L'intensità del segnale PDCB1 ha mostrato una maggiore fluttuazione tra i punti temporali, con il segnale più forte osservato a 7 dpi (Figura 4), sebbene fosse difficile raccogliere dati statisticamente significativi in questo punto temporale a causa della scarsità di cellule esprimettenti. Pertanto, i primi 3 dpi rappresentano il momento ottimale per rilevare l'espressione di PDCB1. Come previsto, i campioni di colorazione con blu di anilina hanno mostrato un segnale più stabile rispetto alle proteine espresse transitoriamente (Figura 4).

I punti PD formati da PDLP5 e MP sono stati quindi quantificati. PDLP5 ha mostrato un numero stabile di puncta PD per tutto il periodo di osservazione, senza differenze statisticamente significative tra due dei punti temporali testati (Figura 5). Il numero più alto di PD puncta formati da MP è stato rilevato a 2 dpi, e sono rimasti relativamente stabili fino alla fine del periodo di osservazione. Il confronto dei numeri di PD puncta tra PDLP5 e MP non ha rivelato differenze statisticamente significative nella maggior parte dei momenti di campionamento (Figura 5). Anche il numero di puncta PD colorati con blu anilina è rimasto stabile, anche se è leggermente diminuito a 10 dpi. Il numero di punti PD decorati con blu anilina, PDLP5 o MP era simile tra loro con significatività statistica (Figura 5), coerentemente con la specificità PD di questi marcatori. I numeri di PD puncta per PDCB1 non sono stati analizzati perché, in punti temporali precedenti, il segnale PD era oscurato dal segnale ER e in punti temporali successivi è stato osservato solo in un numero relativamente basso di cellule (vedi Figura 2).

Figura 1: Localizzazione dei plasmodesmi (PD) di TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 espressi transitoriamente in Nicotiana benthamiana e colorazione blu all'anilina del PD. (A) Localizzazione PD di MP-EGFP, PDLP5-EGFP e PDCB1-EGFP e colorazione all'anilina. Il segnale EGFP è in verde, il segnale blu all'anilina è in blu e l'autofluorescenza dei plastidi è in rosso. (B) Co-espressione di MP-EGFP, PDLP5-EGFP e PDCB1-EGFP con il marcatore del reticolo endoplasmatico (ER) marcato con mRFP. Le immagini sono state registrate a 2 giorni dopo l'infiltrazione (dpi) e sono singole sezioni confocali rappresentative di due esperimenti indipendenti (N = 20 immagini da 2 piante). Il segnale EGFP è in verde, il segnale mRFP è in viola e l'autofluorescenza dei plastidi è in rosso. Le frecce gialle indicano che PDCB1 è localizzato al reticolo endoplasmatico. Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Decorso temporale della localizzazione PD di TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 espressi transitoriamente in Nicotiana benthamiana e della colorazione blu anilina del PD. Le immagini sono state registrate a 2 dpi e sono singole sezioni confocali rappresentative di due esperimenti indipendenti (N = 20 immagini da 2 piante per tutti i sistemi, tranne 7 dpi e 10 dpi per PDCB1-EGFP, in cui un minor numero di cellule ha mostrato il segnale). Il segnale EGFP è in verde e il segnale blu all'anilina è in blu. Barre della scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: TVCV MP e PDLP5 mantengono la loro localizzazione PD dopo la co-espressione con un TMV MP che localizza PD e la coina con blu anilina. Le immagini sono state registrate a 2 dpi e sono singole sezioni confocali rappresentative di N ≥ 10 immagini da 4-6 piante. Il segnale EGFP è in verde, il segnale CFP e il segnale blu all'anilina sono in blu e l'autofluorescenza dei plastidi è in rosso. Barre della scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Decorso temporale dell'intensità di fluorescenza di TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 espressa transitoriamente in Nicotiana benthamiana e colorazione PD con blu di anilina. I dati quantitativi sono stati raccolti dagli esperimenti descritti nella Figura 2. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media da più esperimenti. I singoli punti dati sono indicati come media per ogni misurazione. Le differenze tra i valori medi valutati mediante ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey sono statisticamente significative per i valori P. *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, non statisticamente significativo. Barre blu, colorazione all'anilina; barre verde chiaro, MP-EGFP, barre verde scuro, PDLP5-EGFP; barre gialle, PDCB1-EGFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Decorso temporale della formazione dei punti PD da parte di TVCV, MP e PDLP5 espressi transitoriamente in Nicotiana benthamiana e mediante colorazione blu all'anilina del PD. I dati quantitativi sono stati raccolti dagli esperimenti descritti nella Figura 2. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media da più esperimenti. I singoli punti dati sono indicati come media per ogni misurazione. Le differenze tra i valori medi valutati mediante ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Tukey sono statisticamente significative per i valori P. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Barre blu, colorazione all'anilina; barre verde chiaro, MP-EGFP, barre verde scuro, PDLP5-EGFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Esperimento I
	Totale celle	Cellule con localizzazione PD	Celle con segnale misto	Cellule con localizzazione PD (%)
Blu anilina	40	40	4	100
MP-EGFP	40	40	4	100
PDCB1-EGFP	40	3	38	7.5
PDLP5-EGFP	40	40	0	100
	Esperimento II
	Totale celle	Cellule con localizzazione PD	Celle con segnale misto	Cellule con localizzazione PD (%)
Blu anilina	40	40	8	100
MP-EGFP	40	39	8	97.5
PDCB1-EGFP	40	12	31	30
PDLP5-EGFP	40	39	2	97.5

Tabella 1: Efficienza della localizzazione PD.

Figura 1 supplementare: Localizzazione PD di TVCV MP, PDLP5 e PDCB1 espressi transitoriamente in Nicotiana benthamiana. Le immagini sono state registrate a 5 dpi (A), 7 dpi (B) e 10 dpi (C). Il segnale EGFP è verde e l'autofluorescenza del plastide è rossa. Barre di scala = 20 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Qualsiasi studio di biologia cellulare sulla comunicazione intercellulare delle piante e sul trasporto da cellula a cellula durante il normale sviluppo e morfogenesi delle piante, così come durante le interazioni pianta-patogeno, richiede l'individuazione e il monitoraggio dello smistamento delle proteine, sia endogene che codificate per i patogeni, nelle connessioni intercellulari delle piante, i plasmodesmi (PD). Questi esperimenti sarebbero sostanzialmente facilitati dall'uso di proteine di riferimento, sia endogene che derivate da patogeni, che si localizzano fedelmente e costantemente in PD, decorando e visualizzando queste strutture. Questa esigenza è qui affrontata selezionando tre proteine note che localizzano la PD: Arabidopsis PDLP5 e PDCB1, e MP dal patogeno tobamovirale TVCV. Queste proteine sono state marcate ai loro C-terminali con il reporter autofluorescente EGFP, e la capacità delle proteine di fusione risultanti di squalificarsi in PD è stata determinata in seguito alla loro espressione transitoria nelle foglie di Nicotiana benthamiana e alle analisi al microscopio confocale dei tessuti esprimenti. Per la visualizzazione generale della PD in questi tessuti, è stato utilizzato il metodo standard di colorazione con blu all'anilina.

Si ritiene che le MP virali delle piante rientrino in due gruppi principali per quanto riguarda i loro effetti sulla struttura e sull'integrità della PD: le MP che aumentano la permeabilità della PD in modo reversibile e senza alcuna alterazione strutturale nella PD e le MP che bloccano la PD modificando la loro struttura. I MP di tobamovirus, come TVCV, appartengono al primo gruppo di MP, posizionandoli come marcatori attraenti del PD per studi di localizzazione subcellulare^27,28.

Questi esperimenti hanno posizionato PDLP5-EGFP e MP-EGFP come marcatori biologici affidabili e riproducibili del PD, con un'efficienza di rilevamento del PD paragonabile a quella del colorante blu anilina. La localizzazione PD di PDLP5-EGFP e MP-EGFP è stata rilevata durante l'intero periodo di osservazione di 10 dpi, con il tempo ottimale per osservare il caratteristico pattern di localizzazione PD compreso tra 2 dpi e 3 dpi. Sebbene l'espressione del promotore 35S possa provocare un silenziamento post-trascrizionale del gene espresso, questo si verifica spesso dopo un'espressione prolungata in piante transgeniche trasformate stabilmente. D'altra parte, l'uso di questo forte promotore costitutivo è importante per la facile rilevazione della proteina marcatrice. Se l'espressione della proteina di riferimento diminuisce dopo 7-10 dpi, si dovrebbero utilizzare periodi più brevi, cioè 2-3 dpi. Non sono state rilevate differenze significative nel modello di localizzazione subcellulare complessivo tra PDLP5 e MP, ad eccezione del fatto che MP si è accumulato nel nucleo cellulare oltre al PD. Al contrario, PDCB1 non è raccomandato per l'uso come marcatore PD di per sé a causa della complessità del suo modello di localizzazione subcellulare, che include una sostanziale localizzazione nell'ER.

La facilità di rilevamento del segnale di fluorescenza EGFP dipendeva anche dallo stadio di crescita della pianta; in particolare, in N. benthamiana, il più basso accumulo di segnale EGFP è stato osservato allo stadio¹⁸ dell'infiorescenza.

Questo studio mirava a sviluppare i marcatori di localizzazione della PD massimamente esclusivi per altri compartimenti subcellulari. Pertanto, il loro utilizzo come riferimento per la localizzazione di proteine di interesse con capacità di localizzazione subcellulare aggiuntive dovrebbe essere combinato con l'espressione di altri marcatori subcellulari, come quelli specifici per l'ER, i mitocondri, la membrana plasmatica, ecc. In questo caso, l'inclusione di ulteriori cellule di Agrobacterium per l'espressione di questi marcatori dovrebbe essere presa in considerazione nel calcolo della concentrazione finale delle colture di agroinfiltrazione, cioè OD₆₀₀ delle colture liquide. Ovviamente, la concentrazione cellulare e i tempi di crescita delle piante dovrebbero essere adattati per la massima espressione e il rilevamento del modello di localizzazione della PD in altre specie vegetali.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motore ABT AC 1 fase	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Controllo della contaminazione	CCI
Gateway BP Clonasi II Miscela enzimatica	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonasi II Miscela enzimatica	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	Software GraphPad Inc.
Immagine J	National Institutes of Health e il Laboratorio per la strumentazione ottica e computazionale Microscopio
confocale a scansione laser	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Specie
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà	NUOVO OBS	#M0491S