Articolo metodologico

Spettroscopia ottica correlativa e metodologia di imaging con spettrometria di massa per visualizzare la distribuzione dei farmaci in una sezione di tessuti molli

DOI:

10.3791/67383

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20 giugno 2025

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1Chemical & Biological Sciences Department, National Physical Laboratory, 2Department of Life Sciences, University of Bath, 3Haleon CH SARL, 4School of Chemistry & Chemical Engineering, University of Surrey

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta un metodo per l'imaging correlato di farmaci nei tessuti molli utilizzando la spettroscopia ottica non lineare e l'imaging con spettrometria di massa. La combinazione dell'imaging cutaneo ad alta risoluzione con il rilevamento sensibile dei farmaci offre un approccio prezioso per studiare la distribuzione dei farmaci nella pelle, fondamentale per lo sviluppo di prodotti topici di qualità superiore.

Abstract

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È stata sviluppata una nuova metodologia di imaging correlativo che combina una risoluzione spaziale sub-micron con il rilevamento sensibile di farmaci mediante spettroscopia ottica e spettrometria di massa per visualizzare la distribuzione chimica dopo l'applicazione del farmaco nei tessuti molli. In questo esempio, il metodo è stato testato su tessuto cutaneo asportato dopo l'applicazione topica in vitro di un farmaco antinfiammatorio non steroideo commerciale per 16 ore. Metodi spettroscopici ottici non distruttivi, tra cui lo scattering Raman stimolato, la generazione di seconda armonica e le microscopie a fluorescenza a due fotoni, sono stati impiegati per la prima volta per mappare la struttura e la morfologia della pelle. Successivamente, gli stessi campioni di tessuto cutaneo sono stati analizzati mediante spettrometria di massa di ioni secondari a tempo di volo (ToF-SIMS), che ha consentito una maggiore sensibilità per il rilevamento del diclofenac attraverso gli strati cutanei più esterni: epidermide e derma. Sono stati ideati metodi di registrazione delle immagini per integrare i dati ottici e di spettrometria di massa. Questo approccio combina la visualizzazione ad alta risoluzione della struttura dei tessuti senza marcatura con la rivelazione di sostanze chimiche sensibili e rappresenta uno strumento prezioso per studiare la distribuzione dei farmaci nella pelle e, potenzialmente, in altri tessuti biologici molli.

Introduzione

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Comprendere la velocità, l'estensione e i fattori trainanti della distribuzione degli ingredienti farmaceutici attivi all'interno dei tessuti biologici molli dopo la loro applicazione topica o sistemica è fondamentale per chiarire i meccanismi alla base dell'assorbimento, del metabolismo e della clearance dei farmaci tessuto-specifici (ad esempio, una comprensione più profonda della farmacocinetica dei farmaci). Qui, presentiamo un nuovo metodo di imaging correlativo che integra spettroscopie ottiche non lineari e imaging di spettroscopia di massa per la visualizzazione senza marcatura della struttura tissutale e della distribuzione di farmaci topici all'interno dello stesso campione di tessuto1.

La spettroscopia Raman (RS) è emersa come uno strumento prezioso per mappare la distribuzione dei farmaci all'interno di cellule e tessuti con un'elevata risoluzione spaziale e specificità molecolare2. La RS si basa sulla diffusione anelastica della luce3 da parte di un campione di interesse che consente una caratterizzazione chimica dettagliata attraverso i modi vibrazionali caratteristici delle molecole in esso contenute, senza la necessità di etichette esterne. Tuttavia, i lunghi tempi di acquisizione per produrre immagini ad alta risoluzione possono potenzialmente compromettere l'integrità dei campioni biologici sensibili. Inoltre, quando si sondano gli strati più profondi del tessuto, la dispersione e l'assorbimento della luce da parte del tessuto possono attenuare il segnale Raman, limitandone ulteriormente la sensibilità. La microscopia a diffusione Raman stimolata (SRS) rappresenta un progresso significativo rispetto alla RS convenzionale, sfruttando l'eccitazione laser pulsata e il rilevamento del segnale Raman stimolato4. La microscopia SRS consente l'acquisizione rapida di immagini 2D e 3D con un'elevata risoluzione spaziale e, se eseguita in tandem con la generazione di seconda armonica (SHG) e le microscopie a fluorescenza eccitata da due fotoni (TPEF), può fornire un'immagine completa dei tessuti connettivi, del collagene e dell'elastina 1,5,6,7,8,9 . La microscopia SHG è una tecnica ottica non lineare che si basa sull'interazione della luce con strutture non centrosimmetriche in un campione, generando un segnale a metà della lunghezza d'onda della luce incidente. È particolarmente utile per l'imaging di strutture ordinate come il collagene nei tessuti biologici. La TPEF è un'altra tecnica di microscopia non lineare in cui due fotoni a bassa energia eccitano contemporaneamente un fluoroforo, facendolo emettere fluorescenza. Il TPEF consente l'imaging dei tessuti profondi con fotodanneggiamento ridotto, poiché la luce di eccitazione è nell'intervallo del vicino infrarosso, che penetra più in profondità nei campioni biologici.

L'imaging con spettrometria di massa (MSI) è una potente tecnica analitica che combina le capacità della spettrometria di massa con le informazioni spaziali, consentendo l'identificazione senza marcatura di un'ampia gamma di molecole 10,11,12. La spettrometria di massa di ioni secondari a tempo di volo (ToF-SIMS) funziona bombardando la superficie del campione con ioni primari ad alta energia, causando l'espulsione di ioni secondari dalla superficie. Questi ioni secondari vengono quindi accelerati verso un analizzatore a tempo di volo, dove vengono determinati i loro rapporti massa-carica. Questa analisi consente l'identificazione di frammenti molecolari e variazioni isotopiche con elevata sensibilità e risoluzione. Valide applicazioni di ToF-SIMS sono state dimostrate nella ricerca biologica e farmaceutica per lo studio di sostanze chimiche e biomolecole nelle cellule13, nei tessuti14,15 e negli organi15.

Sia la SRS che la ToF-SIMS sono state utilizzate in modo indipendente per studiare la distribuzione dei farmaci in diversi modelli di pelle. Tuttavia, è più utile utilizzare queste tecniche in combinazione per beneficiare della loro complementarietà. In questo studio, descriviamo un flusso di lavoro per combinare le microscopie ottiche (SRS, TPEF e SHG) con ToF-SIMS per ottenere immagini della morfologia cutanea con risoluzione spaziale sub-micron (fornita dai metodi ottici) sovrapposte al segnale del farmaco rilevato con sensibilità superiore (fornito dal ToF-SIMS). L'approccio è stato utilizzato per affrontare l'esempio impegnativo della visualizzazione della distribuzione di diclofenac nei tessuti cutanei asportati trattati con una formulazione topica commerciale (gel di Voltaren). I criteri per il successo includevano un'elevata sensibilità chimica per rilevare il diclofenac alla sua concentrazione terapeutica e una risoluzione spaziale sufficiente per risolvere la struttura della pelle. Sebbene il contenuto di diclofenac nei diversi strati cutanei possa essere quantificato dopo il trattamento topico attraverso metodi laboriosi e tecnicamente impegnativi come lo stripping del nastro seguito dalla quantificazione16, o tramite microperfusione a flusso aperto17, questi approcci non possono chiarire la partizione, la penetrazione, la ritenzione e la distribuzione della profondità del diclofenac eccipiente-dipendente nei singoli strati cutanei, che sono fattori essenziali che aiutano la fase di sviluppo del prodotto.

Prima della metodologia di misurazione descritta di seguito, il gel Voltaren Forte (contenente il 2,32% di diclofenac dietilammonio) o un gel placebo corrispondente (fornito da Haleon CH SARL) è stato applicato sulla superficie della pelle per periodi diversi (4, 12, 16 o 24 ore). Dopo la rimozione di qualsiasi formulazione residua, sono state eseguite misure SRS e ToF-SIMS sugli stessi campioni di pelle; I dettagli completi della metodologia sono descritti nel manoscritto originale1.

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Protocollo

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Dichiarazione etica: I campioni di pelle umana sono stati ottenuti da Tissue Solutions Ltd, Glasgow, Regno Unito, da Charles River Laboratories (CRL) a Edimburgo, Regno Unito. Tutti i campioni anonimi sono stati acquisiti nel rispetto degli standard legali ed etici del paese di raccolta, con l'approvazione etica e il consenso informato dei donatori o dei loro parenti più stretti.

1. Sezionamento della pelle

Un criostato è stato utilizzato per produrre sezioni dei tessuti cutanei.

  1. Trasportare i dischi cutanei trattati fuori dal congelatore a -20 °C e tagliare un pezzettino (~1,0 cm x 1,0 cm) dal centro del disco.
  2. Montare il campione sul mandrino nel criostato su una goccia d'acqua congelata. Non utilizzare composti per la temperatura di taglio ottimale (OCT) o altri mezzi di inclusione.
  3. Impostare la temperatura della lama e del campione rispettivamente a - 20 °C e - 16 °C.
  4. Sezione di 30 μm di spessore su un vetrino coprioggetti (#1.5, Fisher Scientific).
  5. Eseguire immediatamente SRS e ToF-SIMS o, in alternativa, il campione può essere confezionato sottovuoto per la conservazione a -80 °C.
  6. Essiccare per 20 minuti prima dell'uso.

2. Imaging SRS

La microscopia SRS, SHG e TPEF è stata eseguita utilizzando un microscopio Raman coerente. Due impulsi laser a picosecondi sono stati generati da un fascio di Stokes da 1031,2 nm, sovrapposti spazialmente e temporalmente con un fascio di pompa sintonizzabile. Il fascio di Stokes, modulato a 20 MHz, ha facilitato la rilevazione dei segnali di perdita Raman stimolati tramite trasmissione. Per il rilevamento del segnale è stato utilizzato un rivelatore a base di silicio, accoppiato con un amplificatore lock-in. Un altro canale è stato impiegato per raccogliere la seconda armonica e i segnali di fluorescenza emessi, impiegando un tubo fotomoltiplicatore per la rilevazione.

  1. Installare obiettivi e lenti a condensatore adatti per l'imaging di tessuti multifotonici, in questo caso una lente con ingrandimento 40x a immersione in acqua (1,1 NA) in combinazione con una lente a condensatore d'aria a breve distanza di lavoro (0,9 NA).
  2. Posizionare la sezione di tessuto montata sul tavolino del campione del microscopio SRS in modo che il tessuto si trovi sulla stessa faccia del vetrino del microscopio della lente del condensatore. Focalizzare la lente dell'obiettivo sulla sezione di tessuto, quindi ottimizzare l'altezza del condensatore.
  3. Impostare la potenza del laser su valori appropriati per ottenere un buon rapporto segnale/rumore senza danneggiare il tessuto. In questo esempio, circa 10 mW per il fascio della pompa e 30 mW per il fascio di Stokes sono stati applicati al campione. Fare riferimento a Tsikritsis et al per considerazioni pratiche per le misurazioni SRS4.
  4. Acquisisci un'immagine a mosaico dell'intera sezione con risoluzione di 512 x 512 pixel corrispondente a 290 μm x 290 μm con zoom X1 con una velocità di imaging di 400 Hz e una media di linea di 1 a 2850 cm-1 corrispondente allo stretching CH2 .
  5. All'interno dell'immagine a mosaico dell'intera sezione, scegliere una regione di interesse (ROI) con le seguenti considerazioni: (i) è posizionata al centro, evitando il 20% più esterno del perimetro del campione dove potrebbe esserci pelle non dosata che è stata bloccata nell'apparato cellulare di Franz; ii) è sufficientemente piatto per essere esaminato con lo stesso livello di profondità ottica; iii) ha caratteristiche strutturali distinte che ne faciliterebbero l'identificazione visiva quando il campione viene trasferito al ToF-SIMS.
  6. Applicare impostazioni di guadagno coerenti in tutto lo studio per rivelatori SRS e SHG/fluorescenza e acquisire immagini in (i) la regione di stretching C-H (a 2945 cm-1, 2850 cm-1 e 2650 cm-1 corrispondenti rispettivamente a CH3, CH2 e controllo fuori risonanza); ii) la regione delle impronte digitali (a 1666 cm-1 e 1723 cm-1 , corrispondenti rispettivamente all'ammide I e al controllo fuori risonanza); (iii) il numero d'onda corrispondente alla risonanza on e off relativa al farmaco applicato; in questo esempio, a 1586 cm-1 e 1530 cm-1 corrispondenti rispettivamente a C=C e off-risonanza.

Dopo l'imaging SRS, trasferire immediatamente il campione nella configurazione ToF-SIMS per l'analisi.

3. Imaging ToF-SIMS

L'imaging con spettrometria di massa di ioni secondari a tempo di volo è stato eseguito utilizzando un fascio di ioni primari Bi3+ da 30 keV con una corrente di 0,2 pA.

  1. Scegliere le impostazioni di acquisizione appropriate; In questo esempio, è stata utilizzata la polarità ionica negativa, con un tempo di ciclo di lavoro di 100 ms, un intervallo di massa di m/z 0-900 e un diametro del fascio di 5 μm. Per la compensazione della carica è stata utilizzata una pistola a flood di elettroni da 20 eV a 5 μA.
  2. Acquisisci un'immagine complessiva tramite la modalità raster macro del tavolino per mappare l'intera sezione di tessuto con un campo visivo che dipende dalle dimensioni del tessuto (nel nostro caso abbiamo utilizzato da 2,5 a 3,0 mm x da 8,5 a 9,0 mm). Questa immagine complessiva è formata da un mosaico di immagini più piccole. In questo esempio, ciascuno aveva un campo visivo di 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 pixel) con 1 fascio ionico sparato per pixel, risultando in una dose di ioni di 8,18 x 108 ioni/cm2.
  3. Utilizzare lo stesso metodo per acquisire immagini del ROI selezionando un campo visivo appropriato; In questo caso, era di 1,0 mm x 0,5 mm, con 4 scatti per pixel per fotogramma e 10 fotogrammi per patch, corrispondenti a una dose di ioni di 1,31 x 1011 ioni/cm2.
  4. Per garantire il controllo di qualità, analizzare i campioni di omogeneizzato tissutale immediatamente prima e dopo l'esame di ogni sezione cutanea. Utilizza un campo visivo di 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 pixel) con 1 scatto per pixel e 1 fotogramma per scansione, per un totale di 15 scansioni. Questa configurazione corrisponde a una densità di dose ionica di 3,27 x 1010 ioni/cm2.
  5. Dopo l'acquisizione, gli spettri di massa risultanti possono essere calibrati utilizzando ioni H−, C−, C2− e C3−.
  6. L'acquisizione e l'estrazione dei dati sono state eseguite utilizzando il software Surface Lab 7.1.

4. Registrazione delle immagini e analisi dei dati con MATLAB

  1. Riduci le immagini SIMS e SRS a 3 dimensioni, ciascuna utilizzando la fattorizzazione della matrice non negativa, per visualizzarle come canali di colore rosso, verde e blu.
  2. Scegli le funzioni corrispondenti tra queste due immagini di fattorizzazione non matriciali selezionando lo strumento di selezione dei punti di controllo Matlab "cpselect" (Matlab, Mathworks, 2019b e Image Processing Toolbox).
  3. Utilizzare le funzioni "cp2tform" e "imtransform" per eseguire la registrazione, applicando una trasformazione affine con i dati SIMS come immagini fisse e i dati di spettroscopia ottica come immagini in movimento.
  4. Se nei dati ToF-SIMS vengono rilevati più picchi per il farmaco di interesse, sommare le intensità di questi picchi per creare un'intensità combinata di ioni farmaco.
  5. Estrarre la conta ionica totale media dei due set di dati omogeneizzati (prima e dopo) per ciascun campione di tessuto cutaneo corrispondente. Utilizzando questo valore corrispondente, normalizzare le intensità nei dati ToF-SIMS dello ione farmaco in ciascuna immagine della pelle.
  6. Dopo la registrazione, creare una sovrapposizione della spettroscopia ottica e dei dati SIMS assegnando le rispettive immagini ai canali RGB: rosso (immagine SRS per CH2), verde (immagine SHG per collagene) e blu (immagine SIMS per diclofenac, inclusi i segnali di vari ioni a m/z 214.04, 216.04, 250.02, 252.02, 294.01 e 296.01).

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Risultati

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La Figura 1 presenta i risultati della registrazione delle immagini basata sulle caratteristiche, visualizzando le immagini sovrapposte registrate di SRS, SHG e SIMS per due campioni di pelle: uno trattato con un placebo (Figura 1a) e gli altri con gel Voltaren per 4 ore (Figura 1b) e 16 ore (Figura 1c). In questa immagine, il segnale sommato dell'intensità del farmaco (...

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Discussione

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Questo metodo consente l'imaging correlato con spettroscopia ottica non lineare e spettrometria di massa per rilevare la distribuzione del farmaco nei tessuti molli con risoluzione spaziale sub-micron e alta sensibilità. È importante sottolineare che l'imaging si ottiene senza l'uso di etichette potenzialmente interferenti che sarebbero necessarie per le microscopie basate sulla fluorescenza. Un'ulteriore convalida del flusso di lavoro ha comportato la colorazione convenzionale con emato...

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Dichiarazioni

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MBB è un dipendente di Haleon CH SARL, l'istituto di finanziamento dello studio.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato finanziato da Haleon CH SARL. I contributi di NAB e RHG sono stati parzialmente sostenuti dalla Food and Drug Administration (FDA) del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani (HHS) degli Stati Uniti attraverso un premio di assistenza finanziaria (1-U01-FD006533). Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento per le imprese, l'energia e la strategia industriale del Regno Unito attraverso i progetti NMS/ID74 e NMS/ST18 del National Measurement System del Regno Unito. I contenuti di questo articolo sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali, né un'approvazione da parte della FDA/HHS o del governo degli Stati Uniti. NAB è grata per il sostegno della Community for Analytical Measurement Science per il CAMS Fellowship Award 2020 finanziato dall'Analytical Chemistry Trust Fund.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio Raman coerente Leica Microsystemshttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/
Campioni di pelle umana Soluzioni tissutali Ltd, Glasgow
Criostato Leica CM 1850Leica Biosystemshttps://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/Fuori produzione
Sistema laser PicoEmerald-SAPE Berlinhttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
ToF SIMS 5IONToF GmbHhttps://spectral.se/products/tof-sims-5

Riferimenti

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