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Articolo metodologico

Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

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DOI:

10.3791/67385

⸱

18 ottobre 2024

 , 
1Biochemistry Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Okayama University of Science

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo la metodologia per valutare in modo conciso i livelli di LC3-II del marcatore autofagosomico nelle vescicole extracellulari (EV) mediante immunoblotting. L'analisi dei livelli di LC3-II nelle vescicole extracellulari, nella formazione di autolisosomi e nella formazione di omegasomi suggerisce il nuovo ruolo di STX6 nel rilascio di vescicole extracellulari LC3-II positive quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Abstract

La (macro)autofagia rappresenta una fondamentale via di degradazione cellulare. In questo processo, vescicole a doppia membrana note come autofagosomi inghiottono il contenuto citoplasmatico, fondendosi successivamente con i lisosomi per la degradazione. Oltre al ruolo canonico, i geni correlati all'autofagia modulano anche una via secretoria che coinvolge il rilascio di molecole infiammatorie, fattori di riparazione tissutale e vescicole extracellulari (EV). In particolare, il processo di diffusione delle proteine patologiche tra le cellule, in particolare nelle malattie neurodegenerative che colpiscono il cervello e il midollo spinale, sottolinea l'importanza della comprensione di questo fenomeno. Ricerche recenti suggeriscono che la proteina 43 kDa (TDP-43) che lega il DNA di risposta transattiva, un attore chiave nella sclerosi laterale amiotrofica e nella degenerazione lobare frontotemporale, viene rilasciata in modo autofagico-dipendente tramite EV arricchite con il marcatore autofagosomico proteina associata ai microtubuli 1A/1B light chain 3B-II (LC3-II), specialmente quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Per chiarire il meccanismo alla base della formazione e del rilascio di vescicole extracellulari LC3-II-positive, è imperativo stabilire un metodo accessibile e riproducibile per valutare le vescicole LC3-II-positive sia intracellulari che extracellulari. Questo studio presenta un protocollo dettagliato per la valutazione dei livelli di LC3-II tramite immunoblotting nelle frazioni cellulari e EV ottenute attraverso la centrifugazione differenziale. La bafilomicina A1 (Baf), un inibitore della fusione autofagosoma-lisosoma, funge da controllo positivo per aumentare i livelli di vescicole LC3-II positive intracellulari ed extracellulari. Il gene 101 (TSG101) è usato come marcatore per i corpi multivescicolari. Applicando questo protocollo, è dimostrato che il knockdown mediato da siRNA della sintaxina-6 (STX6), un fattore di rischio genetico per la malattia sporadica di Creutzfeldt-Jakob, aumenta i livelli di LC3-II nella frazione EV delle cellule trattate con Baf senza mostrare alcun effetto significativo sui livelli di TSG101. Questi risultati suggeriscono che STX6 può regolare negativamente il rilascio extracellulare di LC3-II attraverso le vescicole extracellulari, in particolare in condizioni in cui la fusione autofagosoma-lisosoma è compromessa. In combinazione con metodi consolidati per la valutazione dell'autofagia, questo protocollo fornisce preziose informazioni sul ruolo di molecole specifiche nella formazione e nel rilascio di EV LC3-II-positive.

Introduzione

La proteina 43 legante il DNA (TDP-43) è una ribonucleoproteina nucleare eterogenea ampiamente espressa coinvolta nella regolazione dello splicing dell'esone, della trascrizione genica e della stabilità dell'mRNA, tutti vitali per la sopravvivenza cellulare 1,2. In condizioni neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la degenerazione lobare frontotemporale (FTLD), una proteina nucleare TDP-43 si accumula in modo anomalo nel citoplasma. Questo spostamento si traduce in una perdita della funzione di TDP-43 nel nucleo e in un guadagno di funzione tossico nel citoplasma. L'accumulo patologico di TDP-43 inizia in regioni specifiche del cervello e del midollo spinale, diffondendosi attraverso queste aree in modo simile a quello dei prioni, un processo strettamente associato alla progressione della malattia3. Tuttavia, l'esatto meccanismo con cui la patologia TDP-43 si diffonde attraverso il cervello e il midollo spinale rimane sconosciuto.

La TDP-43 viene secreta attraverso le vescicole extracellulari (EV) e livelli elevati di TDP-43 vengono rilevati nel plasma e nel liquido cerebrospinale (CSF) dei pazienti affetti da SLA e FTLD-TDP 4,5,6. Il liquido cerebrospinale di pazienti con diagnosi di SLA e FTLD induce un'errata localizzazione intracellulare e l'aggregazione di TDP-43 endogeno nelle cellule di glioma umano7. Pertanto, la TDP-43 rilasciata extracellulare tramite vescicole extracellulari può mediare la diffusione da cellula a cellula della patologia TDP-43.

L'autofagia è un meccanismo di degradazione cellulare ben conservato che coinvolge l'incapsulamento di sostanze indesiderate all'interno di vescicole a doppia membrana, note come autofagosomi, che sono marcate da LC3. Questi autofagosomi si fondono con i lisosomi positivi alla proteina di membrana 1 (LAMP1) per formare autolisosomi (LC3+/LAMP1+), portando alla degradazione del loro contenuto8. Le analisi istologiche indicano che gli autofagosomi che inghiottono le inclusioni si accumulano nei neuroni dei pazienti sporadici affetti da SLA9. Alcuni geni causali della SLA familiare e dell'FTLD-TDP sono legati alla regolazione dell'autofagia 10,11,12. Questi risultati suggeriscono che l'autofagia è soppressa nei pazienti con SLA e FTLD-TDP.

Lo studio precedente ha indicato che TDP-43 è secreto tramite EV positive per il marcatore autofagosomico LC3-II quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita13. La disregolazione della via autofagia-lisosoma potrebbe causare non solo l'accumulo intracellulare di TDP-43, ma anche il rilascio extracellulare di TDP-43 attraverso le EV14. Tuttavia, non è noto come vengano rilasciate le vescicole extracellulari LC3-II positive e quanto questo sia significativo nella diffusione della patologia TDP-43.

Le vescicole extracellulari sono classificate in vescicole extracellulari di grandi dimensioni (da 100 a 1000 nm di diametro), prodotte dalla gemmazione della superficie cellulare, e vescicole extracellulari piccole (da 50 a 150 nm di diametro), prodotte dalla gemmazione delle membrane endosomiali verso l'interno dell'endosoma (note come esosomi) e dell'apparato di Golgi. Per raccogliere separatamente le vescicole extracellulari grandi e piccole, eseguiamo la centrifugazione sequenziale e raccogliamo i pellet mediante centrifugazione rispettivamente a 20.000 × g e 110.000 × g. La frazione EV P1 (20.000 × g di pellet) è preparata per raccogliere EV di grandi dimensioni, mentre la frazione EV P2 (110.000 × g di pellet) è preparata per raccogliere EV di piccole dimensioni15. La metodologia per valutare i livelli di LC3-II in EV grandi e piccole derivate dalla centrifugazione sequenziale mediante immunoblotting è stabile e riproducibile16. Oltre ad analizzare i livelli di LC3-II nelle vescicole extracellulari, l'analisi della formazione di autolisosomi e omegasomi migliora la comprensione di come la disregolazione dell'autofagia porti al rilascio di vescicole extracellulari LC3-II positive. Qui, il presente studio mostra il ruolo soppressivo della sintaxina 6 (STX6), una proteina SNARE, che promuove il movimento delle vescicole di trasporto verso le membrane bersaglio17, nel rilascio di EV positive per LC3-II quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

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Protocollo

1. Preparazione della cellula, della frazione EV P1 e P2 dal terreno di coltura di cellule HeLa

  1. Preparazione della frazione EV P1 e P2 dal terreno di coltura di cellule HeLa
    1. Giorno 1
      1. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule e seminare 1 × 106 cellule su una piastra di 6 cm contenente un terreno di coltura composto da DMEM ad alto glucosio, 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 h.
    2. Giorno 2 (opzionale)
      1. Preparare una soluzione di siRNA da 20 μM.
      2. Mescolare 100 μl di terreno sierico ridotto e 3 μl di siRNA in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione A.
      3. Miscelare 100 μl di terreno sierico ridotto e 5 μl di reagente di trasfezione in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione B.
      4. Mescolare la soluzione A e la soluzione B, quindi incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti.
      5. Aggiungere la miscela delle soluzioni A e B al terreno utilizzato per la coltura delle cellule HeLa. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 h.
    3. Giorno 3
      1. Lavare le celle con PBS ed esporle a 500 μL di tripsina allo 0,25% e 1 mM di soluzione EDTA a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 5 minuti.
      2. Aggiungere 2,5 mL del terreno di coltura alle cellule e utilizzare una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 200 μL collegato per preparare una sospensione a cellula singola.
      3. Contare le cellule utilizzando un contacellule e seminare 1 × 106 celle su una piastra di 10 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 h.
        NOTA: È necessario preparare almeno 1 × 106 cellule per raccogliere le vescicole extracellulari dal terreno di coltura necessario per l'analisi di immunoblotting.
    4. Giorno 4
      1. Preparare un terreno di coltura (vedere il passaggio 1.1.1.1) contenente un veicolo (DMSO) o 100 nM di Bafilomicina A1 (Baf).
      2. Esporre le cellule al mezzo contenente veicolo o Baf 100 nM e incubarle a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 ore.
    5. Giorno 5
      1. Raccogliere tutto il terreno di coltura dalla piastra da 10 cm, trasferirlo in una provetta da 15 ml e centrifugarlo a 3.000 × g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari.
        NOTA: Le celle rimanenti nella piastra da 10 cm verranno utilizzate nella sezione 1.2.1.
      2. Per l'isolamento della frazione P1 EV, trasferire il surnatante dopo la centrifugazione a 3.000 × g in una provetta da centrifugazione, quindi centrifugarlo a 20.000 × g a 4 °C per 1 ora.
      3. Per l'isolamento della frazione P2 EV, trasferire il surnatante dopo la centrifugazione a 20.000 × g in una provetta per ultracentrifuga, quindi centrifugarlo a 110.000 × g a 4 °C per 1 ora.
      4. Dopo aver rimosso l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio, risospendere i pellet rimanenti nella provetta da centrifugazione in 50 μl di tampone campione 2x [2,5% SDS, 125mM Tris-HCl tampone (pH 6,8), 30% glicerolo, 10% 2-mercaptoetanolo, 0,4% blu bromofenolo] per preparare la frazione P1 EV.
      5. Rimuovere il surnatante mediante decantazione, rimuovere l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio, quindi risospendere i pellet rimanenti nella provetta di ultracentrifugazione in 50 μl di tampone campione 2x per preparare la frazione P2 EV.
      6. Incubare le frazioni EV P1 e P2 a 100 °C su un blocco termico per 10 minuti.
        NOTA: Non agitare le provette dopo la centrifugazione a 20.000 × g e 110.000 × g per evitare di scartare accidentalmente i pellet rimanenti. Dopo aver inclinato il tubo per trasferire il surnatante, mantenere la posizione del tubo per evitare che il pellet venga nuovamente immerso nel surnatante rimanente.
  2. Preparazione della frazione cellulare da cellule HeLa in coltura
    1. Giorno 5
      1. Dopo aver trasferito il terreno di coltura dalla piastra da 10 cm in una provetta da 15 mL, lavare le cellule nella piastra da 10 cm con PBS ed esporle a 2 mL di tripsina allo 0,25% e 1 mM di soluzione EDTA a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 5 min.
      2. Aggiungere 8 mL di terreno di crescita alle cellule, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 200 μL per pipettare le cellule e preparare una sospensione a cellula singola.
      3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugarla a 1.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
      4. Rimuovere il surnatante con un aspiratore, aggiungere PBS al pellet della cella e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
      5. Rimuovere il PBS utilizzando un aspiratore e sonicare il pellet cellulare in 1 mL di tampone A68 [10 mM di tampone Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 mM di glicole etilenico bis(β-amminoetil etere)-N,N,N,N-tetraacetico (EGTA)] contenente l'1% di sarkosil.
      6. Misurare la concentrazione proteica del lisato cellulare utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine BCA.
      7. Miscelare 300 μl di lisato cellulare con 100 μl di tampone campione 4x e incubare la miscela a 100 °C su un blocco termico per 10 minuti per preparare la frazione cellulare.

2. Analisi di immunoblotting

  1. Separare le quantità equivalenti di proteine nei campioni mediante SDS-PAGE18.
  2. Trasferire le proteine separate su membrane di polivinilidene difluoruro (PVDF).
  3. Dopo il trasferimento, bloccare le membrane con l'agente bloccante per 20 minuti.
  4. Incubare la membrana ostruita per una notte con l'anticorpo primario indicato nel tampone Tris contenente il 10% (v/v) di siero di vitello a RT.
  5. Lavare la membrana con tampone Tris per 5 s e poi incubarla con un anticorpo secondario coniugato con biotina a RT per 2 ore.
  6. Lavare la membrana con tampone Tris per 5 s e poi incubarla con tampone Tris contenente le soluzioni A allo 0,4% (v/v) e la soluzione B del kit a RT per 1 h.
  7. Lavare la membrana con PBS, quindi incubarla con PBS contenente lo 0,04% (p/v) di diaminobenzidina, lo 0,8% (p/v) di NiCl2·6H2O e lo 0,3% (v/v) di H2O2 per il rilevamento colorimetrico delle bande.
    NOTA: Per il rilevamento dei segnali, è accettabile anche un metodo di chemiluminescenza.
  8. Digitalizzare l'immagine della membrana con uno scanner e sottoporla ad analisi densitometrica utilizzando Fiji.
    1. Apri l'immagine digitalizzata utilizzando Fiji e converti l'immagine a colori RGB in un'immagine a 8 bit facendo clic su Immagine | Tipologia | 8 bit.
    2. Fare clic sullo strumento rettangolo e regolare le dimensioni del rettangolo trascinandolo per circondare le bande. Identificare la banda da analizzare facendo clic su Analizza | Gel | Selezionare Prima corsia.
    3. Posizionare il rettangolo sulla seconda banda e sulle successive e identificare le bande per l'analisi facendo clic su Analizza | Gel | Seleziona Corsia successiva.
    4. Dopo aver riconosciuto la banda finale, misurare la densitometria attraverso il rettangolo facendo clic su Analizza | Gel | Trame Lanes.
    5. Circondare l'area del segnale della banda con una linea retta, fare clic sullo strumento bacchetta e fare clic nell'area per calcolare l'intensità del segnale della banda.

3. Analisi del numero di autofagosomi e autolisosomi

  1. Giorno 1
    1. Contare il numero di cellule HeLa utilizzando un contatore di cellule e seminare 1 × 105 cellule HeLa che esprimono LAMP1-GFP e mCherry-LC3 su un piatto di 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 h.
  2. Giorno 2 (opzionale)
    1. Eseguire i passaggi descritti nella sezione 1.1.2 in piatti da 3,5 cm.
  3. Giorno 3
    1. Scartare il terreno di coltura dai piatti da 3,5 cm.
    2. Lavare le celle con PBS, esporle a 400 μL di tripsina allo 0,25% e 1 mM di soluzione EDTA e incubare a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 5 minuti.
    3. Aggiungere 1,6 ml di terreno di coltura alle cellule e pipettarle con una pipetta di trasferimento Pasteur per preparare una sospensione di una singola cellula.
    4. Conta il numero di cellule usando il contacellule e semina 1 × 104 celle su un vetrino coprioggetti a 8 camere. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 h.
      NOTA: Due pozzetti del vetrino coprioggetti camerato sono preparati rispettivamente per il controllo e per le celle di abbattimento STX6, dopo il trattamento DMSO o Baf come descritto nella sezione 3.4.2.
  4. Giorno 4
    1. Preparare il terreno di coltura senza rosso fenolo (DMEM senza rosso fenolo, 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina), contenente un mezzo disperdente (DMSO) o 100 nM di Baf disciolto in DMSO.
    2. Sostituire il terreno di coltura con un terreno privo di rosso fenolo, contenente veicolo o Baf 100 nM, e incubare per 4 ore.
      NOTA: Per valutare l'effetto di Baf sul numero di autofagosomi e autolisosomi, preparare cellule trattate con veicolo come controlli.
    3. Colorare i nuclei con 0,33 μg/mL di Hoechst 33342 per 30 minuti prima dell'osservazione.
    4. Esegui l'imaging di cellule vive utilizzando un obiettivo 60x su un microscopio laser confocale e acquisisci dieci fotogrammi diversi.
      1. Apri l'immagine unita RGB nelle Fiji e dividila nei rispettivi componenti dell'immagine rosso, verde e blu facendo clic su Immagine | Colore | Canali divisi.
      2. Impostare una soglia costante per i segnali rosso e verde in ogni immagine facendo clic su Immagine | Regola | Soglia per ogni esperimento.
      3. Conta il numero di aree positive per i segnali rossi o verdi facendo clic su Analizza | Analizza le particelle. Selezionare la casella Riepiloga , quindi fare clic su OK. Registrare i valori del conteggio per identificare le vescicole associate all'autofagosoma e al lisosoma.
      4. Per sovrapporre l'immagine verde all'immagine rossa, impostare la modalità di trasferimento su AND facendo clic su Modifica | Controllo Incolla. Copia l'immagine verde e poi incollala sull'immagine rossa per unirle, evidenziando le aree positive sia per i segnali rossi che per quelli verdi.
      5. Per identificare i numeri degli autolisosomi, contare il numero di aree positive per i segnali rossi e verdi facendo clic su Analizza | Analizza le particelle. Selezionare la casella Riepiloga , fare clic su OK e registrare i valori nella sezione Conteggio per identificare le vescicole associate agli autofagosomi e ai lisosomi.
    5. Dividi il numero totale di autolisosomi e autofagosomi per il numero totale di cellule per calcolare il numero di autolisosomi e autofagosomi per cellula.
      NOTA: Contare almeno 35 cellule in ciascuno dei tre esperimenti indipendenti.

4. Analisi per la formazione di omegasomi

  1. Giorno 1
    1. Contare il numero di cellule HeLa utilizzando un contacellule e seminare 1 × 105 cellule su un piatto di 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 h.
  2. Giorno 2 (opzionale)
    1. Eseguire i passaggi descritti nella sezione 1.1.2.
  3. Giorno 3
    1. Preparare una sospensione a cellula singola come descritto nei passaggi 3.3.1-3.3.2.
    2. Contare le cellule utilizzando il contacellule e seminare 1 × 105 celle su un piatto di 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 h.
  4. Giorno 4
    1. Mescolare 1 μg di pEGFP-C1-hAtg13, 3 μl di reagente di trasfezione del DNA e 100 μl di terreno sierico ridotto in una provetta a bassa ritenzione. Incubare la miscela per 20 minuti, quindi aggiungerla al terreno di coltura.
    2. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 h.
  5. Giorno 5
    1. Tripsinizzare le cellule come descritto nei passaggi 3.3.1-3.3.2.
    2. Aggiungere 2,5 mL di terreno di coltura alle cellule. Pipettare la miscela utilizzando una pipetta di trasferimento Pasteur per preparare una sospensione unicellulare.
    3. Contare le cellule utilizzando il contacellule e seminare 1 × 104 celle su un vetrino coprioggetti a 8 camere. Incubare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e umidità controllata per 24 h.
  6. Giorno 6
    1. Seguire i passaggi 3.4.1-3.4.4 per eseguire l'imaging di cellule vive delle cellule dal passaggio 4.5.3 utilizzando un microscopio laser confocale. Cattura dieci diversi fotogrammi di immagini.
      1. Seguire i passaggi 3.4.4.1-3.4.4.3 per dividere le immagini unite RGB nei rispettivi componenti dell'immagine rosso, verde e blu, impostare una soglia costante per i segnali verdi in ciascuna immagine e determinare l'intensità del segnale GFP. Registrare i valori dalla sezione Area totale per determinare l'intensità del segnale di GFP-ATG13.
      2. Dividi l'intensità totale del segnale per il numero di celle esaminate per calcolare l'intensità del segnale per cella.
        NOTA: Contare almeno 34 cellule in ciascuno dei tre esperimenti indipendenti.

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Risultati

Come mostrato in studi precedenti, il trattamento con Baf ha aumentato i livelli di TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR19) e LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR19) nella frazione ricca di EV. In particolare, il trattamento con Baf ha anche aumentato i livelli di STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR19) nel...

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Discussione

Lo studio di immunoblotting ha rivelato i livelli di LC3-II e TSG101 nella frazione cellulare, nella frazione EV P1 ricca di microvescicole e nella frazione EV P2 ricca di esosomi. L'imaging su cellule vive è stato utilizzato per esaminare autofagosomi, autolisosomi e omegasomi, fornendo informazioni sul fatto che il knockdown di STX6 influenzi l'autofagia. Questi risultati combinati suggeriscono che il knockdown di STX6 influisce sul rilascio di EV LC3-II positive, pot...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con i contenuti di questo articolo.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento a Y.T. dalla Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI [Grant Number 23K06837] (Tokyo, Giappone) e dalla Takeda Science Foundation (Osaka, Giappone). Gli autori apprezzano il Dr. David C. Rubinsztein (Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge, Regno Unito) per la fornitura di cellule HeLa.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25 % Tripsina EDTAFujifilm Wako201-16945
Piatto da 10 cmThermo Fisher Scientific150464
Tubo da 15 mlThermo Fisher Scientific339650
200 μ L Pipetta TipNippon GeneticsFG-301pipettaggio
2-MercaptoetanoloNacalai Tesque21417-52un materiale per
soluzione tampone campione
3,3'-Diaminobenzidina TetracloridratoNacalai Tesque11009-41un materiale per soluzione DAB
3,5 cm Piatto Thermo Fisher Scientific150460
Piatto da 6 cm TrueLineTR4001
Bagni termostatici a blocchi di alluminio (termobagni a secco)EYELA273860
AspiratoreSANSYOSAP-102soluzione di inalazione
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Bafilomicina A1AdipogenBVT-0252
coniugata con biotina Anticorpo IgG di coniglio Laboratori BA-10002° anticorpo per immunoblotting
anticorpi IgG di cavallo coniugati con biotina BA-20002° anticorpo per l'immunoblotting
Blocking OneNacalai Tesque03953-95un materiale per l'immunoblotting
Bromophenol BlueNacalai Tesque05808-61un materiale per
soluzione tampone del campione
Siero di vitellocytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220Scanner
Centrifuga 5702 Reppendolf5703000039
Vetrini di conteggio Doppia cameraBio-Rad1450015JConteggio cellulare
Sonificatore digitale 450BRANSON
Dimethyl Sulfoxidenacalai tasque09659-14veicolo
DMEM Alto glucosioNacalai Tesque08458-45terreno di coltura
DMEM senza fenolo rossoNacalai Tesque08489-45terreno di coltura
EGTADojindo 348-01311un materiale per la soluzione A68
ExcelMicrosoftversione 16.16.27analisi satistica
EZRNumero di riferimento 24versione 1.68analisi satistica
FBSSigma173012Terreno di coltura
FijiNIHStrumento di analisi delle immagini
GlycerolNacalai Tesque09886-05un materiale per
soluzione tampone campione
Hoehst33342Dojindo H342
Perossido di idrogenoFujifilm Wako080-0186un materiale per la soluzione DAB
Kimwipe S-200NIPPON PAPER CRECIA62011salvietta detergente
Tubo a bassa ritenzioneNippon GeneticsFG-MCT015CLBsiRNA e trasfezione del DNA
LSM780 Microscopio laser confocaleCarl Zeiss
Monoclonale Mouse Anti-LC3 AnticorpoMBLM186-31° anticorpo per immunoblotting
Cloruro di nichel (II) esaidratoFujifilm Wako149-01041un materiale per soluzione DAB
N-Lauroilsarcosina Sale di sodioNacalai Tesque20117-12
Optima XE-90 UltracentrifugaBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Siero ridotto Medium ThermoFisher Scientific31985-070siRNA e trasfezione del DNA
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
Penicillina/StreptomicinaNacalai Tesque26253-84Terreno di coltura
Kit di analisi delle proteine BCA PierceThermo Fisher Scientific23225
Anticorpo anti-PCNA di coniglio policlonaleBioAcademia70-0801° anticorpo per immunoblotting
policlonale di coniglio anti-sintassina 6ProteinTech10841-1-AP1° anticorpo per immunoblotting
Anticorpo policlonale di coniglio anti-TSG101 ProteinTech28283-1-AP1° anticorpo per immunoblotting
Anticorpo policlonale di coniglio anti-ULK1ProteinTech20986-1-AP1° anticorpo per immunoblotting
Polivinilidene difluoruro MembranaMillioreIPVH00010un materiale per l'immunoblotting
RR sviluppo core teamversione 4.4.1analisi satistica
RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778siRNA reagente di trasfezione
siRNA STX6Thermo Fisher ScientificHSS115604siRNA per trasfezione
Cloruro di sodioNacalai Tesque31320-05un materiale per tampone Tris
e soluzione A68
Sodium Dodecyl SulfateFujifilm Wako192-13981un materiale per
soluzione tampone campione
SPARK Microplate Reader TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GCThermo Fisher Scientific12935300trasfezione siRNA
SaccarosioFujifilm Wako193-00025un materiale per la soluzione A68
TC20 Contatore di cellule automatizzato con stampante termicaBio-Rad1450109J1conteggio delle cellule
ThermobathTOKYO RIKAKIKAIMG-3100incubazione
TransIT-293Mirus BioMIR 2700Reagente di trasfezione del DNA
TransIT-LT1Mirus BioMIR2300Reagente
di trasfezione del DNATris(idrossimetil)amminometanoNacalai Tesque35406-75un materiale per tampone Tris, tampone per campioni e soluzione A68
Colorante blu di tripano 0,40%Bio-Rad1450021conteggio delle cellule
Tubo aperto ultratrasparente, 16 x 96 mm Beckman Coulter361706raccolta per la frazione P1 EV
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Coulter344059raccolta per la frazione P2 EV
Vectastain ABC Standard KitVector Laboratories PK-4000immunoblotting
bottiglia di lavaggiocome unomembrana di lavaggio 1-4640-02
mu;-Slide 8 pozzo altoibidi80806
CapraLaboratorio di Anticorpo &

Riferimenti

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