Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

Sommario

Qui, presentiamo la metodologia per valutare in modo conciso i livelli di LC3-II del marcatore autofagosomico nelle vescicole extracellulari (EV) mediante immunoblotting. L'analisi dei livelli di LC3-II nelle vescicole extracellulari, nella formazione di autolisosomi e nella formazione di omegasomi suggerisce il nuovo ruolo di STX6 nel rilascio di vescicole extracellulari LC3-II positive quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Abstract

La (macro)autofagia rappresenta una fondamentale via di degradazione cellulare. In questo processo, vescicole a doppia membrana note come autofagosomi inghiottono il contenuto citoplasmatico, fondendosi successivamente con i lisosomi per la degradazione. Oltre al ruolo canonico, i geni correlati all'autofagia modulano anche una via secretoria che coinvolge il rilascio di molecole infiammatorie, fattori di riparazione tissutale e vescicole extracellulari (EV). In particolare, il processo di diffusione delle proteine patologiche tra le cellule, in particolare nelle malattie neurodegenerative che colpiscono il cervello e il midollo spinale, sottolinea l'importanza della comprensione di questo fenomeno. Ricerche recenti suggeriscono che la proteina 43 kDa (TDP-43) che lega il DNA di risposta transattiva, un attore chiave nella sclerosi laterale amiotrofica e nella degenerazione lobare frontotemporale, viene rilasciata in modo autofagico-dipendente tramite EV arricchite con il marcatore autofagosomico proteina associata ai microtubuli 1A/1B light chain 3B-II (LC3-II), specialmente quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Per chiarire il meccanismo alla base della formazione e del rilascio di vescicole extracellulari LC3-II-positive, è imperativo stabilire un metodo accessibile e riproducibile per valutare le vescicole LC3-II-positive sia intracellulari che extracellulari. Questo studio presenta un protocollo dettagliato per la valutazione dei livelli di LC3-II tramite immunoblotting nelle frazioni cellulari e EV ottenute attraverso la centrifugazione differenziale. La bafilomicina A1 (Baf), un inibitore della fusione autofagosoma-lisosoma, funge da controllo positivo per aumentare i livelli di vescicole LC3-II positive intracellulari ed extracellulari. Il gene 101 (TSG101) è usato come marcatore per i corpi multivescicolari. Applicando questo protocollo, è dimostrato che il knockdown mediato da siRNA della sintaxina-6 (STX6), un fattore di rischio genetico per la malattia sporadica di Creutzfeldt-Jakob, aumenta i livelli di LC3-II nella frazione EV delle cellule trattate con Baf senza mostrare alcun effetto significativo sui livelli di TSG101. Questi risultati suggeriscono che STX6 può regolare negativamente il rilascio extracellulare di LC3-II attraverso le vescicole extracellulari, in particolare in condizioni in cui la fusione autofagosoma-lisosoma è compromessa. In combinazione con metodi consolidati per la valutazione dell'autofagia, questo protocollo fornisce preziose informazioni sul ruolo di molecole specifiche nella formazione e nel rilascio di EV LC3-II-positive.

Introduzione

La proteina 43 legante il DNA (TDP-43) è una ribonucleoproteina nucleare eterogenea ampiamente espressa coinvolta nella regolazione dello splicing dell'esone, della trascrizione genica e della stabilità dell'mRNA, tutti vitali per la sopravvivenza cellulare ^1,2. In condizioni neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la degenerazione lobare frontotemporale (FTLD), una proteina nucleare TDP-43 si accumula in modo anomalo nel citoplasma. Questo spostamento si traduce in una perdita della funzione di TDP-43 nel nucleo e in un guadagno di funzione tossico nel citoplasma. L'accumulo patologico di TDP-43 inizia in regioni specifiche del cervello e del midollo spinale, diffondendosi attraverso queste aree in modo simile a quello dei prioni, un processo strettamente associato alla progressione della malattia³. Tuttavia, l'esatto meccanismo con cui la patologia TDP-43 si diffonde attraverso il cervello e il midollo spinale rimane sconosciuto.

La TDP-43 viene secreta attraverso le vescicole extracellulari (EV) e livelli elevati di TDP-43 vengono rilevati nel plasma e nel liquido cerebrospinale (CSF) dei pazienti affetti da SLA e FTLD-TDP ^4,5,6. Il liquido cerebrospinale di pazienti con diagnosi di SLA e FTLD induce un'errata localizzazione intracellulare e l'aggregazione di TDP-43 endogeno nelle cellule di glioma umano⁷. Pertanto, la TDP-43 rilasciata extracellulare tramite vescicole extracellulari può mediare la diffusione da cellula a cellula della patologia TDP-43.

L'autofagia è un meccanismo di degradazione cellulare ben conservato che coinvolge l'incapsulamento di sostanze indesiderate all'interno di vescicole a doppia membrana, note come autofagosomi, che sono marcate da LC3. Questi autofagosomi si fondono con i lisosomi positivi alla proteina di membrana 1 (LAMP1) per formare autolisosomi (LC3⁺/LAMP1⁺), portando alla degradazione del loro contenuto⁸. Le analisi istologiche indicano che gli autofagosomi che inghiottono le inclusioni si accumulano nei neuroni dei pazienti sporadici affetti da SLA⁹. Alcuni geni causali della SLA familiare e dell'FTLD-TDP sono legati alla regolazione dell'autofagia 10,11,12. Questi risultati suggeriscono che l'autofagia è soppressa nei pazienti con SLA e FTLD-TDP.

Lo studio precedente ha indicato che TDP-43 è secreto tramite EV positive per il marcatore autofagosomico LC3-II quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita¹³. La disregolazione della via autofagia-lisosoma potrebbe causare non solo l'accumulo intracellulare di TDP-43, ma anche il rilascio extracellulare di TDP-43 attraverso le EV¹⁴. Tuttavia, non è noto come vengano rilasciate le vescicole extracellulari LC3-II positive e quanto questo sia significativo nella diffusione della patologia TDP-43.

Le vescicole extracellulari sono classificate in vescicole extracellulari di grandi dimensioni (da 100 a 1000 nm di diametro), prodotte dalla gemmazione della superficie cellulare, e vescicole extracellulari piccole (da 50 a 150 nm di diametro), prodotte dalla gemmazione delle membrane endosomiali verso l'interno dell'endosoma (note come esosomi) e dell'apparato di Golgi. Per raccogliere separatamente le vescicole extracellulari grandi e piccole, eseguiamo la centrifugazione sequenziale e raccogliamo i pellet mediante centrifugazione rispettivamente a 20.000 × g e 110.000 × g. La frazione EV P1 (20.000 × g di pellet) è preparata per raccogliere EV di grandi dimensioni, mentre la frazione EV P2 (110.000 × g di pellet) è preparata per raccogliere EV di piccole dimensioni¹⁵. La metodologia per valutare i livelli di LC3-II in EV grandi e piccole derivate dalla centrifugazione sequenziale mediante immunoblotting è stabile e riproducibile¹⁶. Oltre ad analizzare i livelli di LC3-II nelle vescicole extracellulari, l'analisi della formazione di autolisosomi e omegasomi migliora la comprensione di come la disregolazione dell'autofagia porti al rilascio di vescicole extracellulari LC3-II positive. Qui, il presente studio mostra il ruolo soppressivo della sintaxina 6 (STX6), una proteina SNARE, che promuove il movimento delle vescicole di trasporto verso le membrane bersaglio¹⁷, nel rilascio di EV positive per LC3-II quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Protocollo

1. Preparazione della cellula, della frazione EV P1 e P2 dal terreno di coltura di cellule HeLa

1. Preparazione della frazione EV P1 e P2 dal terreno di coltura di cellule HeLa
   1. Giorno 1
      1. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule e seminare 1 × 10⁶ cellule su una piastra di 6 cm contenente un terreno di coltura composto da DMEM ad alto glucosio, 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
   2. Giorno 2 (opzionale)
      1. Preparare una soluzione di siRNA da 20 μM.
      2. Mescolare 100 μl di terreno sierico ridotto e 3 μl di siRNA in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione A.
      3. Miscelare 100 μl di terreno sierico ridotto e 5 μl di reagente di trasfezione in una provetta a bassa ritenzione per preparare la soluzione B.
      4. Mescolare la soluzione A e la soluzione B, quindi incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti.
      5. Aggiungere la miscela delle soluzioni A e B al terreno utilizzato per la coltura delle cellule HeLa. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
   3. Giorno 3
      1. Lavare le celle con PBS ed esporle a 500 μL di tripsina allo 0,25% e 1 mM di soluzione EDTA a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 5 minuti.
      2. Aggiungere 2,5 mL del terreno di coltura alle cellule e utilizzare una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 200 μL collegato per preparare una sospensione a cellula singola.
      3. Contare le cellule utilizzando un contacellule e seminare 1 × 10⁶ celle su una piastra di 10 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
         NOTA: È necessario preparare almeno 1 × 10⁶ cellule per raccogliere le vescicole extracellulari dal terreno di coltura necessario per l'analisi di immunoblotting.
   4. Giorno 4
      1. Preparare un terreno di coltura (vedere il passaggio 1.1.1.1) contenente un veicolo (DMSO) o 100 nM di Bafilomicina A1 (Baf).
      2. Esporre le cellule al mezzo contenente veicolo o Baf 100 nM e incubarle a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 ore.
   5. Giorno 5
      1. Raccogliere tutto il terreno di coltura dalla piastra da 10 cm, trasferirlo in una provetta da 15 ml e centrifugarlo a 3.000 × g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari.
         NOTA: Le celle rimanenti nella piastra da 10 cm verranno utilizzate nella sezione 1.2.1.
      2. Per l'isolamento della frazione P1 EV, trasferire il surnatante dopo la centrifugazione a 3.000 × g in una provetta da centrifugazione, quindi centrifugarlo a 20.000 × g a 4 °C per 1 ora.
      3. Per l'isolamento della frazione P2 EV, trasferire il surnatante dopo la centrifugazione a 20.000 × g in una provetta per ultracentrifuga, quindi centrifugarlo a 110.000 × g a 4 °C per 1 ora.
      4. Dopo aver rimosso l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio, risospendere i pellet rimanenti nella provetta da centrifugazione in 50 μl di tampone campione 2x [2,5% SDS, 125mM Tris-HCl tampone (pH 6,8), 30% glicerolo, 10% 2-mercaptoetanolo, 0,4% blu bromofenolo] per preparare la frazione P1 EV.
      5. Rimuovere il surnatante mediante decantazione, rimuovere l'umidità in eccesso all'interno della provetta con un panno da laboratorio, quindi risospendere i pellet rimanenti nella provetta di ultracentrifugazione in 50 μl di tampone campione 2x per preparare la frazione P2 EV.
      6. Incubare le frazioni EV P1 e P2 a 100 °C su un blocco termico per 10 minuti.
         NOTA: Non agitare le provette dopo la centrifugazione a 20.000 × g e 110.000 × g per evitare di scartare accidentalmente i pellet rimanenti. Dopo aver inclinato il tubo per trasferire il surnatante, mantenere la posizione del tubo per evitare che il pellet venga nuovamente immerso nel surnatante rimanente.
2. Preparazione della frazione cellulare da cellule HeLa in coltura
   1. Giorno 5
      1. Dopo aver trasferito il terreno di coltura dalla piastra da 10 cm in una provetta da 15 mL, lavare le cellule nella piastra da 10 cm con PBS ed esporle a 2 mL di tripsina allo 0,25% e 1 mM di soluzione EDTA a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 5 min.
      2. Aggiungere 8 mL di terreno di crescita alle cellule, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento Pasteur con un puntale da 200 μL per pipettare le cellule e preparare una sospensione a cellula singola.
      3. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugarla a 1.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
      4. Rimuovere il surnatante con un aspiratore, aggiungere PBS al pellet della cella e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
      5. Rimuovere il PBS utilizzando un aspiratore e sonicare il pellet cellulare in 1 mL di tampone A68 [10 mM di tampone Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 mM di glicole etilenico bis(β-amminoetil etere)-N,N,N,N-tetraacetico (EGTA)] contenente l'1% di sarkosil.
      6. Misurare la concentrazione proteica del lisato cellulare utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine BCA.
      7. Miscelare 300 μl di lisato cellulare con 100 μl di tampone campione 4x e incubare la miscela a 100 °C su un blocco termico per 10 minuti per preparare la frazione cellulare.

2. Analisi di immunoblotting

1. Separare le quantità equivalenti di proteine nei campioni mediante SDS-PAGE¹⁸.
2. Trasferire le proteine separate su membrane di polivinilidene difluoruro (PVDF).
3. Dopo il trasferimento, bloccare le membrane con l'agente bloccante per 20 minuti.
4. Incubare la membrana ostruita per una notte con l'anticorpo primario indicato nel tampone Tris contenente il 10% (v/v) di siero di vitello a RT.
5. Lavare la membrana con tampone Tris per 5 s e poi incubarla con un anticorpo secondario coniugato con biotina a RT per 2 ore.
6. Lavare la membrana con tampone Tris per 5 s e poi incubarla con tampone Tris contenente le soluzioni A allo 0,4% (v/v) e la soluzione B del kit a RT per 1 h.
7. Lavare la membrana con PBS, quindi incubarla con PBS contenente lo 0,04% (p/v) di diaminobenzidina, lo 0,8% (p/v) di NiCl₂·6H₂O e lo 0,3% (v/v) di H₂O₂ per il rilevamento colorimetrico delle bande.
   NOTA: Per il rilevamento dei segnali, è accettabile anche un metodo di chemiluminescenza.
8. Digitalizzare l'immagine della membrana con uno scanner e sottoporla ad analisi densitometrica utilizzando Fiji.
   1. Apri l'immagine digitalizzata utilizzando Fiji e converti l'immagine a colori RGB in un'immagine a 8 bit facendo clic su Immagine | Tipologia | 8 bit.
   2. Fare clic sullo strumento rettangolo e regolare le dimensioni del rettangolo trascinandolo per circondare le bande. Identificare la banda da analizzare facendo clic su Analizza | Gel | Selezionare Prima corsia.
   3. Posizionare il rettangolo sulla seconda banda e sulle successive e identificare le bande per l'analisi facendo clic su Analizza | Gel | Seleziona Corsia successiva.
   4. Dopo aver riconosciuto la banda finale, misurare la densitometria attraverso il rettangolo facendo clic su Analizza | Gel | Trame Lanes.
   5. Circondare l'area del segnale della banda con una linea retta, fare clic sullo strumento bacchetta e fare clic nell'area per calcolare l'intensità del segnale della banda.

3. Analisi del numero di autofagosomi e autolisosomi

1. Giorno 1
   1. Contare il numero di cellule HeLa utilizzando un contatore di cellule e seminare 1 × 10⁵ cellule HeLa che esprimono LAMP1-GFP e mCherry-LC3 su un piatto di 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
2. Giorno 2 (opzionale)
   1. Eseguire i passaggi descritti nella sezione 1.1.2 in piatti da 3,5 cm.
3. Giorno 3
   1. Scartare il terreno di coltura dai piatti da 3,5 cm.
   2. Lavare le celle con PBS, esporle a 400 μL di tripsina allo 0,25% e 1 mM di soluzione EDTA e incubare a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 5 minuti.
   3. Aggiungere 1,6 ml di terreno di coltura alle cellule e pipettarle con una pipetta di trasferimento Pasteur per preparare una sospensione di una singola cellula.
   4. Conta il numero di cellule usando il contacellule e semina 1 × 10⁴ celle su un vetrino coprioggetti a 8 camere. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
      NOTA: Due pozzetti del vetrino coprioggetti camerato sono preparati rispettivamente per il controllo e per le celle di abbattimento STX6, dopo il trattamento DMSO o Baf come descritto nella sezione 3.4.2.
4. Giorno 4
   1. Preparare il terreno di coltura senza rosso fenolo (DMEM senza rosso fenolo, 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina), contenente un mezzo disperdente (DMSO) o 100 nM di Baf disciolto in DMSO.
   2. Sostituire il terreno di coltura con un terreno privo di rosso fenolo, contenente veicolo o Baf 100 nM, e incubare per 4 ore.
      NOTA: Per valutare l'effetto di Baf sul numero di autofagosomi e autolisosomi, preparare cellule trattate con veicolo come controlli.
   3. Colorare i nuclei con 0,33 μg/mL di Hoechst 33342 per 30 minuti prima dell'osservazione.
   4. Esegui l'imaging di cellule vive utilizzando un obiettivo 60x su un microscopio laser confocale e acquisisci dieci fotogrammi diversi.
      1. Apri l'immagine unita RGB nelle Fiji e dividila nei rispettivi componenti dell'immagine rosso, verde e blu facendo clic su Immagine | Colore | Canali divisi.
      2. Impostare una soglia costante per i segnali rosso e verde in ogni immagine facendo clic su Immagine | Regola | Soglia per ogni esperimento.
      3. Conta il numero di aree positive per i segnali rossi o verdi facendo clic su Analizza | Analizza le particelle. Selezionare la casella Riepiloga , quindi fare clic su OK. Registrare i valori del conteggio per identificare le vescicole associate all'autofagosoma e al lisosoma.
      4. Per sovrapporre l'immagine verde all'immagine rossa, impostare la modalità di trasferimento su AND facendo clic su Modifica | Controllo Incolla. Copia l'immagine verde e poi incollala sull'immagine rossa per unirle, evidenziando le aree positive sia per i segnali rossi che per quelli verdi.
      5. Per identificare i numeri degli autolisosomi, contare il numero di aree positive per i segnali rossi e verdi facendo clic su Analizza | Analizza le particelle. Selezionare la casella Riepiloga , fare clic su OK e registrare i valori nella sezione Conteggio per identificare le vescicole associate agli autofagosomi e ai lisosomi.
   5. Dividi il numero totale di autolisosomi e autofagosomi per il numero totale di cellule per calcolare il numero di autolisosomi e autofagosomi per cellula.
      NOTA: Contare almeno 35 cellule in ciascuno dei tre esperimenti indipendenti.

4. Analisi per la formazione di omegasomi

1. Giorno 1
   1. Contare il numero di cellule HeLa utilizzando un contacellule e seminare 1 × 10⁵ cellule su un piatto di 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
2. Giorno 2 (opzionale)
   1. Eseguire i passaggi descritti nella sezione 1.1.2.
3. Giorno 3
   1. Preparare una sospensione a cellula singola come descritto nei passaggi 3.3.1-3.3.2.
   2. Contare le cellule utilizzando il contacellule e seminare 1 × 10⁵ celle su un piatto di 3,5 cm. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
4. Giorno 4
   1. Mescolare 1 μg di pEGFP-C1-hAtg13, 3 μl di reagente di trasfezione del DNA e 100 μl di terreno sierico ridotto in una provetta a bassa ritenzione. Incubare la miscela per 20 minuti, quindi aggiungerla al terreno di coltura.
   2. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
5. Giorno 5
   1. Tripsinizzare le cellule come descritto nei passaggi 3.3.1-3.3.2.
   2. Aggiungere 2,5 mL di terreno di coltura alle cellule. Pipettare la miscela utilizzando una pipetta di trasferimento Pasteur per preparare una sospensione unicellulare.
   3. Contare le cellule utilizzando il contacellule e seminare 1 × 10⁴ celle su un vetrino coprioggetti a 8 camere. Incubare le cellule a 37 °C con CO₂ al 5% e umidità controllata per 24 h.
6. Giorno 6
   1. Seguire i passaggi 3.4.1-3.4.4 per eseguire l'imaging di cellule vive delle cellule dal passaggio 4.5.3 utilizzando un microscopio laser confocale. Cattura dieci diversi fotogrammi di immagini.
      1. Seguire i passaggi 3.4.4.1-3.4.4.3 per dividere le immagini unite RGB nei rispettivi componenti dell'immagine rosso, verde e blu, impostare una soglia costante per i segnali verdi in ciascuna immagine e determinare l'intensità del segnale GFP. Registrare i valori dalla sezione Area totale per determinare l'intensità del segnale di GFP-ATG13.
      2. Dividi l'intensità totale del segnale per il numero di celle esaminate per calcolare l'intensità del segnale per cella.
         NOTA: Contare almeno 34 cellule in ciascuno dei tre esperimenti indipendenti.

Risultati

Come mostrato in studi precedenti, il trattamento con Baf ha aumentato i livelli di TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR¹⁹) e LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR¹⁹) nella frazione ricca di EV. In particolare, il trattamento con Baf ha anche aumentato i livelli di STX6 (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR¹⁹) nella frazione EV (Figura 1A), suggerendo che STX6 potrebbe essere un componente delle EV. L'antigene nucleare delle cellule proliferanti (PCNA) non è stato osservato nella frazione EV. L'immunoblotting di STX6 nella frazione cellulare ha rivelato che i livelli di STX6 diminuivano della metà con il suo knockdown del siRNA (Figura 1B). Il knockdown di STX6 non ha influenzato i livelli di TSG101 nelle frazioni cellulari e EV sia in condizioni trattate con veicolo che con Baf (Figura 1C). Tuttavia, il knockdown di STX6 ha aumentato i livelli di LC3-II nella frazione cellulare nella condizione trattata con veicolo, ma non nella condizione trattata con Baf. Il knockdown di STX6 ha anche aumentato i livelli di LC3-II nella frazione EV in condizioni trattate con Baf (Figura 1D). Questi risultati suggeriscono che i metodi utilizzati per rilevare LC3-II nelle vescicole extracellulari mediante immunoblotting sono sufficientemente sensibili, anche se l'efficienza di knockdown non è sostanziale. Inoltre, questi risultati indicano che il knockdown di STX6 aumenta il numero di autofagosomi intracellulari e migliora il rilascio extracellulare di vescicole associate agli autofagosomi durante il trattamento con Baf.

Per indagare ulteriormente se il knockdown di STX6 influenza il numero intracellulare di autofagosomi e autolisosomi, gli autofagosomi e i lisosomi sono stati visualizzati utilizzando il marcatore autofagosomico mCherry-LC3 e il marcatore lisosomiale LAMP1-GFP. L'imaging confocale su cellule vive ha rivelato vescicole GFP- e mCherry-positive nelle cellule HeLa che esprimono LAMP1-GFP e mCherry-LC3 (Figura 2A). Gli autolisosomi sono stati identificati come vescicole GFP- e mCherry-positive, mentre gli autofagosomi sono stati identificati come vescicole GFP-negative e mCherry-positive. Il knockdown di STX6 ha aumentato il numero di autofagosomi e autolisosomi nella condizione trattata con il veicolo (Figura 2B, C). Tuttavia, il knockdown di STX6 non ha influenzato il numero di autofagosomi e autolisosomi nella condizione trattata con Baf (Figura 2B, C).

Per determinare se l'aumento del numero di autofagosomi intracellulari dovuto al knockdown di STX6 derivasse da una maggiore formazione di autofagosomi, la formazione di omegasomi, un processo necessario per la formazione di autofagosomi, è stata esaminata utilizzando l'intensità del segnale GFP-ATG13 del marcatore omegasoma. L'imaging confocale su cellule vive ha fornito un'immagine assemblata di GFP-ATG13, indicando la formazione di omegasomi (Figura 3A). Il knockdown di STX6 ha diminuito l'intensità del segnale GFP-ATG13 (P = 0,023, come determinato dall'ANOVA a due vie in EZR¹⁹). Sebbene il knockdown di STX6 non abbia influenzato in modo significativo l'intensità del segnale GFP-ATG13 nelle condizioni trattate con il veicolo, ha diminuito significativamente il segnale nelle condizioni trattate con Baf (Figura 3B). Collettivamente, questi risultati indicano che il knockdown di STX6 aumenta il rilascio di vescicole LC3-II positive legate all'accumulo di vescicole associate all'autofagosoma.

Figura 1: Risultati dell'immunoblotting delle cellule, delle frazioni P1 e P2 delle cellule HeLa trasfettate con siRNA di controllo o STX6 in trattamento con veicolo o Baf. Le cellule HeLa sono state trattate con veicolo (DMSO) o Baf da 100 nM per 24 ore dopo la trasfezione con siRNA di controllo o STX6 . Sono state isolate le frazioni di celle, P1 (20.000 × g di pellet) e P2 (110.000 × g di pellet). (A) Immagini rappresentative di immunoblotting di ciascuna frazione che mostrano STX6, TSG101, LC3 e PCNA. (B-D) L'analisi densitometrica per (B) STX6, (C) TSG101 e (D) LC3-II è stata eseguita dalle immagini immunoblot. L'intensità del segnale è stata normalizzata per le cellule di controllo o trasfettate con siRNA STX6 trattate con veicolo o Baf. I grafici a barre rappresentano i valori medi ± S.E.M. (N = 3). * indica P < 0,05 con un test t spaiato a due code in Excel. Abbreviazioni: STX6 = sintattica 6; Baf = bafilomicina A1; DMSO = dimetilsolfossido; TSG101 = gene 101 della suscettibilità al tumore; LC3 = proteine associate ai microtubuli 1A/1B catena leggera 3B; PCNA = antigene nucleare delle cellule proliferanti; S.E.M. = errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi dell'immagine confocale di cellule HeLa che co-esprimono Lamp1-GFP e mCherry-LC3 trasfettate con siRNA di controllo o STX6 in condizioni trattate con veicolo e Baf. (A) Le immagini confocali di cellule HeLa che esprimono stabilmente LAMP1-GFP e mCherry-LC3 sono state trasfettate con siRNA di controllo o STX6 per 48 ore, seguite dall'esposizione a DMSO o 400 nM Baf per 4 ore. Barra della scala = 20 μm. (B,C) La dennatificazione degli autofagosomi (B) (punti negativi LAMP1-GFP e mCherry-LC3 positivi) e degli autolisosomi (C) (punti doppi positivi LAMP1-GFP e mCherry-LC3) è stata eseguita utilizzando il software Fiji. I dati nei grafici a barre sono presentati come valori medi ± S.E.M. (N = 3). * indica P < 0,05, in base a un test t non accoppiato a due code in Excel. Abbreviazioni: Lamp1 = proteina di membrana 1 associata al lisosomia; LC3 = proteine associate ai microtubuli 1A/1B catena leggera 3B; STX6 = sintattica 6; Baf = bafilomicina A1; GFP = proteina fluorescente verde; S.E.M. = errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Imaging confocale di cellule HeLa che esprimono GFP-ATG13, trasfettate con siRNA di controllo o STX6 e sottoposte a trattamento con veicolo o Baf. (A) Le cellule HeLa sono state trasfettate con siRNA di controllo o STX6 , seguite da trasfezione pEGFP-C1-hAtg13 e trattate con DMSO o 400 nM Baf per 4 ore. Barra della scala = 20 μm. (B) Le intensità relative del segnale sono state determinate normalizzando il segnale in ciascuna condizione a quello delle cellule di controllo trasfettate con siRNA trattate con Baf. Il grafico a barre mostra i dati come medie ± S.E.M. (N = 3). * indica P < 0,05 con il test t spaiato a due code in Excel. Abbreviazioni: hAtg13 = gene 13 correlato all'autofagia umana; STX6 = sintattica 6; Baf = bafilomicina A1; DMSO = dimetilsolfossido; S.E.M. = errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1 supplementare: Analisi immunoblot delle cellule, delle frazioni P1 e P2 delle cellule HeLa trasfettate con siRNA di controllo e trattate con Baf. Le cellule HeLa sono state trasfettate con siRNA di controllo ed esposte a 100 nM Baf per 24 ore. Sono state quindi preparate le frazioni: cellula, P1 (20.000 × g di pellet) e P2 (110.000 × g di pellet). Immagini immunoblot rappresentative di ULK1 e PCNA, che mostrano i loro livelli in ciascuna frazione per il confronto. Abbreviazioni: Baf = bafilomicina A1; ULK1 = unc-51 come la chinasi 1 attivante l'autofagia; PCNA = antigene nucleare delle cellule proliferanti. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Lo studio di immunoblotting ha rivelato i livelli di LC3-II e TSG101 nella frazione cellulare, nella frazione EV P1 ricca di microvescicole e nella frazione EV P2 ricca di esosomi. L'imaging su cellule vive è stato utilizzato per esaminare autofagosomi, autolisosomi e omegasomi, fornendo informazioni sul fatto che il knockdown di STX6 influenzi l'autofagia. Questi risultati combinati suggeriscono che il knockdown di STX6 influisce sul rilascio di EV LC3-II positive, potenzialmente legate alla disregolazione della via dell'autofagia. Un vantaggio chiave di questo metodo è la sua capacità di distinguere tra veicoli elettrici grandi e piccoli provenienti da fonti diverse. L'analisi della citometria a flusso utilizzando marcatori specifici per microvescicole, esosomi o l'apparato di Golgi può chiarire ulteriormente come il knockdown di STX6 influenzi il rilascio di vescicole LC3-II positive.

Tuttavia, un limite dello studio sull'immunoblotting è che non è chiaro se l'aumento osservato dei livelli di LC3-II nella frazione EV dopo il knockdown di STX6 durante il trattamento con Baf sia dovuto a un aumento del numero di vescicole LC3-II positive rilasciate o a un aumento dei livelli di LC3-II per EV. Per distinguere tra queste possibilità, il conteggio delle vescicole utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle o l'analisi della citometria a flusso potrebbe aiutare a determinare se il numero di vescicole positive per LC3-II è aumentato o se i livelli di LC3-II per vescicola sono elevati.

Una fase critica del protocollo è il frazionamento del terreno coltivato per preparare la frazione EV. Le vescicole extracellulari sono osservate come minuscoli pellet nella provetta da centrifugazione. Per preparare una frazione EV comparabile, è importante trasferire o scartare con cura il surnatante dopo la centrifugazione per evitare di diluire la concentrazione proteica dei pellet EV. Per esaminare la contaminazione dalla frazione cellulare nella frazione EV, i livelli di una proteina citoplasmatica, unc-51-like autofagy activating kinase 1 (ULK1) e una proteina nucleare, PCNA, sono stati confrontati tra le frazioni in questo studio (Figura supplementare S1). La concentrazione proteica nella frazione cellulare riflette generalmente il numero di cellule, ma la concentrazione proteica cellulare è influenzata dagli stadi del ciclo cellulare²⁰ o dai disturbi della proteostasi²¹. L'autofagia è fondamentale per il mantenimento della proteostasi²². La disregolazione dell'autofagia da parte del knockdown di STX6 o del trattamento con Baf potrebbe alterare la concentrazione proteica indipendentemente dal numero di cellule.

Il knockdown di STX6 avviene attraverso la trasfezione di siRNA e la sovraespressione di GFP-ATG13 avviene attraverso la trasfezione del DNA. L'efficienza della trasfezione è influenzata dal tipo di cella, dalla densità e dal numero. L'allineamento efficiente delle sequenze di siRNA potrebbe anche influenzare l'efficienza del knockdown. Le regolazioni sono necessarie quando l'efficienza di trasfezione è bassa.

I risultati attuali indicano che il knockdown di STX6 ha aumentato i livelli del marcatore autofagosomico LC3-II nella frazione EV in condizioni trattate con Baf, ma non ha influenzato i livelli di TSG101. Ciò suggerisce che STX6 sopprime il rilascio di vescicole derivate dagli autofagosomi, ma non dalle MVB, quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Il knockdown di STX6 ha anche aumentato i livelli cellulari di LC3-II in condizioni di crescita, suggerendo che STX6 regola l'autofagia. Infatti, il knockdown di STX6 ha aumentato il numero di autofagosomi e autolisosomi, mentre non ha migliorato la formazione di omegasomi. La maturazione degli autolisosomi provoca la riformazione autofagica dei lisosomi²³. È possibile che STX6 media il processo di maturazione degli autolisosomi e la sua perdita di funzione potrebbe aumentare il numero di autolisosomi immaturi, portando a una disregolazione della fusione autofagosoma-lisosoma a causa della soppressione della riforma lisosomica autofagica.

Il trattamento con Baf ha aumentato i livelli di STX6 nella frazione EV, anche quando la sua espressione era sottoregolata. Studi precedenti hanno suggerito che le vescicole associate all'autofagosoma vengono rilasciate come vescicole extracellulari quando la funzione lisosomiale è inibita^13,14. STX6 è noto per localizzarsi nelle vescicole associate agli autofagosomi, come i vacuoli simili agli autofagosomi contenenti streptococco di gruppo A (GAS)²⁴. Pertanto, STX6 potrebbe essere localizzato in vescicole associate ad autofagosomi che vengono rilasciate come vescicole extracellulari quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

La diffusione della patologia TDP-43 è strettamente legata alla progressione della SLA e della FTLD-TDP³. Sebbene non sia chiaro come la patologia TDP-43 si diffonda attraverso il cervello e il midollo spinale, la via EV può mediare la sua diffusione. Studi precedenti hanno indicato che la disregolazione della via autofagia-lisosoma provoca il rilascio di EV LC3-II positivi contenenti TDP-43¹³. Il presente studio suggerisce un ruolo di STX6 nella regolazione del rilascio di EV quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita. La metodologia per valutare i livelli di LC3-II nelle frazioni cellulari e EV mediante immunoblotting dovrebbe rivelarsi utile in studi futuri.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25 % Tripsina EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
Piatto da 10 cm	Thermo Fisher Scientific	150464
Tubo da 15 ml	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μ L Pipetta Tip	Nippon Genetics	FG-301	pipettaggio
2-Mercaptoetanolo	Nacalai Tesque	21417-52	un materiale per soluzione tampone campione
3,3'-Diaminobenzidina Tetracloridrato	Nacalai Tesque	11009-41	un materiale per soluzione DAB
3,5 cm Piatto	Thermo Fisher Scientific	150460
Piatto da 6 cm	TrueLine	TR4001
Bagni termostatici a blocchi di alluminio (termobagni a secco)	EYELA	273860
Aspiratore	SANSYO	SAP-102	soluzione di inalazione
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomicina A1	Adipogen	BVT-0252
coniugata con biotina Anticorpo IgG di coniglio	Laboratori	BA-1000	2° anticorpo per immunoblotting
anticorpi IgG di cavallo coniugati con biotina		BA-2000	2° anticorpo per l'immunoblotting
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	un materiale per l'immunoblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	un materiale per soluzione tampone del campione
Siero di vitello	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Centrifuga 5702 R	eppendolf	5703000039
Vetrini di conteggio Doppia camera	Bio-Rad	1450015J	Conteggio cellulare
Sonificatore digitale 450	BRANSON
Dimethyl Sulfoxide	nacalai tasque	09659-14	veicolo
DMEM Alto glucosio	Nacalai Tesque	08458-45	terreno di coltura
DMEM senza fenolo rosso	Nacalai Tesque	08489-45	terreno di coltura
EGTA	Dojindo	348-01311	un materiale per la soluzione A68
Excel	Microsoft	versione 16.16.27	analisi satistica
EZR	Numero di riferimento 24	versione 1.68	analisi satistica
FBS	Sigma	173012	Terreno di coltura
Fiji	NIH		Strumento di analisi delle immagini
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	un materiale per soluzione tampone campione
Hoehst33342	Dojindo	H342
Perossido di idrogeno	Fujifilm Wako	080-0186	un materiale per la soluzione DAB
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	salvietta detergente
Tubo a bassa ritenzione	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA e trasfezione del DNA
LSM780 Microscopio laser confocale	Carl Zeiss
Monoclonale Mouse Anti-LC3 Anticorpo	MBL	M186-3	1° anticorpo per immunoblotting
Cloruro di nichel (II) esaidrato	Fujifilm Wako	149-01041	un materiale per soluzione DAB
N-Lauroilsarcosina Sale di sodio	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrifuga	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Siero ridotto Medium Thermo	Fisher Scientific	31985-070	siRNA e trasfezione del DNA
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillina/Streptomicina	Nacalai Tesque	26253-84	Terreno di coltura
Kit di analisi delle proteine BCA Pierce	Thermo Fisher Scientific	23225
Anticorpo anti-PCNA di coniglio policlonale	BioAcademia	70-080	1° anticorpo per immunoblotting
policlonale di coniglio anti-sintassina 6	ProteinTech	10841-1-AP	1° anticorpo per immunoblotting
Anticorpo policlonale di coniglio anti-TSG101 ProteinTech		28283-1-AP	1° anticorpo per immunoblotting
Anticorpo policlonale di coniglio anti-ULK1	ProteinTech	20986-1-AP	1° anticorpo per immunoblotting
Polivinilidene difluoruro Membrana	Milliore	IPVH00010	un materiale per l'immunoblotting
R	R sviluppo core team	versione 4.4.1	analisi satistica
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA reagente di trasfezione
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA per trasfezione
Cloruro di sodio	Nacalai Tesque	31320-05	un materiale per tampone Tris e soluzione A68
Sodium Dodecyl Sulfate	Fujifilm Wako	192-13981	un materiale per soluzione tampone campione
SPARK Microplate Reader TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	trasfezione siRNA
Saccarosio	Fujifilm Wako	193-00025	un materiale per la soluzione A68
TC20 Contatore di cellule automatizzato con stampante termica	Bio-Rad	1450109J1	conteggio delle cellule
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubazione
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	Reagente di trasfezione del DNA
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	Reagente
di trasfezione del DNATris(idrossimetil)amminometano	Nacalai Tesque	35406-75	un materiale per tampone Tris, tampone per campioni e soluzione A68
Colorante blu di tripano 0,40%	Bio-Rad	1450021	conteggio delle cellule
Tubo aperto ultratrasparente, 16 x 96 mm	Beckman Coulter	361706	raccolta per la frazione P1 EV
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	raccolta per la frazione P2 EV
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	immunoblotting
bottiglia di lavaggio	come uno	membrana di lavaggio 1-4640-02
mu;-Slide 8 pozzo alto	ibidi	80806