Valutare motilità delle cellule staminali neurali L'utilizzo di un gel a base di Agarose dispositivo a microfluidi

Sommario

Abbiamo dimostrato che l'espressione dei recettori più fattore di crescita epidermico (EGFR) aumenta la motilità delle cellule staminali neurali (NSC) utilizzando un nuovo gel dispositivo basato microfluidica. Questa tecnologia può essere facilmente adattabile ad altri sistemi cellulari di mammifero, dove le fonti di cellule sono scarse, come le cellule staminali neurali, e il girarsi tempo è critico.

Abstract

Mentre la tecnologia microfluidica sta raggiungendo un nuovo livello di maturità per le analisi macromolecolare, saggi cellulari sono ancora ad uno stadio infantile ^1. Ciò è dovuto alla difficoltà con cui si può creare un microambiente cellulare compatibile e costante con tecniche convenzionali di microfabbricazione e materiali. Abbiamo risolto questo problema tramite l'introduzione di un materiale di microfabbricazione romanzo, gel, come materiale di base per il dispositivo a microfluidi. Gel è altamente malleabile, e permeabile ai gas e sostanze nutritive necessarie per la sopravvivenza delle cellule e, quindi, un materiale ideale per saggi cellulari. Abbiamo dimostrato in precedenza che i dispositivi di agarosio gel a base hanno avuto successo nello studio della migrazione delle cellule batteriche e dei neutrofili ^2. In questo rapporto, tre canali paralleli microfluidica sono modellati in una membrana di gel di circa spessore 1mm. Flussi costanti con i media / tampone sono mantenute nei due canali laterali utilizzando una pompa peristaltica. Le cellule sono mantenute nel canale centrale per l'osservazione. Dal momento che le sostanze nutrienti e sostanze chimiche nei canali laterali sono costantemente diffondendo dal lato al centro del canale, l'ambiente chimico del canale centrale è facilmente controllato attraverso il flusso lungo i canali laterali. Utilizzando questo dispositivo, dimostriamo che il movimento delle cellule staminali neurali possono essere monitorati otticamente con facilità in condizioni chimiche diverse, ed i risultati sperimentali mostrano che l'espressione dei recettori più fattore di crescita epidermico (EGFR) aumenta la motilità delle cellule staminali neurali. Motilità delle cellule staminali neurali è un biomarker importante per valutare l'aggressività delle cellule, così fattore oncogeno ^3. Decifrare il meccanismo alla base della motilità NSC produrrà comprensione entrambi i disturbi dello sviluppo neurale e in invasione di cellule di cancro al cervello staminali.

Protocollo

Procedura

Diapositive rivestimento con fibronectina

Prima del montaggio del dispositivo a microfluidi, sterilizzare vetrini con fibronectina. Cappotto le diapositive in una biohood per mantenere la sterilità. Allineare un distanziatore sterile PDMS lungo i bordi della diapositiva e contrassegnare il lato che è rivolto verso l'alto con un pennarello indelebile. Pipettare 1 ml di mg / 5 ml soluzione di fibronectina (Sigma) all'interno del distanziatore PDMS sulla totalità del vetrino. Lasciare le diapositive indisturbato per un'ora, poi asciugare completamente con un N ₂ pistola. Le slide possono essere conservati ....

Discussione

Fig. 1 mostra le traiettorie dei tre ceppi NSC, le cellule dei genitori, la wtEGFR e ΔEGFR (controllo). Ogni set di traiettorie sono stati ottenuti da un film di 5 ore. Per le cellule dei genitori, la motilità cellulare ha raggiunto un picco quando la concentrazione di FEG è stato ~ 10ng/ml; per le cellule wtEGFR, la motilità delle cellule picco spostato a 100ng/ml o superiore, per le cellule ΔEGFR, la motilità cellulare è indipendente dalla concentrazione di EGF come previsto.

Le cellule wtEGF con 100ng/ml sono le cellule più mobil.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzo Dulbecco’s modificato di Eagle (DMEM) (1X)	Reagente	Invitrogen	11971-025
Mezzo indipendente dal CO2	Reagente	Invitrogen	18045-088	Un mezzo proprietario senza HEPES adatto a sostenere la crescita cellulare di diverse linee cellulari epiteliali, di fibroblasti e linfoidi in condizioni atmosferiche, privo di L-glutammina
Tripsina-EDTA	Reagente	Invitrogen	25200-072
PBS	Reagente	Invitrogen	14190-144	Soluzione salina tamponata al fosfato, senza calcio o magnesio
Pen/Strep	Reagente	Invitrogen	15140-122	Contiene 10.000 unità di penicillina (base) e 10.000 µg di streptomicina (base)/ml, utilizzando penicillina G (sale sodico) e solfato di streptomicina in soluzione salina allo 0,85%
FBS	Reagente	Invitrogen	10437-028	Serum fetale bovino, qualificato
Serum equino	Reagente	Invitrogen	16050-130	Serum equino, testato con EIA (risultato negativo)
Fibronectina	Reagente	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectina da plasma umano, anche chiamata globulina fredda insolubile
EGF	Reagente	Sigma-Aldrich	E4127	Fattore di crescita epidermico da ghiandola sottomascellare murina, liofilizzato
Agarosio	Reagente	Fisher Scientific	BP1356-500