Ingegnerizzazione del recettore dell'antigene chimerico-cellule natural killer mirate alle infezioni fungine utilizzando il sistema di trasposone non virale della bella addormentata

Sommario

Delineiamo un protocollo di trasfezione per la produzione di cellule CAR-NK (recettore dell'antigene chimerico-natural killer) che prendono di mira i patogeni fungini utilizzando il sistema di trasposone non virale della Bella Addormentata. Per valutare l'attivazione antigene-specifica, abbiamo co-coltivato le cellule ingegnerizzate con provette germinali di Aspergillus fumigatus e misurato la secrezione di IFN-γ.

Abstract

Le terapie cellulari basate sul recettore chimerico dell'antigene (CAR) hanno dimostrato un'efficacia impressionante nel trattamento delle neoplasie ematologiche. Recentemente, queste terapie sono in fase di sviluppo per le malattie infettive, ma gli studi mirati alle infezioni fungine rimangono scarsi. Per identificare bersagli ottimali e ottimizzare i prodotti cellulari, abbiamo sviluppato un metodo per ingegnerizzare le cellule natural killer del recettore dell'antigene chimerico (CAR-NK) e abbiamo valutato la loro risposta alla stimolazione da parte dei funghi. Questo articolo descrive un metodo semplice e robusto per generare cellule CAR-NK su misura per bersagli fungini utilizzando il sistema di trasposoni non virale Sleeping Beauty. Le cellule NK-92 vengono trasfettate con la trasposasi iperattiva SB100X vettorizzata come DNA minicerchio (MC) insieme a un trasposone CAR codificato da plasmidi. L'efficienza della trasfezione viene valutata 1 settimana dopo mediante analisi citofluorimetrica. Prima del test funzionale, le cellule che esprimono il transgene vengono arricchite mediante smistamento cellulare attivato magneticamente e coltivate per un'altra settimana. Per valutare l'attivazione antigene-specifica, le cellule ingegnerizzate vengono co-coltivate con provette germinali di Aspergillus fumigatus per almeno 6 ore. Successivamente, la concentrazione dell'interferone-gamma secreto (IFN-γ) viene misurata utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico.

Introduzione

L'Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) è un fungo ubiquitario, con una persona media che inala tra i 100 e i 1.000 conidi su base giornaliera¹. Nei pazienti con immunodeficienze acquisite o congenite, come quelli sottoposti a chemioterapia o che soffrono di leucemia, A. fumigatus può provocare una grave apsergillosi invasiva. Ogni anno, più di 200.000 persone in tutto il mondo contraggono l'aspergillosi. Nonostante l'uso di antimicotici per la prevenzione e la terapia con derivati azolici, il tasso di mortalità rimane tra il 30% e il 95%^2,3. Inoltre, il trattamento ha effetti collaterali significativi e il 7% delle colture di A. fumigatus è già resistente agli azoli⁴.

La terapia con cellule T ingegnerizzate con recettore dell'antigene chimerico (CAR) ha dimostrato un successo clinico nel trattamento di malattie maligne e ha ottenuto risultati preclinici promettenti nella lotta contro malattie infettive come l'aspergillosi invasiva 5,6,7,8. Le nostre cellule Af-CAR-T precedentemente descritte che hanno come bersaglio una proteina nella parete cellulare delle ife di A. fumigatus hanno mostrato risultati promettenti nei modelli preclinici⁶.

Il ridotto rischio di malattia del trapianto contro l'ospite, la sindrome da rilascio di citochine e la neurotossicità rendono le cellule CAR-NK una valida alternativa alle cellule CAR-T come trattamento "pronto all'uso" per le infezioni acute⁹. Inoltre, è stato dimostrato che le cellule NK svolgono un ruolo cruciale nella risposta immunitaria antifungina. Quando stimolate con A. fumigatus, le cellule NK secernono citochine come l'IFN-ɣ e chemochine come CCL-3 e CCL-4 e rilasciano granuli citotossici^10,11.

La linea cellulare NK-92 è una fonte popolare di cellule NK per l'ingegneria genetica, offrendo il vantaggio di una rapida proliferazione ed espansione in condizioni di coltura relativamente semplici¹². Diversi studi preclinici hanno dimostrato il potenziale terapeutico delle cellule NK-92 trasdotte da CAR nel trattamento sia dei tumori ematologici che di quelli solidi. Sono in corso numerosi studi clinici per studiarne la sicurezza, l'efficacia e il potenziale utilizzo come terapia cellulare "off-the-shelf"¹³.

Raggiungere un'elevata efficienza di trasfezione e un'espressione transgenica stabile nelle cellule NK è una sfida. Sebbene i metodi virali promettano un'elevata efficienza, comportano il rischio di mutazioni di inserzione con successiva oncogenesi ^9,14. L'ultima generazione di vettori di trasposoni della Bella Addormentata (SB) offre un sistema sicuro, potente ed economicamente sostenibile per il trasferimento genico stabile, superando i limiti dei metodi di somministrazione genica virale e transitoria non virale¹⁵.

Pertanto, questo protocollo delinea una nuova metodologia per la generazione di cellule Af-CAR-NK-92, che può potenzialmente fungere da opzione terapeutica "off-the-shelf" per i pazienti con aspergillosi invasiva pericolosa per la vita. L'efficacia di questo approccio è esemplificata dall'aumento della produzione di IFN-ɣ in seguito alla stimolazione con ife di A. fumigatus .

Protocollo

Tutti gli esperimenti qui descritti devono essere condotti in condizioni sterili. In questo protocollo, mostriamo due condizioni: (I) Trasfezione simulata senza DNA che servirà come controllo e (II) Trasfezione CAR utilizzando l'Af-CAR⁶ precedentemente descritto. Il plasmide Af-CAR contiene una sequenza troncata del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFRt) a valle del CAR, che verrà utilizzata come marcatore di trasfezione (Figura supplementare S1). Per ogni condizione sono necessarie 4 × 10 celle^{da 6} NK-92.

1. Coltura delle cellule NK-92

1. Uno o due giorni prima della trasfezione, preparare un terreno di coltura cellulare fresco con la seguente composizione: 75% (v/v) terreno alfa-MEM (con nucleosidi) + 12,5% (v/v) siero fetale bovino inattivato a caldo (FBS) + 12,5% (v/v) siero di cavallo inattivato a caldo + 2 mM di L-glutammina.
2. Risospendere almeno 10⁷ cellule NK-92 a una densità cellulare di 5 × 10⁵ cellule/mL.
3. Aggiungere IL-2 alla sospensione cellulare a una concentrazione di 150 UI/mL.
4. Coltivare le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂.
   NOTA: IL-2 può essere utilizzato a una concentrazione finale di 5 ng/mL.

2. Trasfezione non virale

1. Controllare la qualità delle cellule al microscopio. Una sospensione di cluster cellulari e uno sfondo chiaro indicano una coltura cellulare sana.
2. In una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 2 mL di terreno di coltura cellulare per pozzetto per ogni condizione. Porre la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 °C con il 5% di CO₂.
   NOTA: Gli antibiotici possono ridurre la vitalità cellulare dopo la trasfezione. Mantieni il terreno privo di antibiotici.
3. Contare le cellule e verificare la vitalità cellulare utilizzando (ad esempio, la colorazione con blu di tripano).
4. Trasferire 8 × 10⁶ cellule NK-92 in una provetta a fondo conico da 15 mL. Centrifugare a 200 × g per 5 min con un'accelerazione e decelerazione di 3. Utilizzare questo programma per tutte le seguenti fasi di centrifugazione.
5. Durante la centrifugazione, preparare due provette di reazione da 1,5 mL. Pipettare il DNA per Af-CAR (8 μg di DNA plasmidico e 4 μg di SB100X Mini Circle, Tabella 1) in una delle provette. Mantieni il secondo privo di DNA per essere un controllo simulato.
6. Quando la centrifuga è pronta, scartare delicatamente il surnatante e riempire la provetta contenente le cellule con un massimo di 15 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata.
7. Centrifugare (passaggio 2.4).
8. Durante la centrifugazione, preparare una provetta del sistema di trasfezione per ogni condizione aggiungendo 3 mL di tampone elettrolitico in ciascuna provetta. Inserire la prima provetta nella stazione di pipetta.
9. Quando la centrifuga è pronta, scartare delicatamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone di risospensione (100 μL/4 × 10⁶ cellule).
   NOTA: Evitare di lasciare le cellule nel tampone di risospensione per più di 15-30 minuti, poiché ciò riduce la vitalità cellulare e l'efficienza di trasfezione.
10. Aggiungere 100 μl della sospensione cellulare in ciascuna delle due provette di reazione. Mescolare delicatamente.
    NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria durante il pipettaggio, poiché le bolle d'aria causano la formazione di archi elettrici, che portano alla morte cellulare.
11. Pipettare la miscela DNA-cellula dalla prima provetta di reazione con la pipetta del sistema di trasfezione e inserire la pipetta verticalmente nella provetta posizionata nella stazione di pipetta.
    NOTA: Assicurarsi che la punta si adatti correttamente.
12. Impostare il primo impulso a 1.650 V e il tempo dell'impulso a 20 ms e premere Start.
13. Al termine, impostare il secondo impulso a 500 V e il tempo di impulso a 100 ms. Premere Start.
14. Al termine, rimuovere lentamente la pipetta dalla stazione di pipettazione e trasferire immediatamente le cellule in un pozzetto della piastra di coltura preparata contenente 2 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato (vedere la fase 2.2). Muovere delicatamente la piastra in senso circolare per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente.
15. Per il campione simulato, prelevare 100 μl della sospensione cellulare dalla provetta di reazione priva di DNA (vedere il passaggio 2.9) e ripetere la stessa procedura dal passaggio 2.11 al passaggio 2.14, utilizzando una nuova provetta e un nuovo puntale per pipetta.
16. Incubare la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 °C con CO₂ al 5%.
17. Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere IL-2 a una concentrazione finale di 150 UI/mL.

3. Controllo dell'efficienza di trasfezione mediante citometria a flusso

1. Dopo 1 settimana di coltivazione e divisione delle cellule ogni due giorni, prelevare 1-5 × 10⁵ cellule di ciascuna condizione in un tubo di polistirene a fondo tondo.
2. Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone (PBS + 0,5% (v/v) FBS + 2 mM EDTA); centrifugare e scartare il surnatante.
3. Risospendere il pellet di cella in 50 μL di tampone. Aggiungere 1 μL di 7-AAD per rilevare le cellule morte.
4. Aggiungere 5 μL di anticorpo anti-tEGFR-Alexa fluor 647 per colorare le cellule trasfettate.
5. Incubare per 20 minuti a 4 °C.
6. Lavare le celle (vedere il passaggio 3.2).
7. Risospendere il pellet di cella in 200 μL di tampone.
8. Misurare i campioni su un citometro a flusso.
   NOTA: Se l'efficienza di trasfezione non è soddisfacente, procedere con l'arricchimento delle cellule che esprimono il transgene.

4. Arricchimento di cellule che esprimono transgeni mediante smistamento cellulare attivato da magneti (MACS)

NOTA: Per risultati ottimali, iniziare il protocollo con 8-10 × 10⁶ celle. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a 4 °C.

1. Preparare il buffer come descritto nel passaggio 3.2. Diluire le cellule a una concentrazione di 1-2 × 10⁶/100 μl con il tampone in una provetta a fondo conico da 15 mL.
2. Aggiungere 1 μL di anti-EGFRt-biotina per 1-2 × 10⁶ cellule e agitare delicatamente la provetta per garantire una soluzione distribuita uniformemente.
3. Incubare per 25 minuti a 4 °C, quindi riempire la provetta con un massimo di 10 mL di tampone.
4. Centrifuga. Scartare il surnatante.
5. Aggiungere 8 μl/1 × 10⁶ celle di tampone freddo.
6. Aggiungere 2 μL di microsfere magnetiche anti-biotina per 1 × 10⁶ celle.
7. Incubare per 15 minuti a 4 °C.
8. Lavare riempiendo fino a 10 ml con tampone.
9. Centrifuga. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 μL di tampone.
10. Posizionare una colonna LS nel magnete MACS e lavare con 3 mL di tampone.
11. Non appena il buffer è stato completamente migrato attraverso la colonna, aggiungere la sospensione della cella.
12. Lavare la colonna 3 volte, ciascuna con 3 mL di tampone.
13. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla in una provetta a fondo conico da 15 mL pulita.
14. Aggiungere 5 mL di tampone alla colonna. Utilizzando lo stantuffo, sciacquare le cellule EGFR-positive il più rapidamente possibile.
15. Coltivare le cellule per alcuni giorni; Quindi, verificare l'efficienza mediante citometria a flusso.

5. Test funzionali

NOTA: Per il prossimo esperimento, preparare e utilizzare il seguente mezzo: RPMI + 20% FBS.

1. Giorno 1 - Semina Aspergillus fumigatus conidia
   1. Preparare una sospensione di conidi di A. fumigatus a una concentrazione di 2,5 × 10⁵ conidio/mL nel terreno.
   2. In una piastra di coltura da 96 pozzetti, pipettare 100 μl di sospensione di conidi per pozzetto e incubare a 25 °C per 16 ore.
      NOTA: Dopo il periodo di incubazione, i conidi germoglieranno (Figura 1).
2. Giorno 2 - Co-coltura con cellule CAR NK-92
   1. Lavare le celle Mock e Af-CAR NK-92 2 volte con il mezzo.
   2. Co-coltura con il fungo con un rapporto effettore/bersaglio di 2:1 aggiungendo 5 × 10⁴ cellule in 100 μL di terreno per pozzetto (Figura 2).
   3. Per un controllo positivo, aggiungere 1 ng di PMA e 100 ng di ionomicina per pozzetto in 100 μL di terreno. Utilizzare le celle nel terreno solo come controllo negativo.
   4. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore a CO₂ umidificato per almeno 6 ore.
   5. Centrifugare il piatto a 300 × g per 5 min.
   6. Raccogliere 100 μL di ciascun pozzetto; Evitare di toccare il fondo. Trasferire i surnatanti nelle provette di reazione.
      NOTA: Assicurarsi che venga pipettato solo il surnatante e non il fungo cresciuto. In caso di dubbio, aggiungere un'altra fase di centrifugazione.
   7. Eseguire IFN-ɣ ELISA seguendo le istruzioni del produttore o conservare i campioni a -80 °C fino all'uso.

Risultati

L'intero processo di generazione delle cellule Af-CAR NK-92, compresa la trasfezione, il recupero, l'arricchimento e l'espansione, richiede circa 14 giorni. Dopo la trasfezione, le cellule vengono coltivate e divise ogni due giorni. La vitalità cellulare può diminuire durante la prima scissione, due giorni dopo la trasfezione. Tipicamente, le cellule si riprendono 4 giorni dopo la trasfezione e iniziano a proliferare, con un tempo di raddoppio di 48 ore.

Dopo il recupero, vengono misurate le efficienze di trasfezione e si prevede che raggiungano il 10-20% (risultati rappresentativi mostrati nella Figura 3). L'arricchimento di cellule EGFR-positive tramite MACS aumenta la percentuale di cellule Af-CAR NK-92 a oltre il 95% (risultati rappresentativi mostrati nella Figura 4).

Per i saggi funzionali sono state utilizzate colture con oltre il 95% di cellule Af-CAR. Qui, abbiamo co-coltivato le cellule con tubi germinali di A. fumigatus per 6 ore e misurato la secrezione di IFN-ɣ come marcatore di attivazione. Come mostrato nella Figura 5, le cellule Af-CAR hanno mostrato una significativa secrezione di citochine (media = 340,6 ± 86,5 pg/mL) rispetto alle cellule Mock NK-92 (media = 75,6 ± 19,5 pg/mL), indicando un'attivazione sostanzialmente più elevata delle cellule Af-CAR (valore p = 0,03).

Figura 1: Tubi germinali di Aspergillus fumigatus. Immagine al microscopio di A. fumigatus dopo 16 ore di incubazione. I tubi germinali/piccole ife vengono osservati e distribuiti in modo omogeneo intorno al pozzetto. Barra della scala = 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Co-coltura di provette germinali di Aspergillus fumigatus con cellule NK-92. Immagine al microscopio della co-coltura. Le cellule NK-92 formano cluster e sono in contatto con i tubi germinali di A. fumigatus . Barra della scala = 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Efficienza di trasfezione valutata mediante colorazione per il marcatore di trasfezione EGFR. Il giorno 5, dopo l'elettroporazione, le cellule NK-92 sono state colorate con 7-AAD e anti-EGFR. I risultati sono mostrati per un esperimento rappresentativo per (A) celle Mock e (B) cellule Af-CAR NK-92. La colonna di sinistra mostra i dot plot delle dimensioni delle celle rispetto alla granularità delle celle; il cancello è impostato sulle celle NK-92. Le cellule morte vengono outgate utilizzando l'etichettatura 7-AAD (seconda colonna). La percentuale di cellule EGFR⁺ viventi è mostrata nella terza colonna. Abbreviazioni: EGFR = recettore del fattore di crescita epidermico; 7-AAD = 7-amminoactinomicina D; CAR = recettore chimerico dell'antigene. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati della colorazione della superficie cellulare dopo l'arricchimento di cellule NK-92 che esprimono il transgene. A sinistra vengono visualizzate le celle fittizie. A destra, sono mostrate le celle Af-CAR-NK. Gli istogrammi rossi rappresentano le cellule non colorate. Gli istogrammi blu rappresentano le corrispondenti celle colorate. Il cancello è impostato sulle celle EGFR⁺ ; I numeri mostrano la percentuale di celle positive. Abbreviazioni: EGFR = recettore del fattore di crescita epidermico; CAR = recettore chimerico dell'antigene. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Secrezione di citochine di cellule NK attivate da tubi germinali di Aspergillus fumigatus . I diagrammi presentano i risultati della secrezione di IFN-ɣ di cellule Af-CAR e Mock in co-coltura con funghi misurata mediante ELISA dopo 6 ore di co-coltura. I dati riportati sono la media ± SD di tre esperimenti eseguiti in modo indipendente (n = 3). Valore P calcolato dal test t di Welch utilizzando GraphPad Prism 10, * p < 0,05. Abbreviazioni: NK = natural killer; IFN-ɣ = interferone gamma; CAR = recettore chimerico dell'antigene; ELISA = saggio di immunoassorbimento enzimatico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Nome	Società	Concentrazione delle scorte	Riferimento
Traduzione	SB100X Mini cerchio	PlasmidFactory	1 μg/μl	19
Trasposone	Plasmide Af-CAR	Prodotto in casa	1 μg/μl	6

Tabella 1: DNA utilizzato in questo protocollo.

Figura S1 supplementare: Mappa plasmidica del trasposone Af-CAR: Schema del vettore plasmidico e progettazione del trasposone CAR. Abbreviazioni: EF1 = fattore di allungamento-1 promotore alfa; ORI = origine batterica della replicazione; LIR = ripetizione invertita a sinistra; RIR: ripetizione invertita a destra; Cyto = citoplasmatico; Tm = Transmembrana. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Il protocollo fornito offre un metodo semplice e affidabile per la creazione di cellule CAR-NK che prendono di mira i patogeni fungini utilizzando il sistema di trasposone non virale della Bella Addormentata. Questo metodo consente l'inserimento stabile e permanente di grandi transgeni, che consente l'espansione delle cellule per ottenere le quantità necessarie per ulteriori analisi ^14,16.

Diversi fattori chiave possono influire sul successo della trasfezione, tra cui il numero e la vitalità delle cellule, la forza e la durata dell'impulso, nonché la qualità e la quantità del DNA¹⁷. È fondamentale valutare la salute delle cellule prima di iniziare, garantendo una vitalità di almeno il 90%. È stato dimostrato che un'elevata forza dell'impulso può migliorare l'efficienza di trasfezione di una popolazione cellulare. Tuttavia, questo approccio può anche comportare una significativa riduzione della vitalità cellulare. Nei casi con un eccesso di cellule e una quantità o qualità limitata di DNA, il numero di cellule che assorbono con successo il plasmide può essere insufficiente¹⁷. Tuttavia, è stato dimostrato che alte concentrazioni di DNA sono tossiche e riducono la vitalità cellulare¹⁸.

Studi precedenti hanno raggiunto efficienze di trasfezione più elevate, ma si sono concentrati esclusivamente sull'espressione proteica transitoria¹⁷. Al contrario, il nostro protocollo garantisce un inserimento stabile del transgene. Per affrontare le basse efficienze di trasfezione, abbiamo implementato l'arricchimento di cellule trasfettate positivamente e abbiamo raggiunto circa il 95% di cellule che esprimono CAR. Tuttavia, questo ha aumentato il tempo di produzione a ~ 1 settimana. Se si desiderano tempi di produzione più brevi, il DNA del trasposone potrebbe essere consegnato come un minicerchio, il che può migliorare l'efficienza della trasfezione e può eliminare la necessità della fase di arricchimento¹⁹. Tuttavia, il tempo di produzione non può essere ridotto a <1 settimana per consentire il recupero e la proliferazione cellulare.

Data la natura acuta dell'aspergillosi invasiva, le terapie cellulari "pronte all'uso" sarebbero utili. Le sfide e i costi associati all'isolamento delle cellule dai pazienti e all'espansione delle cellule primarie hanno aumentato la popolarità di NK-92 come linea cellulare conveniente per la produzione di cellule CAR-NK²⁰. Le cellule NK-92 sono generalmente robuste e proliferano rapidamente in presenza di IL-2, il che facilita il raggiungimento di grandi quantità cellulari in un periodo relativamente breve. Alla luce di questi vantaggi, abbiamo sviluppato un protocollo per l'ingegneria genetica delle cellule NK-92, dimostrando che è possibile trasfettare e preparare in sicurezza prodotti cellulari CAR-NK con elevata purezza. Sebbene questo protocollo possa essere adattato per preparare cellule CAR-NK primarie, dovrebbero essere prese in considerazione diverse modifiche. Questi includono l'ottimizzazione del numero e dell'intensità degli impulsi, la quantità di DNA utilizzata e la definizione di un protocollo di espansione adeguato. Qualsiasi modifica al protocollo richiederebbe un'indagine approfondita per garantirne l'efficacia. Tuttavia, il nostro protocollo fornisce un modello di base che potrebbe essere adattato per le cellule NK primarie in esperimenti futuri.

In sintesi, questo innovativo protocollo di trasfezione per la produzione di cellule Af-CAR-NK stabili è un metodo efficiente e riproducibile che può essere impiegato per colpire altre malattie. Inoltre, potrebbe essere utilizzato come metodo economico per lo screening di nuovi CAR mirati a una varietà di antigeni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette a fondo conico da 15 ML	Greiner Bio-One	188271	PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE Provette
a fondo conico da 50 ML	Greiner Bio-One	227270	PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE Piastra
coltura cellulare a 6 e 96 pozzetti	Corning Inc. LifeSciences	83-3736/ 83-3474	Piastre a pozzetti multipli trattate con TC, fondo piatto, trattate per un fissaggio ottimale delle cellule, sterilizzate mediante irradiazione gamma,
7-AAD (7-amminoactinomicina D)	BD biosciences	559925	colorante di acido nucleico facile da usare per l'esclusione di cellule non vitali in saggi citometrici a flusso
Alexa Fluor 647 anticorpo EGFR umano	Biolegend	352918	clone AY13
Microsfere anti-biotina UltraPure	Miltenyi Biotec	130-105-637	Microsfere ultrapure coniugate a topo monoclonale anti-biotina anticorpi
Aspergillus fumigatus	ATCC	46645
Puntali filtranti per biosfera (20 e 100 μ L)	Sarstedt	70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′ s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Modificato, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, liquido, filtrato sterile, adatto alla coltura cellulare, endotossina, testato
ELISA MAX Deluxe Set IFN umano-γ	Biolegend	dell'acido
etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	per biologia molecolare, 0,5  M in H2O, DNasi, RNasi, NICKasi e proteasi, nessuna rilevata, 0,2 μ m filtrato.
FACS clean	BD Biosciences	340345
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003
FACS Soluzione di risciacquo	BD Bioscience	340346
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524	filtrato sterile, adatto per colture cellulari, inattivato a caldo prima dell'uso
Gibco, MEM α, nucleosidi	Thermofisher Scientific	22571020	Rosso fenolo, Ribonucleosidi, Desossiribonucleosidi, Bicarbonato di sodio
Siero di cavallo	Thermo Fisher Scientific	16050122	Filtrato sterile, inattivato a caldo prima dell'uso
IL-2 umana IS, grado di ricerca	Miltenyi Biotec	130-097-742	Grado di ricerca. L'ED50 è ≤ 0,3 ng/mL, corrispondente a un'attività di ≥ 3 &volte; 106 UI/mg.
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	da Streptomyces conglobatus, usato come controllo positivo per la secrezione di citochine.
L-Glutammina	Sigma-Aldrich	W368401	Per colture cellulari
Colonna MACS LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	Colonne e pistoni in confezione sterile
NK-92	DSMZ	ACC 488
Neon Transfektionssystem 100  μ L-Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Tampone di Risospensione R, Tampone Elettrolitico E2, 100 μ L Punte al neon, tubi per elettroporazione al neon
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585-1MG	utilizzato come controllo positivo per la secrezione di citochine
Provetta in polistirene a fondo tondo, 5 mL	BD Bioscience	S-452400	utilizzata per citometria a flusso
Provetta di reazione, 1,5 ML	Greiner Bio-One	7,26,90,001	PP, trasparente, tappo attaccato, con graduazione iniettata. Sterilizzato prima dell'uso.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	72400021	GlutaMax I,  Rosso fenolo, HEPES, TipOne
1000 con filtro sterile μ Puntale con filtro graduato L XL		StarLab S1122-1730
Equipment
BD FACSCalibur	BD Bioscience
CO2 Incubatore C60	Labotect
Heraeus Multifuge 3SR	Thermo Scientific
IdroFLEX lavatrice per micropiastre	Tecan
NanoQuant Infinite M200 Pro	Tecan
Neon Transfection System	Invitrogen
Pipettes	Separatore Eppendorf
Quadro MACS	Miltenyi Biotec