Delineiamo un protocollo di trasfezione per la produzione di cellule CAR-NK (recettore dell'antigene chimerico-natural killer) che prendono di mira i patogeni fungini utilizzando il sistema di trasposone non virale della Bella Addormentata. Per valutare l'attivazione antigene-specifica, abbiamo co-coltivato le cellule ingegnerizzate con provette germinali di Aspergillus fumigatus e misurato la secrezione di IFN-γ.
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Articolo metodologico
Ingegnerizzazione del recettore dell'antigene chimerico-cellule natural killer mirate alle infezioni fungine utilizzando il sistema di trasposone non virale della bella addormentata
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le terapie cellulari basate sul recettore chimerico dell'antigene (CAR) hanno dimostrato un'efficacia impressionante nel trattamento delle neoplasie ematologiche. Recentemente, queste terapie sono in fase di sviluppo per le malattie infettive, ma gli studi mirati alle infezioni fungine rimangono scarsi. Per identificare bersagli ottimali e ottimizzare i prodotti cellulari, abbiamo sviluppato un metodo per ingegnerizzare le cellule natural killer del recettore dell'antigene chimerico (CAR-NK) e abbiamo valutato la loro risposta alla stimolazione da parte dei funghi. Questo articolo descrive un metodo semplice e robusto per generare cellule CAR-NK su misura per bersagli fungini utilizzando il sistema di trasposoni non virale Sleeping Beauty. Le cellule NK-92 vengono trasfettate con la trasposasi iperattiva SB100X vettorizzata come DNA minicerchio (MC) insieme a un trasposone CAR codificato da plasmidi. L'efficienza della trasfezione viene valutata 1 settimana dopo mediante analisi citofluorimetrica. Prima del test funzionale, le cellule che esprimono il transgene vengono arricchite mediante smistamento cellulare attivato magneticamente e coltivate per un'altra settimana. Per valutare l'attivazione antigene-specifica, le cellule ingegnerizzate vengono co-coltivate con provette germinali di Aspergillus fumigatus per almeno 6 ore. Successivamente, la concentrazione dell'interferone-gamma secreto (IFN-γ) viene misurata utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico.
Introduzione
L'Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) è un fungo ubiquitario, con una persona media che inala tra i 100 e i 1.000 conidi su base giornaliera1. Nei pazienti con immunodeficienze acquisite o congenite, come quelli sottoposti a chemioterapia o che soffrono di leucemia, A. fumigatus può provocare una grave apsergillosi invasiva. Ogni anno, più di 200.000 persone in tutto il mondo contraggono l'aspergillosi. Nonostante l'uso di antimicotici per la prevenzione e la terapia con derivati azolici, il tasso di mortalità rimane tra il 30% e il 95%2,3. Inoltre, il trattamento ha effetti collaterali significativi e il 7% delle colture di A. fumigatus è già resistente agli azoli4.
La terapia con cellule T ingegnerizzate con recettore dell'antigene chimerico (CAR) ha dimostrato un successo clinico nel trattamento di malattie maligne e ha ottenuto risultati preclinici promettenti nella lotta contro malattie infettive come l'aspergillosi invasiva 5,6,7,8. Le nostre cellule Af-CAR-T precedentemente descritte che hanno come bersaglio una proteina nella parete cellulare delle ife di A. fumigatus hanno mostrato risultati promettenti nei modelli preclinici6.
Il ridotto rischio di malattia del trapianto contro l'ospite, la sindrome da rilascio di citochine e la neurotossicità rendono le cellule CAR-NK una valida alternativa alle cellule CAR-T come trattamento "pronto all'uso" per le infezioni acute9. Inoltre, è stato dimostrato che le cellule NK svolgono un ruolo cruciale nella risposta immunitaria antifungina. Quando stimolate con A. fumigatus, le cellule NK secernono citochine come l'IFN-ɣ e chemochine come CCL-3 e CCL-4 e rilasciano granuli citotossici10,11.
La linea cellulare NK-92 è una fonte popolare di cellule NK per l'ingegneria genetica, offrendo il vantaggio di una rapida proliferazione ed espansione in condizioni di coltura relativamente semplici12. Diversi studi preclinici hanno dimostrato il potenziale terapeutico delle cellule NK-92 trasdotte da CAR nel trattamento sia dei tumori ematologici che di quelli solidi. Sono in corso numerosi studi clinici per studiarne la sicurezza, l'efficacia e il potenziale utilizzo come terapia cellulare "off-the-shelf"13.
Raggiungere un'elevata efficienza di trasfezione e un'espressione transgenica stabile nelle cellule NK è una sfida. Sebbene i metodi virali promettano un'elevata efficienza, comportano il rischio di mutazioni di inserzione con successiva oncogenesi 9,14. L'ultima generazione di vettori di trasposoni della Bella Addormentata (SB) offre un sistema sicuro, potente ed economicamente sostenibile per il trasferimento genico stabile, superando i limiti dei metodi di somministrazione genica virale e transitoria non virale15.
Pertanto, questo protocollo delinea una nuova metodologia per la generazione di cellule Af-CAR-NK-92, che può potenzialmente fungere da opzione terapeutica "off-the-shelf" per i pazienti con aspergillosi invasiva pericolosa per la vita. L'efficacia di questo approccio è esemplificata dall'aumento della produzione di IFN-ɣ in seguito alla stimolazione con ife di A. fumigatus .
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Protocollo
Tutti gli esperimenti qui descritti devono essere condotti in condizioni sterili. In questo protocollo, mostriamo due condizioni: (I) Trasfezione simulata senza DNA che servirà come controllo e (II) Trasfezione CAR utilizzando l'Af-CAR6 precedentemente descritto. Il plasmide Af-CAR contiene una sequenza troncata del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFRt) a valle del CAR, che verrà utilizzata come marcatore di trasfezione (Figura supplementare S1). Per ogni condizione sono necessarie 4 × 10 celleda 6 NK-92.
1. Coltura delle cellule NK-92
- Uno o due giorni prima della trasfezione, preparare un terreno di coltura cellulare fresco con la seguente composizione: 75% (v/v) terreno alfa-MEM (con nucleosidi) + 12,5% (v/v) siero fetale bovino inattivato a caldo (FBS) + 12,5% (v/v) siero di cavallo inattivato a caldo + 2 mM di L-glutammina.
- Risospendere almeno 107 cellule NK-92 a una densità cellulare di 5 × 105 cellule/mL.
- Aggiungere IL-2 alla sospensione cellulare a una concentrazione di 150 UI/mL.
- Coltivare le cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2.
NOTA: IL-2 può essere utilizzato a una concentrazione finale di 5 ng/mL.
2. Trasfezione non virale
- Controllare la qualità delle cellule al microscopio. Una sospensione di cluster cellulari e uno sfondo chiaro indicano una coltura cellulare sana.
- In una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 2 mL di terreno di coltura cellulare per pozzetto per ogni condizione. Porre la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 °C con il 5% di CO2.
NOTA: Gli antibiotici possono ridurre la vitalità cellulare dopo la trasfezione. Mantieni il terreno privo di antibiotici. - Contare le cellule e verificare la vitalità cellulare utilizzando (ad esempio, la colorazione con blu di tripano).
- Trasferire 8 × 106 cellule NK-92 in una provetta a fondo conico da 15 mL. Centrifugare a 200 × g per 5 min con un'accelerazione e decelerazione di 3. Utilizzare questo programma per tutte le seguenti fasi di centrifugazione.
- Durante la centrifugazione, preparare due provette di reazione da 1,5 mL. Pipettare il DNA per Af-CAR (8 μg di DNA plasmidico e 4 μg di SB100X Mini Circle, Tabella 1) in una delle provette. Mantieni il secondo privo di DNA per essere un controllo simulato.
- Quando la centrifuga è pronta, scartare delicatamente il surnatante e riempire la provetta contenente le cellule con un massimo di 15 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata.
- Centrifugare (passaggio 2.4).
- Durante la centrifugazione, preparare una provetta del sistema di trasfezione per ogni condizione aggiungendo 3 mL di tampone elettrolitico in ciascuna provetta. Inserire la prima provetta nella stazione di pipetta.
- Quando la centrifuga è pronta, scartare delicatamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone di risospensione (100 μL/4 × 106 cellule).
NOTA: Evitare di lasciare le cellule nel tampone di risospensione per più di 15-30 minuti, poiché ciò riduce la vitalità cellulare e l'efficienza di trasfezione. - Aggiungere 100 μl della sospensione cellulare in ciascuna delle due provette di reazione. Mescolare delicatamente.
NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria durante il pipettaggio, poiché le bolle d'aria causano la formazione di archi elettrici, che portano alla morte cellulare. - Pipettare la miscela DNA-cellula dalla prima provetta di reazione con la pipetta del sistema di trasfezione e inserire la pipetta verticalmente nella provetta posizionata nella stazione di pipetta.
NOTA: Assicurarsi che la punta si adatti correttamente. - Impostare il primo impulso a 1.650 V e il tempo dell'impulso a 20 ms e premere Start.
- Al termine, impostare il secondo impulso a 500 V e il tempo di impulso a 100 ms. Premere Start.
- Al termine, rimuovere lentamente la pipetta dalla stazione di pipettazione e trasferire immediatamente le cellule in un pozzetto della piastra di coltura preparata contenente 2 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato (vedere la fase 2.2). Muovere delicatamente la piastra in senso circolare per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente.
- Per il campione simulato, prelevare 100 μl della sospensione cellulare dalla provetta di reazione priva di DNA (vedere il passaggio 2.9) e ripetere la stessa procedura dal passaggio 2.11 al passaggio 2.14, utilizzando una nuova provetta e un nuovo puntale per pipetta.
- Incubare la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 °C con CO2 al 5%.
- Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere IL-2 a una concentrazione finale di 150 UI/mL.
3. Controllo dell'efficienza di trasfezione mediante citometria a flusso
- Dopo 1 settimana di coltivazione e divisione delle cellule ogni due giorni, prelevare 1-5 × 105 cellule di ciascuna condizione in un tubo di polistirene a fondo tondo.
- Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone (PBS + 0,5% (v/v) FBS + 2 mM EDTA); centrifugare e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet di cella in 50 μL di tampone. Aggiungere 1 μL di 7-AAD per rilevare le cellule morte.
- Aggiungere 5 μL di anticorpo anti-tEGFR-Alexa fluor 647 per colorare le cellule trasfettate.
- Incubare per 20 minuti a 4 °C.
- Lavare le celle (vedere il passaggio 3.2).
- Risospendere il pellet di cella in 200 μL di tampone.
- Misurare i campioni su un citometro a flusso.
NOTA: Se l'efficienza di trasfezione non è soddisfacente, procedere con l'arricchimento delle cellule che esprimono il transgene.
4. Arricchimento di cellule che esprimono transgeni mediante smistamento cellulare attivato da magneti (MACS)
NOTA: Per risultati ottimali, iniziare il protocollo con 8-10 × 106 celle. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a 4 °C.
- Preparare il buffer come descritto nel passaggio 3.2. Diluire le cellule a una concentrazione di 1-2 × 106/100 μl con il tampone in una provetta a fondo conico da 15 mL.
- Aggiungere 1 μL di anti-EGFRt-biotina per 1-2 × 106 cellule e agitare delicatamente la provetta per garantire una soluzione distribuita uniformemente.
- Incubare per 25 minuti a 4 °C, quindi riempire la provetta con un massimo di 10 mL di tampone.
- Centrifuga. Scartare il surnatante.
- Aggiungere 8 μl/1 × 106 celle di tampone freddo.
- Aggiungere 2 μL di microsfere magnetiche anti-biotina per 1 × 106 celle.
- Incubare per 15 minuti a 4 °C.
- Lavare riempiendo fino a 10 ml con tampone.
- Centrifuga. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 μL di tampone.
- Posizionare una colonna LS nel magnete MACS e lavare con 3 mL di tampone.
- Non appena il buffer è stato completamente migrato attraverso la colonna, aggiungere la sospensione della cella.
- Lavare la colonna 3 volte, ciascuna con 3 mL di tampone.
- Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla in una provetta a fondo conico da 15 mL pulita.
- Aggiungere 5 mL di tampone alla colonna. Utilizzando lo stantuffo, sciacquare le cellule EGFR-positive il più rapidamente possibile.
- Coltivare le cellule per alcuni giorni; Quindi, verificare l'efficienza mediante citometria a flusso.
5. Test funzionali
NOTA: Per il prossimo esperimento, preparare e utilizzare il seguente mezzo: RPMI + 20% FBS.
- Giorno 1 - Semina Aspergillus fumigatus conidia
- Preparare una sospensione di conidi di A. fumigatus a una concentrazione di 2,5 × 105 conidio/mL nel terreno.
- In una piastra di coltura da 96 pozzetti, pipettare 100 μl di sospensione di conidi per pozzetto e incubare a 25 °C per 16 ore.
NOTA: Dopo il periodo di incubazione, i conidi germoglieranno (Figura 1).
- Giorno 2 - Co-coltura con cellule CAR NK-92
- Lavare le celle Mock e Af-CAR NK-92 2 volte con il mezzo.
- Co-coltura con il fungo con un rapporto effettore/bersaglio di 2:1 aggiungendo 5 × 104 cellule in 100 μL di terreno per pozzetto (Figura 2).
- Per un controllo positivo, aggiungere 1 ng di PMA e 100 ng di ionomicina per pozzetto in 100 μL di terreno. Utilizzare le celle nel terreno solo come controllo negativo.
- Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore a CO2 umidificato per almeno 6 ore.
- Centrifugare il piatto a 300 × g per 5 min.
- Raccogliere 100 μL di ciascun pozzetto; Evitare di toccare il fondo. Trasferire i surnatanti nelle provette di reazione.
NOTA: Assicurarsi che venga pipettato solo il surnatante e non il fungo cresciuto. In caso di dubbio, aggiungere un'altra fase di centrifugazione. - Eseguire IFN-ɣ ELISA seguendo le istruzioni del produttore o conservare i campioni a -80 °C fino all'uso.
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Risultati
L'intero processo di generazione delle cellule Af-CAR NK-92, compresa la trasfezione, il recupero, l'arricchimento e l'espansione, richiede circa 14 giorni. Dopo la trasfezione, le cellule vengono coltivate e divise ogni due giorni. La vitalità cellulare può diminuire durante la prima scissione, due giorni dopo la trasfezione. Tipicamente, le cellule si riprendono 4 giorni dopo la trasfezione e iniziano a proliferare, con un tempo di raddoppio di 48 ore.
Dopo il recupero, vengono misurate le e...
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Discussione
Il protocollo fornito offre un metodo semplice e affidabile per la creazione di cellule CAR-NK che prendono di mira i patogeni fungini utilizzando il sistema di trasposone non virale della Bella Addormentata. Questo metodo consente l'inserimento stabile e permanente di grandi transgeni, che consente l'espansione delle cellule per ottenere le quantità necessarie per ulteriori analisi 14,16.
Diversi fatt...
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Dichiarazioni
M.H.: Inventore di domande di brevetto e brevetti concessi relativi alla tecnologia CAR, concessi in parte in licenza all'industria. Co-fondatore e azionista T-CURX GmbH, Würzburg. Relatori onorari: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Supporto alla ricerca: BMS. M. B. riporta il supporto di viaggio della società farmaceutica "Eli Lilly and company", che non è correlato a questo studio. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il finanziamento e il supporto per il progetto sono stati forniti da Wilhelm Sander Stiftung, project 2020.017.1 a M.H. e J.L.; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Centro di ricerca collaborativa/Transregio 124 Funghi patogeni e il loro ospite umano: Reti di interazione-FungiNet; progetto A8 a M.H. e H.E.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette a fondo conico da 15 ML | Greiner Bio-One | 188271 | PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE Provette |
| a fondo conico da 50 ML | Greiner Bio-One | 227270 | PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE Piastra |
| coltura cellulare a 6 e 96 pozzetti | Corning Inc. LifeSciences | 83-3736/ 83-3474 | Piastre a pozzetti multipli trattate con TC, fondo piatto, trattate per un fissaggio ottimale delle cellule, sterilizzate mediante irradiazione gamma, |
| 7-AAD (7-amminoactinomicina D) | BD biosciences | 559925 | colorante di acido nucleico facile da usare per l'esclusione di cellule non vitali in saggi citometrici a flusso |
| Alexa Fluor 647 anticorpo EGFR umano | Biolegend | 352918 | clone AY13 |
| Microsfere anti-biotina UltraPure | Miltenyi Biotec | 130-105-637 | Microsfere ultrapure coniugate a topo monoclonale anti-biotina anticorpi |
| Aspergillus fumigatus | ATCC | 46645 | |
| Puntali filtranti per biosfera (20 e 100 μ L) | Sarstedt | 70.3030.365 / 70.3030.275 | |
| Dulbecco′ s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Modificato, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, liquido, filtrato sterile, adatto alla coltura cellulare, endotossina, testato |
| ELISA MAX Deluxe Set IFN umano-γ | Biolegend | dell'acido | |
| etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | per biologia molecolare, 0,5 M in H2O, DNasi, RNasi, NICKasi e proteasi, nessuna rilevata, 0,2 μ m filtrato. |
| FACS clean | BD Biosciences | 340345 | |
| FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS Soluzione di risciacquo | BD Bioscience | 340346 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | filtrato sterile, adatto per colture cellulari, inattivato a caldo prima dell'uso |
| Gibco, MEM α, nucleosidi | Thermofisher Scientific | 22571020 | Rosso fenolo, Ribonucleosidi, Desossiribonucleosidi, Bicarbonato di sodio |
| Siero di cavallo | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | Filtrato sterile, inattivato a caldo prima dell'uso |
| IL-2 umana IS, grado di ricerca | Miltenyi Biotec | 130-097-742 | Grado di ricerca. L'ED50 è ≤ 0,3 ng/mL, corrispondente a un'attività di ≥ 3 &volte; 106 UI/mg. |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | da Streptomyces conglobatus, usato come controllo positivo per la secrezione di citochine. |
| L-Glutammina | Sigma-Aldrich | W368401 | Per colture cellulari |
| Colonna MACS LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Colonne e pistoni in confezione sterile |
| NK-92 | DSMZ | ACC 488 | |
| Neon Transfektionssystem 100 μ L-Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Tampone di Risospensione R, Tampone Elettrolitico E2, 100 μ L Punte al neon, tubi per elettroporazione al neon |
| Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | utilizzato come controllo positivo per la secrezione di citochine |
| Provetta in polistirene a fondo tondo, 5 mL | BD Bioscience | S-452400 | utilizzata per citometria a flusso |
| Provetta di reazione, 1,5 ML | Greiner Bio-One | 7,26,90,001 | PP, trasparente, tappo attaccato, con graduazione iniettata. Sterilizzato prima dell'uso. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 72400021 | GlutaMax I, Rosso fenolo, HEPES, TipOne |
| 1000 con filtro sterile μ Puntale con filtro graduato L XL | StarLab S1122-1730 | ||
| Equipment | |||
| BD FACSCalibur | BD Bioscience | ||
| CO2 Incubatore C60 | Labotect | ||
| Heraeus Multifuge 3SR | Thermo Scientific | ||
| IdroFLEX lavatrice per micropiastre | Tecan | ||
| NanoQuant Infinite M200 Pro | Tecan | ||
| Neon Transfection System | Invitrogen | ||
| Pipettes | Separatore Eppendorf | ||
| Quadro MACS | Miltenyi Biotec |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
