Articolo metodologico

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

DOI:

10.3791/67438

⸱

14 febbraio 2025

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un metodo per differenziare ed espandere le cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) derivato da iPSC umano con una migliore uccisione contro vari tumori maligni. Questo protocollo dimostra la differenziazione e l'espansione di cellule CAR-NK derivate da iPSC ottimizzate per natural killer (NK) e la misurazione dell'attività antitumorale contro varie linee cellulari tumorali.

Abstract

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Le cellule natural killer (NK) sono cellule immunitarie innate che svolgono un ruolo cruciale nella difesa dell'organismo contro i tumori e le infezioni virali. La generazione di cellule NK che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) derivato da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) è emersa come una strada promettente per l'immunoterapia del cancro "pronta all'uso". Qui, abbiamo utilizzato un costrutto CAR ottimizzato per le cellule NK che include il dominio transmembrana di NKG2D, il dominio co-stimolatorio 2B4 e il dominio di segnalazione CD3ζ, che ha dimostrato di stimolare una robusta attività antitumorale mediata dalle cellule NK antigene-specifiche. L'uso di iPSC per la generazione di cellule CAR NK offre diversi vantaggi, tra cui l'espressione omogenea di CAR, la scalabilità, la riproducibilità e il potenziale per l'applicazione clinica. Questo dettagliato protocollo passo-passo, dall'ingegneria cellulare alla differenziazione, consente la generazione di cellule NK CAR che esprimono iPSC ottimizzate per le cellule NK, fornendo un'immunoterapia antitumorale standardizzata e mirata con una migliore attività antitumorale e evidenziando il loro potenziale come promettente opzione terapeutica per vari tumori maligni.

Introduzione

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Le cellule NK, un tipo di linfocita all'interno del sistema immunitario innato, sono fondamentali nella difesa precoce contro i tumori e le cellule infettate viralmente 1,2,3. A differenza delle cellule T, le cellule NK non richiedono la presentazione dell'antigene attraverso le molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC). Invece, le cellule NK hanno un repertorio di recettori attivanti e inibitori che regolano la loro attività3. L'attività citotossica mediata dalle cellule NK utilizza vari meccanismi, tra cui il rilascio di perforina e granzimi, l'impegno dei recettori di morte e la produzione di citochine pro-infiammatorie come l'IFN-γ e il TNF-α. Questa modalità d'azione unica posiziona le cellule NK come un candidato attraente per l'immunoterapia del cancro, in particolare nel trattamento dei tumori solidi in cui l'evasione immunitaria è un ostacolo significativo 1,2,3,4.

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è una delle forme più comuni e mortali di cancro al fegato in tutto il mondo5. Gli approcci terapeutici tradizionali, tra cui la chirurgia, la chemioterapia e la radioterapia, in genere forniscono un beneficio clinico limitato e si traducono in alti tassi di recidiva 6,7. I recenti progressi nell'immunoterapia e nella terapia mirata hanno avuto un impatto significativo sul trattamento dell'HCC 8,9. Gli inibitori del checkpoint immunitario, come nivolumab e pembrolizumab, hanno mostrato risultati promettenti migliorando la risposta delle cellule immunitarie contro le cellule tumorali10,11. Queste terapie hanno portato a un miglioramento dei tassi di sopravvivenza e a una migliore qualità della vita per alcuni pazienti. Tuttavia, possono anche causare effetti avversi immuno-correlati, che possono limitarne l'uso in alcuni pazienti12. Le terapie mirate, come sorafenib e lenvatinib, inibiscono specificamente i percorsi che promuovono la crescita delle cellule tumorali e l'angiogenesi13. Questi trattamenti hanno un'efficacia nota nel controllare la progressione della malattia e prolungare la sopravvivenza 8,14. Tuttavia, in genere si sviluppa resistenza alle terapie mirate e gli effetti collaterali del trattamento sono comuni 15,16. Tra le strade promettenti nelle strategie immunoterapeutiche del cancro, l'avvento delle cellule CAR T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) ha rivoluzionato il trattamento del cancro, in particolare nel trattamento delle neoplasie ematologiche come il linfoma e il mieloma multiplo 17,18,19.

Le cellule NK che esprimono CAR, combinando l'attività citotossica innata delle cellule NK con il targeting di precisione della tecnologia CAR, rappresentano un approccio innovativo e potenzialmente trasformativo per tumori solidi come HCC 20,21,22,23,24. Le cellule ingegnerizzate con CAR possono riconoscere e uccidere in modo specifico le cellule tumorali che esprimono l'antigene bersaglio risparmiando i tessuti normali, riducendo così il rischio di effetti off-target associati alle terapie convenzionali 25,26,27. Le cellule CAR-NK prodotte da cellule NK isolate dal sangue periferico o dal sangue del cordone ombelicale sono tipicamente prodotte trasducendo cellule NK con costrutti CAR che consistono in un dominio di riconoscimento dell'antigene extracellulare, un dominio transmembrana e domini di segnalazione intracellulare necessari per l'attivazione e la proliferazione 28,29,30.

La sfida di ingegnerizzare una popolazione stabile e omogenea di cellule NK funzionalmente ingegnerizzate per il trattamento clinico può essere affrontata impiegando cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)31,32. L'ingegnerizzazione di iPSC umane con CAR ottimizzate per le cellule NK fornisce un migliore segnale di attivazione e proliferazione delle cellule NK e fornisce una popolazione inesauribile e omogenea di cellule NK che esprimono CAR come terapia standardizzata e "pronta all'uso"20,33. In questo protocollo, la modificazione genetica delle iPSC per generare cellule NK derivate da iPSC che esprimono CAR comporta l'integrazione di un costrutto CAR ottimizzato per le cellule NK che include domini transmembrana e di segnalazione derivati dalle cellule NK (NKG2D-2B4-CD3ζ) e un scFv anti-glipicano-3 (GPC3) come descritto nei nostri studi precedenti23. Le iPSC geneticamente modificate vengono quindi differenziate ed espanse utilizzando un protocollo di differenziazione delle cellule NK sviluppato in precedenza34. Queste cellule NK derivate da iPSC che esprimono CAR ingegnerizzate hanno la capacità di riconoscere ed eliminare l'HCC e altre cellule tumorali che esprimono specifici antigeni associati al tumore, come il Glypican 3 (GPC3), che è sovraespresso nell'HCC e in altre neoplasiemaligne 35,36,37,38.

L'applicazione di cellule CAR-NK derivate da iPSC per il trattamento di diversi tumori è molto promettente 30,39,40; molte di queste cellule CAR-NK derivate da iPSC sono attualmente in fase di sperimentazione clinica 41,42,43. Per facilitare il progresso in questo settore, questo protocollo consente una produzione efficiente di cellule CAR-NK ingegnerizzate derivate da iPSC, dall'ingegneria cellulare alla differenziazione in cellule NK mature e all'espansione in vitro.

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Protocollo

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1. Metodo di coltura senza alimentatore di iPSC umane

NOTA: Scongelare le iPSC umane indifferenziate congelate e coltivarle con l'uso di mTeSR 1-plus su piastre pre-rivestite Matrigel (d'ora in poi denominate matrice di membrana basale [BMM]), come precedentemente descritto23,34. È molto importante assicurarsi che le iPSC non siano differenziate prima e dopo l'ingegnerizzazione. Le iPSC appena scongelate devono essere coltivate per circa 2-3 passaggi per mostrare una morfologia pluripotente coerente con le cellule staminali pluripotenti umane. Le seguenti istruzioni vengono utilizzate per il passaggio di cellule da un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.

  1. Prima di passare le iPSC, rivestire la nuova piastra a 6 pozzetti con 1x BMM (1 mL/pozzetto) e incubare in un incubatore a 37 °C per 2-4 ore prima dell'uso.
  2. Preparare 1x BMM solubilizzato.
    1. Scongelare un flaconcino da 5 ml di BMM a 4 °C per una notte.
    2. Aliquotare rapidamente il BMM utilizzando puntali pre-raffreddati in provette da microcentrifuga pre-raffreddate.
    3. Conservare a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
    4. Per preparare 1x soluzione di lavoro BMM, risospendere un'aliquota BMM in rapporto 1:100 in un mezzo DMEM/F12 freddo. La soluzione di lavoro 1x BMM può essere conservata a -4 °C per 2 settimane.
    5. Rivestire la piastra con un volume sufficiente a coprire la superficie (ad esempio, utilizzare 1 mL per pozzetto di piastra a 6 pozzetti).
    6. Incubare in incubatore a 37 °C per 2-4 ore prima dell'uso.
  3. Scongelare un flaconcino di iPSC congelate (tipicamente 1 × 106 cellule/flaconcino) in un bagno d'acqua a 37 °C.
  4. Aggiungere gradualmente le iPSC scongelate in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di terreno mTeSR Plus preriscaldato, consentendo alle cellule di acclimatarsi aggiungendole goccia a goccia per ridurre al minimo lo shock cellulare.
  5. Centrifugare le celle a 300 × g per 5 min.
  6. Aspirare il surnatante e lavare le cellule una volta con 5 mL di PBS.
  7. Risospendere le cellule nel terreno mTeSR Plus e piastrle a una densità di circa 200.000 cellule/3 mL/pozzetto nella piastra a 6 pozzetti prerivestita BMM.
  8. Passaggio iPSC.
    1. Una volta che le iPSC raggiungono la confluenza del 70-80%, aspirare il terreno ed eseguire il passaggio di singole cellule con TrypLE per 5 minuti a 37 °C (1 mL/pozzetto in piastra a 6 pozzetti).
    2. Dopo 5 minuti, aggiungere 3 mL di 1x PBS per fermare la reazione di dissociazione e lavare le cellule una volta con 3 mL di PBS.
    3. Centrifugare le celle a 300 × g per 5 min. Dopo il lavaggio, risospendere le iPSC a cellula singola in terreno mTeSR Plus, quindi piastrarle su una piastra a 6 pozzetti prerivestita BMM.
      NOTA: Il volume totale del terreno richiesto è di 3 ml/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Il terreno deve essere cambiato ogni 2-3 giorni e il passaggio 1.8 deve essere ripetuto quando le cellule diventano confluenti al 70-80% per almeno 1-2 passaggi prima di ingegnerizzare le iPSC.
  9. Controllare regolarmente la pluripotenza delle iPSC. Colorare le iPSC con l'anticorpo TRA-1-81 coniugato con alloficocianina (APC) e l'antigene embrionale coniugato PE-Cy7 stadio-specifico (SSEA-4) per 30 minuti su ghiaccio, quindi analizzarle utilizzando la citometria a flusso come descritto in precedenza23,41.
    NOTA: Le iPSC utilizzate in questo esperimento sono adattate a TrypLE. Le iPSC che non sono state precedentemente passate con TrypLE richiedono in genere 8-10 passaggi per adattarsi completamente a TrypLE, il che garantisce la produzione di corpi embrioidi di spin (EB) di alta qualità.

2. Ingegnerizzazione di iPSC umane per esprimere CAR anti-GPC3 utilizzando il vettore piggyBac

  1. Rivestire una nuova piastra a 6 pozzetti con BMM e incubare a 37 °C per almeno 1 ora (può essere più lungo finché il liquido non si asciuga).
  2. Preriscaldare mTeSR Plus con 10 μM associato a Rho, bobina a spirale contenente inibitore della proteina chinasi (ROCK) (Y-27632) (da 1 mM di stock preparato in acqua distillata sterile) a 37 °C.
  3. Attiva il sistema Nucleofection. Selezionare l'unità X, quindi selezionare le posizioni dei pozzetti da trasfettare. Scegli la soluzione P3 e inserisci manualmente il codice (CA-137).
  4. Raccogliere le iPSC alla confluenza del 70-80% con 1 mL di TrypLE e incubare a 37 °C per 5 minuti. Controllare al microscopio per confermare la dissociazione.
  5. Pipettare 4-6 volte per ottenere una sospensione a singola cellula, quindi neutralizzare con 5 mL di PBS e pellet a 300 × g per 5 min.
  6. Lavare delicatamente le celle ancora una volta per rimuovere ogni traccia di TrypLE.
  7. Risospendere in 1 mL di mTeSR Plus con Rock-Inhibitor e contare le cellule.
  8. Per creare iPSC CAR anti-GPC3, utilizzare 1 × 106 cellule per trasfezione in una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 300 × g per 5 minuti.
  9. Durante la rotazione, combinare il DNA del trasposone che esprime CAR con il vettore di espressione della super trasposisi PiggyBac in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml a un rapporto di 3:1 (ad esempio, 3 μg di plasmide contenente il trasposone per 1 μg di plasmide trasposasi).
  10. Includere un controllo positivo alla proteina fluorescente verde (GFP) (Tabella dei materiali) utilizzando 0,5 μL di soluzione da 1 mg/mL e un controllo negativo non trasfettato per confermare l'espressione della GFP.
  11. Risospendere accuratamente il pellet cellulare in 20 μL di soluzione di nucleofettore P3 a temperatura ambiente (RT) con l'integratore fornito nel kit di nucleonucleazione. Quindi, aggiungere questa miscela a una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml contenente DNA plasmidico, ottenendo un volume finale di circa 22-25 μl.
    NOTA: Risospendere tutte le iPSC da trasfettare nella soluzione di nucleofector P3 prima di aggiungere i plasmidi CAR GPC3 o il plasmide di controllo GFP alle cellule.
  12. Trasferire la sospensione di cellule/DNA in strisce da 20 μl a 16 pozzetti. Assicurarsi che il campione copra il fondo della cuvetta senza bolle.
  13. Picchiettare delicatamente le strisce a 16 pozzetti sul piano di lavoro per rimuovere eventuali bolle d'aria e depositare le celle sul fondo.
  14. Posizionare le strisce a 16 pozzetti contenenti iPSC e la miscela di DNA CAR nel sistema di nucleofezione, selezionare il programma CA-137, la soluzione P3 e quindi avviare il programma. Questo programma terminerà in 1 s e mostrerà un segno di spunta verde.
  15. Aggiungere 80 μL di mTeSR Plus preriscaldato con terreno ROCK-Inhibitor al pozzetto e trasferire con cura le cellule nella piastra a 6 pozzetti rivestita con BMM (volume finale 1 mL per pozzetto).
  16. Controllare brevemente le cellule al microscopio a fluorescenza dopo 4 ore per verificare la presenza di qualsiasi espressione di GFP per confermare il tasso di successo della trasfezione.
  17. Screening delle iPSC per l'espressione di GFP per valutare l'efficienza della trasfezione 24 ore dopo la trasfezione utilizzando la citometria a flusso23,41 per confermare l'espressione di GFP.
  18. Incubare per 4 giorni a 37 °C, cambiando il terreno secondo necessità prima di procedere alla selezione del farmaco.
    NOTA: Ogni nucleofezione richiede 0,2-2 x 106 iPSC per reazione. A seconda del numero di reazioni, è possibile utilizzare piastre a 24 pozzetti o piastre a 6 pozzetti.

3. Selezione clonale e conferma della pluripotenza delle iPSC GPC3-CAR

  1. Eseguire una serie di selezioni di zeocin (1:10.000) sulle iPSC trasfettate per selezionare clonalmente le iPSC che esprimono GPC3-CAR.
  2. Per confermare l'efficienza della trasfezione, misurare l'espressione della GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza e la citometria a flusso23,41.
    NOTA: Il costrutto CAR è incorporato con un tag FLAG 44,45 allo scopo di valutare l'espressione di CAR sia durante la fase iPSC che dopo la differenziazione delle cellule NK.
  3. Mantenere le iPSC CAR trasfettate sotto selezione farmacologica fino a quando non raggiungono un'espressione ottimale del gene CAR e della GFP.
  4. Per garantire un'espressione omogenea di GFP e CAR, prolungare la durata della selezione del farmaco per 2-3 settimane.
  5. Eseguire la selezione cellulare in base all'espressione di GFP o CAR utilizzando la citometria a flusso per ottenere una popolazione omogenea di iPSC23 selezionate clonalmente.
  6. Il costrutto CAR utilizzato qui contiene un marcatore di selezione del farmaco zeocina. Selezionare le cellule trasfettate del gene GPC3 CAR aggiungendo zeocina (50 μg/mL di zeocina) al terreno di coltura.
  7. Dopo la selezione della zeocina, diluire le iPSC trasfettate dal gene GPC3 CAR e piastrelarle in una piastra a 96 pozzetti per ottenere circa una cellula per pozzetto. Questo può essere fatto attraverso la diluizione seriale o utilizzando un selezionatore di cellule.
    NOTA: Utilizzare la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per isolare singole cellule trasfettate in base all'espressione di un marcatore fluorescente legato al costrutto CAR.
  8. Lasciare che le singole cellule si espandano in colonie nella piastra a 96 pozzetti.
  9. Nutrire le cellule con terreno di coltura fresco ogni 3-4 giorni una volta e monitorare i pozzetti per la crescita delle colonie.
  10. Screening delle colonie per l'espressione CAR. Questo può essere fatto mediante reazione a catena della polimerasi (PCR), reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) o Western blotting per verificare la presenza del costrutto CAR23,47.
  11. In alternativa, utilizzare la citometria a flusso23,41 per rilevare l'espressione superficiale della proteina CAR.
    NOTA: In questo studio, l'espressione CAR è stata quantificata mediante l'espressione del tag FLAG utilizzando la citometria a flusso.
  12. Inoltre, eseguire il cariotipo per identificare eventuali anomalie cromosomiche.
    NOTA: Questa operazione può essere eseguita da organizzazioni di terze parti come Wicell (wicell.org) o Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com).
  13. Una volta identificati i cloni CAR-positivi senza alcuna anomalia, espandere questi cloni in recipienti di coltura più grandi come la piastra a 6 pozzetti e il pallone T75.
  14. Crioconservare le iPSC CAR espanse clonalmente utilizzando un mezzo di crioconservazione in più fiale per un uso futuro.
    NOTA: In questa fase si raccomandano i seguenti punti: (i) Mantenere le condizioni di coltura ottimali per le iPSC per prevenire la differenziazione. (ii) Attendere 1-4 settimane per ottenere una popolazione omogenea di espressione di CAR e GFP nelle iPSC dopo la selezione del farmaco. (iii) Continuare a monitorare le cellule per la stabilità dell'espressione CAR e i marcatori di pluripotenza. iv) Utilizzare controlli adeguati durante le fasi di screening e verifica. (v) Dopo la selezione clonale e l'espansione, verificare la pluripotenza valutando l'espressione di TRA-1-81 e SSEA-4 sulle iPSC che esprimono CAR.

4. Generazione di cellule progenitrici ematopoietiche da iPSC CAR ingegnerizzate mediante formazione di corpi embrioidi di spin (EB)

NOTA: Un protocollo di spin EB o organoide ematopoietico viene utilizzato per produrre progenitori ematopoietici23,34. Le cellule all'interno degli EB si differenziano in cellule stromali per supportare lo sviluppo dei linfociti38, eliminando così la necessità di cellule stromali derivate da xeno come OP9 23,34,48. Di seguito sono riportate le istruzioni per la raccolta delle cellule da un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per la formazione di EB.

  1. Passaggio di ~200.000 cellule/pozzetto di piastra pre-rivestita BMM a 6 pozzetti 2 giorni prima della formazione dello spin EB. Assicurarsi che raggiunga il 70-80% di confluenza il giorno della configurazione degli EB di rotazione. Generalmente, 1 pozzetto di una piastra a 6 pozzetti è sufficiente per due piastre di spin EB.
  2. Rimuovere il terreno di coltura e staccare le cellule incubando con 1 mL di TrypLE Select preriscaldato a 37 °C per 5 min.
  3. Dissociare accuratamente gli aggregati cellulari in una sospensione di una singola cellula utilizzando una micropipetta da 1 mL e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere 3 mL di 1x PBS per fermare la reazione di dissociazione e lavare le cellule una volta con 3 mL di PBS.
  4. Risospendere le cellule nel terreno mTesR Plus e filtrarle attraverso un filtro cellulare da 70 μM per rimuovere gli aggregati.
  5. Centrifugare le cellule per rimuovere il surnatante e lavare nuovamente le cellule con 5 ml di PBS. Quindi risospendere le cellule in 1 mL di terreno STEMdiff APEL (terreno di formazione EB).
  6. Contare e diluire le cellule alla densità appropriata utilizzando il terreno di formazione EB contenente le seguenti citochine (SCF: 40 ng/mL, BMP4: 20 ng/mL, VEGF: 20 ng/mL) più 10 μM di inibitore ROCK.
  7. Seminare 3000-10000 cellule/pozzetto in 100 μL di terreno (100.000 cellule/mL) nelle piastre a 96 pozzetti.
    NOTA: Il numero di cellule utilizzate nella formazione dell'EB può variare a seconda della linea iPSC. Si consiglia di testare tra 3.000 e 10.000 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti.
  8. Utilizzando una pipetta multicanale, caricare la sospensione cellulare in piastre a 96 pozzetti a 100 μL/pozzetto.
    NOTA: Per una migliore formazione di corpi embrioidi (EB), si consiglia di utilizzare piastre a fondo tondo a 96 pozzetti con attacco ultrabasso.
  9. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 300 × g per 5 minuti, quindi incubare le piastre a 37 °C con CO2 al 5% per 6 giorni.
    NOTA: Studi preliminari hanno scoperto che 6 giorni sono sufficienti per dare origine al >30% di cellule CD34+ per le linee CAR iPSC in questo studio.
  10. Controllare la qualità dell'EB mediante citometria a flusso23,41.
    1. Preparare 4 ml di tripsina preriscaldata allo 0,25% con siero di pollo allo 0,4% (16 μl per 4 ml di tripsina) per dissociare gli EB.
    2. Trasferire 10-30 EB in una provetta conica da 15 mL.
    3. Aggiungere la soluzione di tripsina/siero di pollo agli EB e incubare a bagnomaria per 10 minuti, agitando ogni 30 s per garantire la completa dissociazione degli EB.
    4. Pipettare gli EB tripsinizzati. Mescolare su e giù più volte per dissociare completamente l'EBS.
    5. Aggiungere 5 ml di 1x PBS per interrompere il processo di tripsinizzazione.
    6. Filtrare la soluzione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un nuovo tubo conico.
    7. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min.
    8. Aspirare il surnatante e risospendere in 3-5 ml di terreno fresco.
    9. Contare le cellule, colorarle con i tipici marcatori EB come CD34, CD31, CD43 e CD45 e analizzarle utilizzando la citometria a flusso23,41 (Figura 3).
    10. Aggiungere il volume raccomandato di anticorpi secondo le istruzioni del produttore a ciascuna provetta contenente singole cellule dissociate di EB in 100 μl di tampone di flusso e incubare su ghiaccio per 30 minuti 39,41.
    11. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con il tampone di flusso, aggiungere la colorazione blu viva/morta SYTOX e analizzare utilizzando la citometria a flusso.
      NOTA: Tipicamente, il >30% delle cellule CD34+ viene ottenuto dalla popolazione totale di corpi embrioidi di Spin dissociati il giorno 6 utilizzando le iPSC utilizzate in questo studio, sebbene questa percentuale possa variare a seconda della fonte di iPSC e delle condizioni di coltura.

5. Differenziamento di cellule NK derivate da GPC3 CAR iPSC da Spin EB

NOTA: Gli Spin EB GPC3 che esprimono CAR possono essere trasferiti in piastre a 24 pozzetti o piastre a 6 pozzetti rivestite con gelatina al 2% o senza rivestimento. Per le variazioni medie, le piastre a 6 pozzetti sono più adatte, mentre il rivestimento in gelatina al 2% migliora l'adesione degli EB.

  1. Preparare le piastre a 6 pozzetti ricoperte di gelatina seguendo i passaggi seguenti.
    1. Preparare una soluzione di gelatina al 2% (p/v) sciogliendo la gelatina in acqua di coltura tissutale.
    2. Sterilizzare la soluzione in autoclave a 121 °C, 15 psi per 30 min.
    3. Rivestire la superficie di ciascun pozzetto con 5-10 μL di soluzione di gelatina per cm2 (~1 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti).
    4. Incubare le piastre a 37 °C per 2-4 ore prima dell'uso. Dopo l'incubazione, aspirare l'eventuale soluzione di gelatina rimanente prima di procedere con il trasferimento degli EB.
  2. Preparare il terreno di differenziazione delle cellule NK: aggiungere il 56,6% di DMEM+ GlutaMAX-I, il 28,3% di F12+ GlutaMAX-I, il 15% di siero AB umano inattivato termicamente, l'1% di P/S, 2 mM di L-glutammina, 1 μM di β-mercaptoetanolo, 5 ng/mL di selenito di sodio, 50 μM di etanolammina e 20 mg/L di acido ascorbico. Conservare a 4 °C al buio.
  3. Aggiungere 3 mL di terreno di differenziazione NK contenente le seguenti citochine a ciascun pozzetto delle piastre a 6 pozzetti rivestite di gelatina (IL-3: 5 ng/mL, SCF: 20 ng/mL, IL-7: 20 ng/mL e IL-15: 10 ng/mL).
  4. Il giorno 6, trasferire gli Spin EB direttamente nelle piastre a 6 pozzetti rivestite di gelatina preparate contenenti terreno di differenziazione NK seguendo i passaggi seguenti.
    1. Trasferire con cura gli EB da piastre da 96 pozzetti a una piastra da 10 cm, utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml per rimuovere la maggior parte del terreno.
    2. Aggiungere 3 mL di terreno di differenziazione NK contenente le citochine di cui sopra a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti rivestita di gelatina.
    3. Distribuire 16-20 EB in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti utilizzando una micropipetta da 1 mL.
      NOTA: In media, gli EB di una singola piastra a 96 pozzetti possono essere utilizzati per seminare una piastra a 6 pozzetti per la piastra di differenziazione NK.
  5. Eseguire cambi medi ogni 5-7 giorni. Dopo la prima settimana di differenziazione delle cellule NK, escludere IL-3 dal terreno.
    NOTA: Dopo 14 giorni, il mezzo deve essere cambiato ogni 3-4 giorni.
  6. Continuare i cambi medi per 3-4 settimane. Valutare l'espressione di marcatori cellulari NK (CD45+CD56+) mediante citometria a flusso24,42 su cellule in sospensione.
  7. Quando >80% delle cellule in sospensione esprime CD45+CD56+, raccogliere le cellule facendole passare attraverso un filtro da 70 μm per rimuovere eventuali grumi.
  8. La co-coltura ha raccolto cellule NK con 100 aAPC34,48 grigie irradiate e coltura in terreno di espansione NK contenente IL-2 (100ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL).

6. Espansione di cellule NK derivate da iPSC CAR anti-GPC3

NOTA: Tipicamente, da una singola piastra a 6 pozzetti si può ottenere una resa di 2-20 × 10celle NK , anche prima dell'espansione. Per facilitare l'ulteriore espansione delle cellule NK per le applicazioni a valle, vengono impiegate cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC) per generare >1 × 109 cellule NK.

  1. Utilizzare cellule K562 ingegnerizzate che esprimono 41BBL e IL-21 legata alla membrana (41BBL-mbIL-21)48 come aAPC per indurre l'espansione delle cellule NK.
  2. Prima di co-coltivare aAPC con cellule NK, irradiare aAPC con 100 gray e conservarle come ceppi congelati.
  3. Raccogliere le cellule in sospensione dalla piastra a 6 pozzetti e coltivare le cellule NK in un terreno di espansione NK integrato con 50 U/mL di IL-2 e IL-15 (10 ng/mL; da aggiungere fresco) a una densità di 5 × 105 cellule/mL.
  4. Aggiungere aAPC irradiate scongelate alle cellule NK con un rapporto 1:1.
  5. Reintegrare il terreno di coltura ogni 3-4 giorni, aggiungendo IL-2 e IL-15 freschi a una concentrazione di 50 U/mL e 10 ng/mL, rispettivamente.
  6. Assicurarsi che le cellule NK derivate da CAR iPSC mantengano la capacità di espansione per un periodo di >3 mesi, mantenendo sia la vitalità cellulare che l'attività citolitica.

7. Caratterizzazione fenotipica e funzionale di cellule NK GPC3 CAR derivate da iPSC

NOTA: La caratterizzazione delle cellule NK derivate da GPC3 CAR iPSC comporta una valutazione completa del loro profilo fenotipico e della loro attività funzionale.

  1. Valutare l'espressione dei recettori di attivazione NK, tra cui CD45, CD56, CD94, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM, TRAIL e FasL, sulle cellule NK derivate da iPSC CAR anti-GPC3 attraverso la citometria a flusso24,42 per determinare l'attività delle cellule CAR NK e lo stato di maturazione (Figura 4).
  2. Valutare l'attività funzionale in vitro delle cellule NK derivate da GPC3 CAR iPSC utilizzando saggi Caspase-3/7 basati sulla citometria a flusso, saggi di rilascio di granuli CD107a, saggi di rilascio di citochine IFN-γ e TNF-α contro vari bersagli tumorali.
  3. Per il test Caspase3/7, seguire i passaggi seguenti.
    1. Contare le cellule bersaglio e precolorarle con colorante fluorescente per tracciatura cellulare a una concentrazione finale di 5 μM in PBS per 15 minuti a 37 °C.
    2. Lavare le cellule bersaglio colorate in un terreno di coltura completo prima della co-coltura con cellule NK derivate da CAR iPSC a vari rapporti effettore-bersaglio (E:T) a 37 °C.
    3. Dopo 3 ore e 30 minuti di co-coltura, aggiungere il reagente di rilevazione verde Caspasi-3/7 per altri 30 minuti di incubazione, ottenendo un tempo di incubazione totale di 4 ore.
    4. Aggiungere 1 μL di soluzione di colorazione delle cellule morte durante gli ultimi 5 minuti di colorazione e mescolare delicatamente.
    5. Analizzare le cellule colorate utilizzando la citometria a flusso23,41 (Figura 5).
  4. Implementare questo protocollo per garantire una comprensione completa delle caratteristiche fenotipiche e dell'attività funzionale delle cellule NK derivate da GPC3 CAR iPSC, consentendo una solida valutazione del loro potenziale terapeutico.
    NOTA: In genere sono necessarie 4-5 settimane per ottenere il >90% di cellule CD45+CD56+ da GPC3 CAR derivate da iPSC basate su spin EB, differenziazione di cellule NK derivate da iPSC e condizioni di espansione NK utilizzando linee GPC3 CAR iPSC. Alcune linee cellulari iPSC potrebbero richiedere solo 3 settimane e alcune linee potrebbero richiedere più tempo (circa 4-5 settimane).

8. Risoluzione dei problemi e soluzioni

NOTA: La risoluzione dei problemi relativi alla differenziazione, all'espansione e al test funzionale delle cellule CAR NK GPC3 derivate da iPSC utilizzando il metodo del corpo embrioide di spin (EB) può comportare diversi passaggi. Di seguito sono riportati alcuni problemi comuni che si possono incontrare, insieme alle soluzioni suggerite:

  1. Sintomi di formazione incoerente di EB
    1. Controlla se gli EB sono troppo piccoli o troppo grandi, con forme irregolari.
  2. Soluzione per la formazione incoerente di EB
    1. Regolare la velocità e la durata della centrifuga utilizzate per formare gli EB. Una velocità di circa 200-300 × g per 5-10 minuti è tipica.
    2. Assicurarsi che vengano utilizzate le piastre con fondo a U appropriate o le piastre di coltura a bassissimo attacco per facilitare la formazione di EB.
    3. Confermare che le iPSC siano omogenee e prive di cellule differenziate che potrebbero influenzare la formazione di EB.
  3. Sintomi di una scarsa differenziazione delle iPSC in cellule NK
    1. Verificare la presenza di una bassa espressione dei marcatori delle cellule NK (ad es. CD56, NKp46).
    2. Verificare la mancata formazione di EB o EB mal formati.
  4. Soluzione per la scarsa differenziazione delle iPSC in cellule NK
    1. Assicurarsi che le concentrazioni di fattori di crescita essenziali (ad es. VEGF, BMP4, Y-27632, FLT3, IL-15, IL-7, SCF e IL-3) siano ottimali per la formazione di EB e la differenziazione delle cellule NK. Regolare le concentrazioni in base a studi precedenti 23,34,41.
    2. Assicurarsi che la densità di semina iniziale delle iPSC sia appropriata. In genere, per la formazione di spin EB si raccomanda una densità di 8000-10.000 cellule/100 μl.
    3. Verificare che il mezzo di differenziazione sia formulato correttamente, compresi gli integratori necessari (ad esempio, alternative al siero o senza siero, altre citochine).
    4. Attendere un tempo sufficiente per la formazione di EB, da un minimo di 6 giorni a un massimo di 12 giorni prima di passare al terreno di differenziazione delle cellule NK.
  5. Sintomi di scarsa espansione delle cellule NK
    1. Verificare la presenza di una resa limitata delle celle durante l'espansione.
    2. Verificare la ridotta vitalità delle cellule NK espanse.
  6. Soluzioni per la scarsa espansione delle celle NK
    1. Aumentare la concentrazione di IL-15 e IL-2 durante la fase di espansione. Questo può migliorare significativamente la proliferazione delle cellule NK.
    2. Prendere in considerazione l'utilizzo di cellule feeder come le aAPC irradiate per migliorare la sopravvivenza e l'espansione delle cellule NK.
    3. Monitorare regolarmente la densità cellulare e far passare le cellule prima che raggiungano il sovraffollamento per mantenere le condizioni di crescita ottimali.
  7. Sintomi di risultati dei test funzionali non ottimali
    1. Verificare la riduzione della citotossicità contro le cellule bersaglio.
    2. Verificare la presenza di bassi livelli di secrezione di citochine (ad es. IFN-γ, TNF-α).
  8. Soluzioni per risultati di test funzionali non ottimali
    1. Ottimizzare il rapporto bersaglio/effettore nei saggi di citotossicità. Inizia con un rapporto 10:1 e regola in base ai risultati.
    2. Assicurarsi che le cellule NK siano adeguatamente attivate prima dei saggi funzionali. Ciò può includere la pre-stimolazione con citochine o la co-coltura con aAPC irradiate.
    3. Verificare la sensibilità della linea cellulare bersaglio alla lisi cellulo-mediata NK. Utilizzare destinazioni sensibili note come controlli.
    4. Prolungare la durata dei saggi funzionali per consentire un tempo sufficiente per la manifestazione dell'attività delle cellule NK.
  9. Sintomi dei livelli variabili di espressione di CAR
    1. Verificare l'espressione incoerente di CAR tra le cellule NK.
  10. Soluzioni per livelli di espressione CAR variabili
    1. Verificare l'efficienza del metodo di trasfezione CAR (ad es. trasduzione virale, elettroporazione). Se necessario, regolare il MOI (molteplicità di infezioni) o le condizioni di elettroporazione.
    2. Implementare marcatori di selezione appropriati per arricchire le cellule CAR+ NK. Se necessario, utilizzare la selezione degli antibiotici o la selezione dei marcatori fluorescenti.

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Risultati

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Diagramma schematico della differenziazione e dell'espansione delle cellule NK derivate da iPSC anti-GPC3-CAR
Il diagramma schematico illustra la differenziazione in vitro di cellule NK ingegnerizzate anti-GPC3-CAR derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e una rappresentazione schematica del vettore piggyBac che trasporta il costrutto GPC3 CAR. Inizialmente, le iPSC non modificate vengono trasfettate con un vettore piggyBac che codifica per il CAR (recettore chimerico ...

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Discussione

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Questo protocollo delinea un approccio standardizzato e riproducibile per la generazione di cellule NK derivate da iPSC che esprimono CAR da una fonte cellulare coerente, con l'obiettivo di facilitare l'immunoterapia oncologica mirata "off-the-shelf". Diversi studi preclinici e clinici hanno dimostrato l'efficacia dell'immunoterapia adottiva basata su cellule NK nel trattamento dei tumori, riducendo al minimo le tossicità, come le malattie del trapianto contro l'ospite (GvHD) o la sindro...

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Dichiarazioni

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DSK è co-fondatore e consulente di Shoreline Biosciences e detiene una partecipazione azionaria nella società. DSK è anche consulente per Therabest e RedC Bio per i quali riceve reddito e/o capitale proprio. I termini di questi accordi sono stati esaminati e approvati dall'Università della California, San Diego, in conformità con le sue politiche sul conflitto di interessi. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Kaufman per il loro supporto, le intuizioni scientifiche e le discussioni. Questi studi sono stati supportati dalle sovvenzioni NIH/NCI U01CA217885, P30CA023100 (supplemento amministrativo) e dal Sanford Stem Cell Institute dell'UCSD. JT: scrittura e revisione del manoscritto. DSK: ha rivisto e curato il manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
aAPC Laboratorio di Dean A. LeeN/A
Terreno di coltura a-MEM Fisher Scientific Cat#12634
APC anti-DYKDDDDK (FLAG Tag)BD Biosciences Gatto#637308
APC-anti-umano TRA-1-81 ThermoFisher17-8883-42 
APC-CD16BD Bioscienze Gatto#302015
APC-CD43 BD BiosciencesGatto# 560198 
APC-CD45 BD BiosciencesCat# 555485 
APC-GPC3BD Bioscienze Gatto#DB100B
APC-NKG2D BD Bioscienze Gatto# 558071 
Reagente per la rilevazione del verde CellEvent Caspase-3/7 Thermo fisher Cat#C10423
Kit di proliferazione cellulare viola CellTrace Thermo fisher Cat#C34571Colorante fluorescente per tracciamento cellulare 
Soluzione CryoStor Stem Cell Technologieshttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlTerreno di crioconservazione
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-XpanderMedium Life TechnologiesCat#A5019001
DMEMGibco 11965084
DMEM, glucosio alto, integratore GlutaMAX, piruvatoGibco10569010
Kit di arricchimento di cellule NK umane EasySep Tecnologie StemCell, Inc.Gatto#19055
EtanolamminaSigma AldrichE9508
Siero fetale bovino Fisher Scientific Gatto# 10437010
FITC-CD94 BD Bioscienze Cat#555888
GlutaMAX IntegratoreGibco35050061
GolgiPlug BD Bioscienze Gatto#555029
GolgiStop BD Bioscienze Cat # 554724
Miscela di nutrienti F-12 di Ham, integratore GlutaMAXGibco31765035
siero di cavallo Fisher Scientific Gatto#16050130
Siero Umano Kit AB Sigma-AldrichCat#BP2525100
NucleofectorTM per cellule staminali umane LonzaCat# VPH-5012
Umano: cellule HePG2ATCC Gatto#HB-8065
Umano: cellule HePG2-td-tomato-luc Dan S. Kaufman labN/A
Umano: cellule iPSLaboratorio di Dan S. KaufmanN/A
Umano: cellule SNU-449ATCCCat#CRL-2234
Umano: cellule SNU-449-td-tomato-luc Dan S. Kaufman labN/A
IncuCyte Caspase-3/7 Saggio di apoptosi verde Essenbioscience Gatto # 4440
Acido L-ascorbicoSigma AldrichA5960
MP Biomedicals  Siero umano, tipo ABMP BiomedicalsICN2938249
mTeSR piùStemCell Technologies, Inc.100-0276
Software NovoExpress ACEA Biosciences 
PE/Cy7 anticorpo SSEA-4 umano Biolegend330420
PE-CD16 BD Bioscienze Gatto#560995 
PE-CD226BD Bioscienze Gatto#559789
PE-CD34 BD BiosciencesCat# 555822 
PE-CD45 BD Bioscienze Gatto# 555483 
PE-CD94 BD Bioscienze Gatto#555888 
PE-cy7-CD56 BioLegendGatto# 318318 
Legante PE-FASBD Bioscienze Gatto#564261 
PE-NKp30BD BiosciencesGatto # 558407
PE-NKp44 BD Bioscienze Gatto#558563 
PE-NKp46BD Bioscienze Gatto#331908
PE-NKp46 BD Bioscienze Gatto#557991 
Buffy coat del sangue periferico Banca del sangue di San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/) N/A
PE-TRAIL BD Bioscienze Gatto#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO Laboratorio di Branden MoriarityN/A
Plasmide pMAX-GFPLonzaN/AGFP controllo positivo 
Prisma 9Graphpad Versione 9
pSpCas9 GenScriptPX165
RBC Tampone di lisi (10x)BiolegendCat#420301
BFGF umano ricombinante di base R& Sistemi D Cat#4114-TC
BMP-4 umano ricombinante PeproTechCat#120-05
Ligando FLT-3 umano ricombinante PeproTechCat# 300-19
IL-15 umano ricombinante PeproTechCat# 200-15
IL-2 umano ricombinante PeproTechCat# 200-02
IL-3 umano ricombinante PeproTechCat#200-03
IL-7 umano ricombinante PeproTechCat# 200-07
Proteina nodale umana ricombinanteR& Sistemi D Cat#3218-ND-025
SCF umano ricombinante PeproTechCat# 300-07
TGF umano ricombinante-β 1PeproTechCat#100-21
VEGF umano ricombinantePeproTechCat# 100-20
RPMI1640 Gibco11875093
selenito di sodioSigma Aldrich214485
STEMdiff APEL 2 MediumStemCell Technologies, Inc.5270EB mezzo
di formazione STEMdiff APEL2 Medio Tecnologie StemCell, Inc.Cat#05270
Super piggyBac Vettore di espressione della trasposasiSBICat#PB210PA-1
SYTOX AADvanced Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificS10274, S10349Kit soluzione colorante per cellule morte
β-mercaptoetanoloGibco21985023
https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805

Riferimenti

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