Articolo metodologico

Sviluppo di un sistema di protoplasti di cavolo per lo studio della tolleranza all'ipossia nelle brassicacee

DOI:

10.3791/67444

⸱

20 settembre 2024

 , 
1Department of Horticulture and Landscape Architecture, National Taiwan University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un efficiente sistema di protoplasti di mesofillo di cavolo. Sono stati testati vari trattamenti carenti di ossigeno e il sistema ha mostrato un'elevata attivazione dei geni responsivi all'ipossia, facilitando gli studi sui meccanismi genetici e molecolari della tolleranza all'allagamento nelle verdure delle Brassicaceae .

Abstract

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Poiché il cambiamento climatico porta piogge più intense, il cavolo, un ortaggio chiave delle Brassicaceae , deve affrontare significative perdite di resa a causa dello stress da ipossia indotto dalle inondazioni. Per identificare i meccanismi di tolleranza alle inondazioni nei cavoli, è necessaria una piattaforma versatile per studi funzionali genetici per superare la natura recalcitrante alla trasformazione dei cavoli. In questo studio, sono stati sviluppati un sistema di espressione transitoria di protoplasti di cavolo e un corrispondente protocollo di induzione dell'ipossia di protoplasti. Questo protocollo ha raggiunto un'elevata resa e integrità dell'isolamento dei protoplasti dalle foglie di cavolo, con un'efficienza di trasfezione superiore al 40% utilizzando condizioni enzimatiche ottimizzate. Per alleviare la potenziale influenza ipossica prima dei trattamenti, la soluzione W5 è stata fatta gorgogliare con ossigeno gassoso per aumentare i livelli di ossigeno disciolto. Sono state testate diverse sostanze chimiche per la regolazione dei livelli di ossigeno e trattamenti fisiologici di eliminazione dell'ossigeno, tra cui EC-OxyRase, OxyFluor, solfito di sodio e un pacchetto di assorbitori di ossigeno. I saggi a doppia luciferasi hanno mostrato che i promotori dei geni della risposta alla respirazione anaerobica BoADH1 e BoSUS1L sono stati attivati nei protoplasti di cavolo dopo trattamenti di ipossia, con il più alto livello di induzione osservato dopo il trattamento con il pacchetto di assorbimento dell'ossigeno. In sintesi, il sistema di espressione transitoria del protoplasto di cavolo combinato con il trattamento dell'ipossia dimostra una piattaforma efficiente e conveniente. Questa piattaforma può facilitare gli studi sulla funzione genica e sui meccanismi molecolari associati alle risposte all'ipossia nei cavoli.

Introduzione

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Il cambiamento climatico globale ha esacerbato le inondazioni, che sono emerse come un problema sempre più critico in tutto il mondo. Negli ultimi decenni si è assistito a una tendenza all'aumento della frequenza degli eventi alluvionali, con conseguenti perdite sostanziali di raccolto 1,2. Il cavolo (Brassica oleracea var. capitata L.), un ortaggio di notevole importanza globale, è suscettibile agli effetti negativi delle forti piogge, rendendo necessario lo sviluppo di cultivar di cavolo resistenti alle inondazioni per garantire una produzione sostenibile di fronte a eventi meteorologici estremi. Pertanto, comprendere i meccanismi molecolari associati allo stress da inondazione nel cavolo è essenziale per affrontare questa sfida.

Per comprendere i meccanismi di regolazione genica nelle piante in condizioni sommerse, le linee transgeniche sono ampiamente utilizzate per studi funzionali genetici. Tuttavia, questo approccio è limitato dai costi elevati, dai processi di trasformazione e di sottocoltura che richiedono molto tempo, nonché dalle basse efficienze di trasformazione in molte specie di colture, che richiedono lo sviluppo di metodologie alternative. I sistemi di espressione transitoria basati su protoplasti sono stati ampiamente applicati nella ricerca molecolare sulle piante come alternativa versatile ed efficiente. Questi sistemi facilitano lo studio dell'attività del promotore, delle vie di segnalazione in risposta a stimoli ambientali, delle interazioni proteina-proteina o proteina-DNA e della localizzazione subcellulare3. La creazione di sistemi di espressione transitoria dei protoplasti è stata riportata non solo in piante modello 4,5 ma anche in colture economicamente importanti come la canna da zucchero6, il garofano7, le orchidee Phalaenopsis 8 e la melanzana9. Inoltre, questi sistemi sono stati implementati con successo in piante legnose, tra cui Camellia oleifera10e Populus trichocarpa11. Tuttavia, i protocolli per l'applicazione dei sistemi di protoplasti per studiare le verdure a foglia in condizioni di stress da ipossia indotta da immersione sono limitati. Pertanto, in questo lavoro è stato sviluppato un protocollo integrato per coloro che sono interessati a studiare le risposte all'ipossia negli ortaggi a foglia utilizzando un sistema di espressione transitoria di protoplasti di cavolo.

Per effettuare la risposta all'ipossia indotta da sommersione a livello cellulare, in studi precedenti sono state impiegate diverse metodologie di evavenging dell'ossigeno per simulare ambienti ipossici. Questi includono l'uso di EC-OxyRase, OxyFluor, solfito di sodio e sacche che consumano ossigeno. La EC-ossirasi è tipicamente utilizzata per il trattamento anaerobico nelle linee cellulari umane12 e nei protoplasti di Arabidopsis 13. OxyFluor si è dimostrato efficace nel mitigare il fotosbiancamento causato da specie reattive dell'ossigeno durante l'imaging a fluorescenza su cellule vive14,15. Il solfito di sodio è stato impiegato nel trattamento anaerobico dei nematodi16 e, più recentemente, nei protoplasti del riso, in combinazione con tecniche come i saggi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)17. I pacchetti di assorbitori di ossigeno, utilizzati principalmente per la coltura batterica anaerobica18, hanno anche dimostrato efficacia nell'indurre l'attivazione dei promotori ZmPORB1 nei protoplasti di mais in condizioni anaerobiche19.

Il presente lavoro mira a stabilire una solida pipeline per l'isolamento dei protoplasti di cavolo e l'espressione transitoria. Successivamente, è stata valutata l'efficacia di vari trattamenti di regolazione dell'ossigeno valutando l'attività del promotore dei geni di risposta anaerobica utilizzando saggi a doppia luciferasi. Si prevede che il protocollo sviluppato in questo studio sarà prezioso per la ricerca futura relativa allo stress da sommersione o ipossia nei sistemi Brassicacei .

Protocollo

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In questo studio sono state utilizzate due cultivar di cavolo commerciale (B. oleracea var. capitata): 'Fuyudori' e '228'. Nella Figura 1 è mostrata una rappresentazione grafica del flusso di lavoro del protocollo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione delle piantine di cavolo

  1. Semina i semi di cavolo 'Fuyudori' e '228' utilizzando un substrato per piante commerciali in fori rotondi di forma quadrata (P 4,5 cm x H 4,5 cm) di vassoi a 48 pozzetti (L 49 cm x L 28 cm x H 5 cm). Incorpora i semi a circa 1 cm di profondità nel terreno di coltura.
  2. Coltivare piantine di cavolo in una camera di crescita a 22 °C con un ciclo luce-buio di 16/8 ore. Mantenere l'intensità luminosa di 100 μmol m-2·s-1 (tubo fluorescente bianco) durante la fase luminosa.
  3. Dopo 2-3 settimane di crescita, utilizzare piantine di cavolo allo stadio a 2 foglie per un ulteriore isolamento dei protoplasti del mesofillo.
    NOTA: La dimensione suggerita delle piantine di cavolo è uno stadio a 2 foglie, in cui la seconda foglia vera è completamente espansa, ma la terza foglia vera non è espansa e la sua lunghezza è inferiore a 1 cm (Figura 2A). Per sincronizzare le fasi di sviluppo delle piantine di cavolo, i semi 'Fuyudori' devono essere seminati circa 2 giorni prima dei semi '228' a causa dei loro diversi tassi di crescita. Questa regolazione garantisce una crescita e una maturità uniformi tra le piante di cavolo nella fase desiderata.

2. Isolamento dei protoplasti di cavolo

  1. Preparare 12,5 mL di soluzione enzimatica (Tabella 1) prima di ogni isolamento del protoplasto.
    1. Preriscaldare una soluzione con 10 mM di MES (pH 5,7) e 0,6 M di mannitolo a 55 °C. Continuare a riscaldare la soluzione a 55 °C per 10 minuti dopo aver aggiunto l'1,5% di cellulasi R10 e lo 0,75% di macerozima R10.
    2. Dopo che la soluzione enzimatica si è raffreddata a temperatura ambiente (25 °C), aggiungere 10 mM di CaCl2 e lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA). Filtrare: sterilizzare la soluzione enzimatica preparata in una piastra di Petri da 9 cm utilizzando un filtro per siringa da 0,22 μm.
      NOTA: Il preriscaldamento della soluzione aumenta la solubilità enzimatica e inattiva la proteasi. Gli effetti della digestione variano a seconda dei diversi tipi di enzimi cellulasi. La combinazione di Cellulasi R10 e Macerozyme R10 è adatta per l'isolamento di protoplasti di cavolo.
  2. Raccogli le seconde foglie vere appena espanse da cinque a otto piantine di cavolo e tagliale a strisce di 0,5-1,0 mm usando una lama di rasoio affilata. Trasferire immediatamente le strisce fogliari nella soluzione enzimatica appena preparata.
    NOTA: La selezione di foglie sane e designate dal cavolo nella fase corretta è fondamentale. Le seconde foglie vere appena espanse da piantine di cavolo allo stadio a 2 foglie forniscono la massima efficienza di isolamento dei protoplasti. Le piante troppo mature, i cotiledoni o le foglie invecchiate non sono raccomandati per l'isolamento dei protoplasti. Da cinque a dodici foglie vere ben espanse possono produrre con successo protoplasti di cavolo in 12,5 mL di soluzione enzimatica. Il numero di foglie necessarie per l'isolamento dei protoplasti dipende dalla quantità desiderata di protoplasti necessari. Tipicamente, i protoplasti ottenuti da cinque a otto foglie sono sufficienti per le successive procedure sperimentali.
  3. Dopo l'infiltrazione sottovuoto al buio per 30 minuti (Figura 2B), tenere le strisce di foglie di cavolo immerse nella soluzione enzimatica (Figura 2C) al buio a temperatura ambiente per altre 4-16 ore.
    NOTA: Il tempo di digestione enzimatica può variare tra le cultivar di cavolo e deve essere ottimizzato in base al genotipo specifico. Ad esempio, il 'Fuyudori' richiede un tempo di digestione più lungo (16 ore) rispetto al '228' (4 ore) a causa delle foglie più spesse di 'Fuyudori'.
  4. Diluire la soluzione contenente protoplasti con un volume uguale di soluzione W5, che consiste di 2 mM di MES (pH 5,7), 154 mM di NaCl, 125 mM di CaCl2, 5 mM di KCl e 5 mM di glucosio (vedere la Tabella 1 per la preparazione), per arrestare la digestione enzimatica.
  5. Rilasciare la sospensione del protoplasto facendo roteare delicatamente o utilizzando un agitatore orbitale. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta conica da 50 mL.
    NOTA: I protoplasti isolati sono in grado di passare attraverso un filtro cellulare da 70 μm, mentre i detriti vegetali non digeriti vengono trattenuti dal filtro e successivamente rimossi dalla sospensione. I filtri cellulari possono essere riutilizzati e conservati in etanolo al 75% dopo il lavaggio, ma è necessario sciacquare completamente i filtri cellulari con una soluzione W5 per rimuovere l'etanolo residuo prima dell'uso.
  6. Centrifugare la soluzione di protoplasti con 150 x g per 2 minuti a 4 °C, quindi rimuovere con cautela il surnatante. Lavare delicatamente i protoplasti pellettati aggiungendo 10 mL di soluzione W5 lungo la parete del tubo conico ad una velocità di flusso approssimativa di 1 mL·s-1. Centrifugare la provetta a 150 x g per 2 minuti a 4 °C e ripetere nuovamente questa procedura di lavaggio per garantire la completa rimozione della soluzione enzimatica.
  7. Risospendere i protoplasti nella soluzione W5 e metterli in ghiaccio per 30 minuti. Dopo l'incubazione del ghiaccio, rimuovere il surnatante con una pipetta da 1 ml alla volta fino a rimuovere tutto il surnatante.
  8. Risospendere i protoplasti in una soluzione di MMG pre-raffreddata con ghiaccio composta da 4 mM di MES (pH 5,7), 0,4 M di mannitolo e 15 mM di MgCl2 (vedere la Tabella 1 per la preparazione).
  9. Misurare la concentrazione di protoplasti con un emocitometro e regolare la concentrazione finale a 4 x 105 protoplasti·mL-1 utilizzando la soluzione MMG.

3. Trasfezione dei protoplasti

  1. Mescolare un volume totale di 10 μL di plasmide (5-10 μg) (File supplementare 1) con 100 μL di protoplasti (4 x 104 protoplasti) e porre in ghiaccio per 10 minuti.
    NOTA: Per la purificazione dei plasmidi di grado trasfezione, viene utilizzato un kit di plasmidi disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore. Circa 4 x 104 protoplasti sono tipicamente impiegati in un saggio reporter a doppia luciferasi. Per esperimenti su larga scala, è disponibile una quantità maggiore di protoplasti per la trasfezione. In particolare, circa 2 x 105 protoplasti trasfettati con 10 μg di plasmide mostrano un'efficienza di trasfezione comprovata che varia dal 30% al 40%.
  2. Aggiungere un volume uguale (110 μl) di soluzione PEG appena preparata (vedere la Tabella 1 per la preparazione) contenente il 40% di polietilenglicole 4000 (PEG4000), 0,1 M di CaCl2 e 0,2 M di mannitolo nella soluzione protoplastica e mescolare delicatamente.
  3. Incubare la miscela di protoplasti a temperatura ambiente al buio per 10 minuti, quindi aggiungere 440 μL di soluzione W5 per terminare la reazione.
  4. Centrifugare i protoplasti trasfettati a 150 x g per 2 minuti a 4 °C e risospendere il pellet in 750 μL di soluzione W5 arricchita di ossigeno. Trasferire i protoplasti risospesi in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti pre-rivestita con BSA all'1%.
    NOTA: La soluzione W5 utilizzata per l'incubazione cellulare deve essere fatta gorgogliare con ossigeno utilizzando un concentratore di ossigeno (~90% di ossigeno) collegato a una pietra porosa per 5 minuti (Figura 2D). A seguito di questo processo di ossigenazione, la concentrazione finale di ossigeno disciolto nella soluzione W5 è aumentata da 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 a 29,18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1, misurato con un misuratore di ossigeno disciolto. Il volume della soluzione W5 per la risospensione di protoplasti trasfettati dipende dal tipo di piastra di coltura cellulare tissutale utilizzata. Per le piastre per colture cellulari a 12 o 24 pozzetti, si consiglia di ridurre il volume della soluzione W5 per mitigare lo stress da ipossia durante l'incubazione a causa della maggiore profondità all'interno dei pozzetti. Per il rivestimento BSA, ogni pozzetto della piastra di coltura ha ricevuto 1 mL di soluzione BSA all'1%, che è stata lasciata rivestire i pozzetti per 10 s. La soluzione BSA è stata quindi scartata da ciascun pozzetto e i pozzetti sono stati successivamente riempiti con la soluzione W5. Questa procedura mirava a creare una superficie temporanea non aderente utilizzando BSA, impedendo efficacemente ai protoplasti di attaccarsi alla superficie plastica della piastra di coltura durante le successive fasi sperimentali.

4. Trattamento dell'ipossia su protoplasti di cavolo

  1. Condurre trattamenti chimici o di ipossia indotta fisicamente immediatamente dopo la trasfezione dei protoplasti.
    NOTA: Si raccomanda di applicare il trattamento dell'ipossia immediatamente dopo la trasfezione del protoplasto. L'incubazione prolungata dei protoplasti può diminuire la successiva risposta all'ipossia.
    1. Per l'ipossia indotta chimicamente su protoplasti di cavolo, aggiungere OxyFluor, EC-Ossirasi e solfito di sodio alla soluzione di protoplasto W5.
      NOTA: L'utilizzo di 0,6 unità di EC-ossirasi, 0,6 unità di mL-1 di OxyFluor e 1 g·mL-1 di solfito di sodio in W5 sono state le condizioni testate in grado di indurre il promotore BoADH1 e BoSUS1L (Figura 3A) con basso danno all'integrità del protoplasto nelle due varietà di cavolo esaminate.
    2. Per l'ipossia indotta da sacca che consuma ossigeno, posizionare due confezioni di assorbitori di ossigeno in un barattolo anaerobico da 3,5 L per creare un ambiente ipossico.
  2. Raccogliere i protoplasti trattati con ipossia mediante centrifugazione a 150 x g per 2 minuti a 4 °C. Congelare i protoplasti raccolti utilizzando azoto liquido e conservarli in un congelatore a -80 °C per i saggi successivi.

5. Doppio dosaggio della luciferasi

  1. Eseguire il test reporter a doppia luciferasi secondo le istruzioni del produttore con piccole modifiche.
    1. Risospendere i protoplasti di cavolo in 50 μL di tampone di lisi passiva 1x e vortice per 10 s.
    2. Incubare i protoplasti disgregati su ghiaccio per 10 minuti e raccogliere il surnatante dopo la centrifugazione a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
    3. Aggiungere 20 μl di lisato cellulare a ciascun pozzetto della micropiastra. Erogare 100 μl di reagente del saggio della luciferasi II nei pozzetti e misurare l'attività della luciferasi della lucciola utilizzando un lettore di micropiastre.
    4. Aggiungere 100 μl del reagente del test disponibile in commercio a ciascun pozzetto e misurare l'attività della luciferasi Renilla utilizzando un lettore di micropiastre.

Risultati

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Questo lavoro ha sviluppato con successo un sistema di espressione transitoria utilizzando protoplasti di cavolo (vedere la Figura 1 per il flusso di lavoro). I protoplasti sono stati isolati da foglie vere di cavolo di 2-3 settimane di dimensioni adeguate (Figura 2A) da cultivar di cavolo commerciali 'Fuyudori' e '228' utilizzando la digestione di cellulasi/macerozima e l'infiltrazione sotto vuoto scuro (Figura 2B, C). Per mitigare le condizioni di ipossia sperimentate dai protoplasti sommersi durante l'incubazione, la soluzione W5 è stata ossigenata utilizzando un gorgogliatore di pietre porose collegato a una macchina per l'ossigeno (Figura 2D). Questo processo ha aumentato significativamente la concentrazione di ossigeno disciolto nella soluzione W5 da 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 a 29,18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1 dopo 5 minuti di gorgogliare ossigeno. Dopo il processo di isolamento, la resa dei protoplasti è stata di 1,04 x 107 per 'Fuyudori' e di 4,00 x 106 protoplasti·g−1 peso fresco per '228' dopo un periodo di digestione notturna (Figura 2E). Successivamente, la GFP è stata utilizzata come gene reporter per valutare l'efficienza di trasformazione del metodo di trasfezione mediata da PEG, dimostrando che l'efficienza di trasfezione dei protoplasti nel cavolo era superiore al 40% in entrambe le cultivar (Figura 2F), confermando così la vitalità di questo sistema.

Inoltre, i costrutti promotori dei geni della risposta alla respirazione anaerobica del cavolo, i vettori BoADH1p::Luc e BoSUS1Lp::Luc (Figura 3A), sono stati introdotti nei protoplasti del cavolo come reporter per valutare gli effetti dell'induzione ipossica di diversi trattamenti. A questo sistema modello di espressione transitoria sono stati applicati anche vari trattamenti di regolazione dell'ossigeno. I risultati hanno mostrato che tutti i trattamenti di eliminazione dell'ossigeno, ad eccezione del solfito di sodio, hanno indotto con successo una risposta all'ipossia nei protoplasti di cavolo (Figura 3B). In particolare, l'attività del promotore di BoADH1 è aumentata di circa 2,6 volte e 3,2 volte rispetto al controllo dopo il trattamento con EC-Ossirasi e OxyFluor, rispettivamente, e, in particolare, di oltre 7,0 volte con il trattamento con pacchetto di assorbitori di ossigeno (Figura 3B). Allo stesso modo, l'attività del promotore di BoSUS1L è aumentata di circa 1,7 volte e 1,8 volte con il trattamento con EC-Ossirasi e OxyFluor, rispettivamente, mentre il trattamento con pacchetto di assorbitori di ossigeno ha indotto un aumento sostanziale di oltre 5,6 volte (Figura 3B). Questi risultati suggeriscono che il pacchetto di assorbimento dell'ossigeno dimostra un'efficacia superiore nella creazione di un ambiente ipossico in questo sistema sperimentale di protoplasti di cavolo.

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Figura 1: Rappresentazione grafica del flusso di lavoro di isolamento dei protoplasti. Questa figura illustra il processo graduale coinvolto nell'isolamento dei protoplasti dal tessuto delle foglie di cavolo. Il flusso di lavoro viene rappresentato visivamente per fornire una chiara comprensione della procedura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Isolamento dei protoplasti dal tessuto fogliare del cavolo. (A) Viene mostrato l'aspetto delle varietà commerciali di cavolo 'Fuyudori' e '228' allo stadio di crescita raccomandato. Le seconde foglie vere completamente espanse (indicate dalla punta di freccia) dei cavoli nello stadio a 2 foglie vengono selezionate per l'isolamento dei protoplasti. Barra di scala: 2 cm. (B) Una pompa a vuoto e un essiccatore sono impiegati per il processo di infiltrazione sottovuoto di strisce di foglie di cavolo, con un'infiltrazione di 30 minuti eseguita prima della digestione enzimatica. (C) Viene illustrata la condizione delle strisce di foglie di cavolo durante la digestione enzimatica. La digestione completa del tessuto fogliare richiede un totale di 4-16 ore. Barra di scala: 3 cm. (D) Le foto mostrano l'uso di un concentratore di ossigeno collegato a una pietra porosa per aumentare la concentrazione di ossigeno disciolto nella soluzione W5. Barra della scala: 5 cm. (E) Oltre 4,00 x 106 protoplasti mesofilli per grammo di peso fresco (FW) sono stati ottenuti da entrambe le varietà di cavoli 'Fuyudori' e '228' e sono stati osservati al microscopio. Barra della scala: 200 μm. (F) L'efficienza di trasfezione dei protoplasti di entrambi i genotipi di cavolo, utilizzando un reporter GFP espresso costitutivamente, è risultata superiore al 40%. Barra della scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Risposta all'ipossia dei protoplasti di cavolo in condizioni di carenza di ossigeno. (A) I costrutti genici di risposta all'ipossia, promotori BoADH1 e BoSUS1L , sono utilizzati come reporter per valutare la risposta all'ipossia nei protoplasti di cavolo 'Fuyudori'. (B) Un totale di 5 μg di plasmidi reporter vengono trasfettati in protoplasti di cavolo 'Fuyudori', che vengono incubati in una soluzione W5 con bolle di ossigeno prima dell'esposizione a trattamenti di ipossia per 4 ore. I livelli di ossigeno vengono ridotti durante l'incubazione aggiungendo EC-ossirasi (0,6 unità·mL-1), OxyFluor (0,6 unità·mL-1) e solfito di sodio (1 g·mL-1) alla soluzione W5. Il trattamento con l'assorbente di ossigeno viene eseguito inserendo due sacche di assorbimento di ossigeno in un barattolo anaerobico da 3,5 L. Il gruppo "CK" rappresenta il gruppo di controllo senza alcun trattamento di ipossia. Dopo il trattamento, i protoplasti vengono raccolti per un doppio saggio della luciferasi. Ogni valore rappresenta la media ± SD, con n = 4. Lettere diverse indicano differenze significative (P < 0,05) basate su un'ANOVA unidirezionale con test post-hoc LSD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Preparazione della soluzione enzimatica, della soluzione W5 e della soluzione MMG. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Dettagli plasmidici per la trasfezione di protoplasti. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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Questo protocollo presenta un metodo semplificato per l'isolamento dei protoplasti da due cultivar di cavolo commerciali. L'efficacia di questo metodo viene valutata principalmente attraverso due parametri critici per il controllo della qualità: la resa di protoplasti vitali e l'efficienza della trasfezione dei protoplasti. L'attuazione di questo protocollo ha portato a una resa superiore a 4,00 x 106 protoplasti·g−1· FW di tessuto mesofillo da entrambe le cultivar di cavolo (Figura 2E, F). Questa resa è paragonabile a quella riportata in altre specie, tra cui melanzane, garofani, canna da zucchero e Camellia oleifera, dove le rese dei protoplasti variavano da 2,5 x 106 a 1,4 x 107 protoplasti·g−1· AI 6,7,9,17. Questi risultati suggeriscono la potenziale applicabilità del protocollo in diversi background genetici con B. oleracea.

Il successo del protocollo dipende da diversi fattori critici. Il principale è l'utilizzo di foglie specificate da piantine di cavolo sane in una fase di crescita appropriata (Figura 2A). L'uso di piante più vecchie o malsane può portare a protoplasti di scarsa qualità. È inoltre fondamentale tagliare con cura il tessuto fogliare in strisce di 0,5-1,0 mm ed evitare di schiacciarlo con una lama smussata. Il processo di digestione enzimatica, che dura tra le 4 e le 16 ore, è un'altra fase fondamentale. Periodi di digestione inferiori a 4 ore possono portare a una digestione incompleta, mentre quelli superiori alle 16 ore di digestione rischiano uno stress cellulare. In particolare, i genotipi con foglie più spesse, come 'Fuyudori', possono beneficiare di tempi di digestione prolungati per massimizzare la resa dei protoplasti. Al contrario, il '228' richiedeva solo 4 ore per la digestione completa. Inoltre, un'ampia gamma di tempi di digestione può fornire una maggiore flessibilità nella programmazione sperimentale. Ad esempio, una digestione di 4 ore consente di completare l'isolamento dei protoplasti e i successivi saggi transitori in un solo giorno. Al contrario, una digestione di 16 ore consente l'inizio della digestione enzimatica la sera e consente il completamento delle fasi successive il giorno successivo, il che può migliorare la comodità nell'applicazione di questo protocollo. Inoltre, è fondamentale maneggiare delicatamente i protoplasti durante l'intero processo di isolamento dei protoplasti a causa della loro fragilità e suscettibilità alle sollecitazioni meccaniche.

Per simulare le condizioni anaerobiche rappresentative dello stress da inondazione, questo protocollo ha utilizzato comuni agenti di lavaggio dell'ossigeno e sacche che consumano ossigeno per creare ambienti ipossici. Per migliorare l'efficacia del sistema, viene impiegata una macchina ad ossigeno per ossigenare la soluzione W5 (Figura 2D), con l'obiettivo di ridurre i segnali di risposta ipossica di fondo nei protoplasti di cavolo durante il loro periodo di incubazione pre-trattamento. Un processo di ossigenazione di 5 minuti aumenta significativamente il livello di ossigeno disciolto da 7,84 mg· L-1 ± 0,05 mg· L-1 a 29,18 mg· L-1 ± 0,43 mg· L-1, che indica un effetto pronunciato nell'alleviare le condizioni di ipossia. Tra i metodi di evacuazione dell'ossigeno utilizzati in questo studio, i pacchetti di assorbimento dell'ossigeno hanno mostrato prestazioni superiori, inducendo la più alta attività del promotore in due geni core di risposta anaerobica (Figura 3). Inoltre, questo metodo offre l'ulteriore vantaggio della scalabilità, consentendo il trattamento simultaneo di più campioni attraverso l'uso di sacche che consumano ossigeno in un unico barattolo anaerobico, anziché l'applicazione individuale di agenti che eliminano l'ossigeno a ciascuna piastra di coltura cellulare. In sintesi, i pacchetti di assorbimento di ossigeno forniscono una piattaforma comoda ed efficace adatta a valutare la risposta dei protoplasti di cavolo in condizioni di ipossia.

Sebbene questo protocollo dimostri diversi vantaggi, è importante riconoscerne i limiti, in particolare l'efficienza di trasfezione relativamente modesta dei protoplasti di cavolo. Sebbene questa efficienza non raggiunga il 90% riportato per Arabidopsis5, si dimostra comunque sufficiente per il successo degli studi successivi sull'attività del promotore (Figura 3), indicando un potenziale significativo per l'analisi funzionale in questo sistema.

Data l'importanza globale del cavolo come principale coltura vegetale, l'integrazione di questo protocollo con trattamenti per l'ipossia e tecniche di analisi genetica promette di ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi di regolazione del cavolo in condizioni di inondazione. Tali intuizioni potrebbero potenzialmente accelerare lo sviluppo di varietà di cavoli resistenti alle inondazioni, rispondendo a un'esigenza critica di fronte a condizioni meteorologiche estreme e all'aumento degli eventi alluvionali.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse concorrente.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio Nazionale per la Scienza e la Tecnologia (MOST 111-2313-B-002-029- e NSTC 112-2313-B-002-050-MY3). Per la Figura 1, le icone sperimentali provengono da BioRender.com.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido 2-(N-morfolino) etansolfonico (MES)PhytoTech LabsM825Per la preparazione di soluzioni enzimatiche
228 semi di cavoloTakii & Co., Ltd. (Kyoto, Giappone)
Provetta conica da 50 mLSPL Life Sciences50050Per la preparazione di soluzioni enzimatiche
Piastra per coltura tissutale a 6 pozzettiAlpha Plus16106Per l'incubazione di protoplasti
70 μ filtro cellulare mSorfa SCS701Per filtrazione protoplast
Piastra di Petri da 9 cmAlpha Plus16001Per digestione enzimatica
Barattolo anaerobicoHIMEDIABarattolo anaerobico 3,5 LPer il trattamento dell'ipossia 
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA7906Per la preparazione della soluzione W5 e il rivestimento della piastra
di coltura Cloruro di calcioJ.T.Baker131301Per la preparazione della soluzione W5 e della soluzione PEG
Cellulasi R10YakultPer la preparazione della soluzione enzimatica
EssiccatoreTarsons 402030Per l'infiltrazione sotto vuoto
D-GlucosioBioshopGLU501Per la preparazione della soluzione W5
Misuratore di ossigeno discioltoThermo ScientificOrion Star A223Per la misurazione dell'ossigeno
D-mannitoloSigma-AldrichM1902Per la preparazione di soluzioni enzimatiche, soluzioni PEG e soluzioni MMG
Sistema di analisi reporter a doppia luciferasiPromegaE1960Per il saggio reporter a doppia luciferasi
EC-OxyraseOxyrase Inc.EC-0005Per il trattamento dell'ipossia
Semi di cavolo FuyudoriKobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Giappone)
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàHitachiCR21GIIIPer la raccolta di protoplasti
Macerozyme R10 YakultPer la preparazione di soluzioni enzimatiche
Cloruro di magnesioAlfa Aesar12315Per la preparazione di soluzioni MMG
MicrocentrifugaHitachiCT15REPer la raccolta di protoplasti
MicroplateGreiner655075Per test reporter a doppia luciferasi
Lettore di micropiastreDispositivi molecolariSpectraMax MiniPer Saggio reporter a doppia luciferasi
Millex 0.22 μ m filtro per siringaMerckSLGP033RSPer la preparazione di soluzioni enzimatiche
Pompa a vuoto senza olioRocker Rocker 300Per infiltrazione sotto vuoto
OxyFluor OxyraseInc.OF-0005Per il trattamento dell'ipossia
Pacchetto assorbitore di ossigenoMitsubishi Gas Chemical CompanyAnaeroPack, MGCC1Per il trattamento dell'ipossia
Concentratore di ossigenoULTIMATE PERFECTAII-XPer il gorgogliamento dell'ossigeno in soluzione W5
Substrato vegetaleKlasmann-DeilmannSubstrato Potgrond HPer la preparazione di piantine di cavolo
Plasmid Midi KitQIAGEN12145Per la purificazione del DNA plasmidico di grado trasfezione 
Polietilenglicole 4000Fluka81240Per la trasfezione di protoplasti
Cloruro di potassioJ.T.Baker304001Per la preparazione della soluzione W5
Lama di rasoioGillettePer la preparazione di strisce di foglie di cavolo
Cloruro di sodioBioshop SOD002Per la preparazione della soluzione W5
Solfito di sodioSigma-AldrichS0505Per il trattamento dell'ipossia
Bagno d'acquaYihderBU-240DPer la preparazione della soluzione enzimatica

Riferimenti

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