Articolo metodologico

Saggio di imaging accoppiato Cisterna Magna Nanoinjection e Laser Speckle Contrast per studiare la regolazione del flusso sanguigno cerebrale in vivo

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DOI:

10.3791/67544

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8 luglio 2025

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Per studiare la regolazione del flusso sanguigno cerebrale in vivo, i metodi farmacologici tradizionali sono invasivi e spesso danneggiano il cranio, la dura madre e le leptomeningi. In questo lavoro, abbiamo sviluppato una tecnica minimamente invasiva che combina l'iniezione di magna intracisternale guidata da nanoiniettori (ICM) con l'imaging laser a contrasto speckle, preservando l'integrità del cranio e delle leptomeningi.

Abstract

La regolazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) è fondamentale per il mantenimento delle funzioni cognitive, ma i suoi meccanismi sottostanti rimangono poco compresi. Lo studio dei processi cellulari e molecolari coinvolti in questa regolazione richiede un approccio farmacologico che consenta una somministrazione precisa di farmaci nel liquido cerebrospinale (CSF), consentendo al contempo il monitoraggio in tempo reale della dinamica del flusso sanguigno cerebrale. In questo articolo, presentiamo un metodo per studiare la regolazione del flusso sanguigno cerebrale in vivo combinando l'iniezione intracisternale magna (ICM) basata su nanoiniettori con l'imaging laser speckle contrast imaging.

La tecnica di iniezione ICM basata su iniettori di nanolitri consente una somministrazione precisa del farmaco in un intervallo dinamico da nL/min a μL/min. Nei nostri esperimenti, questo approccio ha ridotto significativamente il volume di iniezione dai tradizionali 5-10 μL a soli 1,5 μL, mantenendo così la normale pressione intracranica. In combinazione con l'imaging laser speckle contrast imaging, siamo stati in grado di monitorare le dinamiche del flusso sanguigno cerebrale (CBF) in tempo reale prima, durante e dopo le iniezioni ICM.

Utilizzando questo metodo, abbiamo valutato le variazioni del CBF in risposta all'iniezione ICM di tre diversi vasodilatatori: (S)-3,5-diidrossifenilglicina (DHPG), acetilcolina e adenosina. Mentre tutti e tre i vasodilatatori hanno aumentato il CBF basale, hanno avuto effetti distinti sulla dinamica del CBF. Ad esempio, l'impatto dell'adenosina è stato transitorio, mentre il DHPG e l'acetilcolina hanno prodotto effetti di lunga durata. Con i suoi vantaggi unici, questo metodo rappresenta una preziosa aggiunta alla cassetta degli attrezzi per lo studio della regolazione CBF dei roditori in vivo.

Introduzione

Il flusso sanguigno cerebrale (CBF) garantisce un apporto continuo di ossigeno e sostanze nutritive al cervello, rimuovendo le scorie metaboliche, essenziali per il mantenimento delle normali funzioni cognitive 1,2. In condizioni omeostatiche, il CBF rimane relativamente stabile nonostante le fluttuazioni della pressione di perfusione, un processo noto come autoregolazione 3,4,5. Oltre all'autoregolazione, il CBF locale può essere regolato dinamicamente in risposta all'attività neuronale vicina, un fenomeno noto come accoppiamento neurovascolare 6,7. Sia l'autoregolazione che l'accoppiamento neurovascolare sono regolati da un gruppo di cellule - cellule endoteliali, cellule murali, astrociti, fibroblasti e neuroni - note collettivamente come cellule dell'unità neurovascolare 4,7. Tuttavia, i meccanismi cellulari e molecolari con cui questi diversi tipi di cellule si coordinano per modulare il CBF sono ancora in gran parte sconosciuti.

I metodi per studiare la regolazione della CBF sono generalmente suddivisi in modelli in vitro e in vivo. Gli studi in vitro, spesso utilizzando fette di cervello acuto, sono tipicamente combinati con tecniche elettrofisiologiche o farmacologiche per esaminare come i neuroni e le cellule gliali regolano la dilatazione o la costrizione dei singoli vasi sanguigni 8,9,10. Il limite principale dei modelli in vitro è che non si replicano in condizioni in vivo, in particolare l'assenza di pressione sanguigna fisiologica. I modelli in vivo per lo studio della regolazione della CBF spaziano da approcci su macroscala a microscala. Le tecniche su macroscala, come la tomografia a emissione di positroni (PET) e la risonanza magnetica funzionale (fMRI), non sono invasive ma soffrono di bassa risoluzione spaziale e temporale 11,12,13,14.

Il principale metodo su microscala per lo studio della CBF in vivo è l'imaging a due fotoni, che fornisce un'elevata risoluzione spazio-temporale 9,15,16,17,18. Tuttavia, questa tecnica richiede la rimozione del cranio e della dura madre e, se combinata con la manipolazione farmacologica, diventa ancora più invasiva, causando potenzialmente emorragie, danneggiando il tessuto cerebrale e alterando la pressione intracranica19. Pertanto, è fondamentale disporre di un metodo per la manipolazione e il monitoraggio del CBF in vivo che soddisfi criteri specifici: deve essere non invasivo (preservando l'integrità del cranio, delle leptomeningi e dei vasi), fornire un'elevata risoluzione spazio-temporale e consentire una precisa manipolazione farmacologica del CBF. In questo articolo, presentiamo un nuovo metodo che combina l'iniezione di magna intracisternale (ICM) basata su iniettori di nanolitri e l'imaging a contrasto laser speckle, soddisfacendo tutti questi requisiti.

Gli approcci farmacologici tradizionali per lo studio della regolazione del CBF spesso comportano la rimozione del cranio e delle meningi per esporre il tessuto cerebrale alla somministrazione locale di farmaci. Al contrario, l'iniezione di ICM evita questo danno somministrando farmaci direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF), consentendo loro di seguire il flusso naturale del CSF e quindi di imitare meglio le condizioni fisiologiche. Una sfida con l'iniezione ICM è che di solito richiede grandi volumi di fluido, spesso 5 μL o più nei topi20. Dato che il volume totale del liquido cerebrospinale nei topi adulti è di circa 36 μl, l'iniezione di 5 μl può aumentare la pressione intracranica e alterare la dinamica del CBF. Il nostro sistema di nanoiniettori, che utilizza pipette di vetro, eroga il fluido con un controllo preciso del volume e della velocità senza causare perdite di liquido cerebrospinale nel sito di iniezione.

L'uretano e l'alfa-cloralosio sono utilizzati nel nostro studio perché forniscono una linea di base fisiologica più stabile del flusso sanguigno cerebrale e preservano l'accoppiamento neurovascolare (NVC) meglio rispetto alle alternative comunemente usate come l'isoflurano o la ketamina/xilazina (KX). Utilizzando questo sistema, abbiamo testato tre diversi vasodilatatori-(S)-3,5-diidrossifenilglicina (DHPG), acetilcolina e adenosina, e abbiamo confermato che consente una manipolazione e un monitoraggio precisi della dinamica del CBF in vivo.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia. Tutti gli esperimenti hanno aderito alla Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Per gli esperimenti sono stati utilizzati sei topi maschi C57BL/6, di età compresa tra 10 e 14 settimane. Le procedure chirurgiche sono descritte nella Figura 1A.

1. Preparazione all'intervento chirurgico

  1. Posizionare un termoforo sul telaio stereotassico e preriscaldarlo a 37 °C ~20 minuti prima dell'intervento. Preparare uretano fresco (750 mg/kg) e cloralosio (50 mg/kg) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per l'anestesia.
    NOTA: Per la preparazione della soluzione di alfa-cloralosio in PBS, abbiamo riscaldato la soluzione in un bagno d'acqua a 40 °C e l'abbiamo agitata ogni 10-15 minuti fino a quando non è stata completamente sciolta. Sia la soluzione di uretano che quella di alfa-cloralosio sono state filtrate utilizzando un filtro per siringa da 0,22 μm prima dell'uso.
  2. Prima dell'intervento chirurgico, raccogli tutti gli strumenti chirurgici necessari, tra cui forbici, pinze, micro portaaghi, emostatici, cotton fioc, tergicristalli e suture. Sterilizzare gli strumenti in autoclave (121 °C a 15 psi per 60 min).
  3. Preparare tubi capillari in vetro (diametro esterno 1,14 mm, diametro interno 0,53 mm, lunghezza 88,9 mm). Utilizzare un estrattore di vetro per creare pipette di vetro per iniezione21. La resistenza preferita della pipetta è di circa 80 - 100 MΩ. Sterilizzare e conservare le pipette di vetro in un contenitore pulito.
  4. Preparare un nanoiniettore con un volume di iniezione (25 nL - 4,5 μL) e una velocità (6 nL/s - 644 nL/s) adeguati.
  5. Preparare le seguenti soluzioni vasodilatatrici nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF): (S)-3,5-diidrossifenilglicina (DHPG) a 5 mM, acetilcolina a 0,5 mM e adenosina a 10 mM.
  6. Preparare meloxicam (4,0 mg/kg) per alleviare il dolore durante l'intervento chirurgico. Somministrare meloxicam per via sottocutanea ai topi circa 30 minuti prima dell'intervento chirurgico per garantire un'adeguata analgesia.

2. Procedura chirurgica

  1. Pesare sei topi maschi C57BL/6 (10-14 settimane) e anestetizzarli mediante iniezione intraperitoneale di uretano (750 mg/kg) e cloralosio (50 mg/kg). Metti i topi in una camera di anestesia con isoflurano all'1% per mantenere l'anestesia. Questo processo dura da 40 minuti a 1 ora circa.
    NOTA: L'isoflurano può accelerare l'induzione dell'anestesia.
  2. Rimuovere con cautela i topi dalla camera di anestesia e valutare la profondità dell'anestesia confermando l'assenza del riflesso di pizzicamento delle dita. Usando un batuffolo di cotone, applica la crema depilatoria sulla parte superiore del cranio e sulla parte posteriore del collo per rimuovere il pelo.
  3. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza e riapplicare secondo necessità durante la procedura. Monitorare regolarmente durante l'esperimento e somministrare un unguento aggiuntivo quando necessario.
  4. Posizionare il mouse in posizione prona all'interno del telaio stereotassico, garantendo un'adeguata ventilazione con aria medicale a una portata da 1 a 2 L/min. Fissare il mouse con le barre auricolari per un corretto fissaggio, quindi inclinare delicatamente la testa verso il basso per formare un angolo di 120° con il corpo, esponendo così la cisterna magna.
    NOTA: L'isoflurano viene utilizzato esclusivamente per l'induzione dell'anestesia e non durante la fase di mantenimento.
  5. Disinfettare l'area chirurgica utilizzando almeno tre applicazioni alternate di alcol al 70% e uno scrub chirurgico (ad es. clorexidina o iodio povidone) per garantire un'adeguata sterilizzazione della pelle.
  6. Individuare la cresta occipitale con un microscopio operatorio. Sollevare la pelle sovrastante con una pinzetta e praticare un'incisione della linea mediana di 1 cm. Controlla eventuali emorragie con tamponi di cotone.
  7. Esporre i muscoli del collo e inciderli e separarli con cura lungo la linea mediana usando una pinza. Impiega due pinze curve, una in ciascuna mano, per ritrarre delicatamente i muscoli ed esporre la dura madre, che costituisce il confine esterno della cisterna magna.
  8. Regolare la posizione della testa inclinandola verso il basso per formare un angolo di 150° con il corpo per un'esposizione ottimale della cisterna magna.
  9. Praticare un'incisione di 5 mm lungo la sutura sagittale, coprendo sia il punto lambda che quello bregma. Usando due pinze curve, tira delicatamente da parte la pelle e pulisci la superficie del cranio con soluzione fisiologica. Assicurarsi che non rimangano peli sul cranio esposto.
  10. Dopo la pulizia, applicare uno strato di gel per ultrasuoni di ~1 mm di spessore sul cranio esposto utilizzando tamponi di cotone per mantenere l'umidità nell'area. Poiché il gel per ultrasuoni può contenere bolle d'aria, assicurarsi che tutte le bolle d'aria vengano rimosse prima dell'imaging.
  11. Posizionare il mouse sotto la lente del sistema di imaging a contrasto laser speckle. Accendere il sistema e il software di accompagnamento. Assicurarsi che il cervello del mouse sia centrato all'interno del campo di imaging, quindi utilizzare la funzione di messa a fuoco automatica per ottenere la messa a fuoco corretta per l'imaging. Se necessario, rimuovere delicatamente eventuali peli o bolle d'aria rimanenti dal campo di imaging utilizzando una pinzetta.

3. Configurazione della nanoiniezione

  1. Fissare la pompa al braccio del manipolatore stereotassico e collegare il cavo al controller. Accendere il controller e selezionare la pompa di destinazione. Nel pannello di controllo, impostare DIREZIONE su INFONDERE. Impostare la velocità a 2 μl al minuto e il volume a 4,5 μl.
    NOTA: Il sistema di nanoiniezione è costituito da due componenti principali: la pompa di iniezione e il controller. Ogni controller può azionare due pompe contemporaneamente. Per l'iniezione ICM, utilizziamo una sola pompa.
  2. Al termine dell'INFUSE , estrarre una pipetta di vetro dal contenitore e riempirla con olio minerale incolore e inodore utilizzando un ago flessibile MicroFil da 34 g o un tipo di ago simile. Assicurarsi che l'intera pipetta di vetro sia piena di olio.
  3. Svitare la pinza della pompa, inserire la pipetta di vetro, quindi serrare la pinza. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria all'interno della pipetta di vetro.
  4. Modificare la DIREZIONE nel pannello di controllo per RITIRARE. Impostare la velocità su 2 μ L/min e il volume su 4,5 μ L.
  5. Muovere il braccio stereotassico per introdurre delicatamente la pipetta nella soluzione preparata e prelevare il volume desiderato.

4. Iniezione di vasodilatatori nella cisterna magna e monitoraggio CBF

  1. Assicurarsi che la pompa sia fissata saldamente al braccio del manipolatore stereotassico. Regolare l'angolo del braccio del manipolatore stereotassico a 45° sul piano antero-posteriore.
  2. Utilizzando una pinzetta curva al microscopio da dissezione, esporre con cura la cisterna magna. Pulisci l'area con soluzione fisiologica per rimuovere il sangue. Utilizzare il micromanipolatore stereotassico per posizionare la pipetta di vetro vicino alla dura madre della cisterna magna.
  3. Una volta che la pipetta di vetro tocca la dura, manovrarla delicatamente per passare al centro della cisterna magna, evitando qualsiasi penetrazione nel cervelletto o nel midollo. Assicurarsi che la punta della pipetta di vetro sia inserita a una profondità di 1-2 mm prima di rilasciare la pinzetta.
    NOTA: Un frame stereotassico digitale è essenziale per monitorare la profondità di penetrazione della pipetta di vetro nella cisterna magna.
  4. Modificare la DIREZIONE nel pannello di controllo in INFUSE. Impostare la velocità di iniezione su 300 nL/min e il volume su 1,5 μL.
  5. Avvia il software per l'imaging a contrasto laser speckle (LSCI) e regola la messa a fuoco per ottenere l'immagine più chiara dei vasi sanguigni. Assicurarsi che non ci siano capelli o bolle d'aria nel campo visivo.
  6. Impostare l'intervallo di imaging su 5 s nel pannello di controllo LSCI. Registrare il CBF basale per circa 10 minuti, assicurandosi che il basale rimanga stabile. Se ci sono fluttuazioni nella linea di base, continuare a registrare per un periodo più lungo fino a raggiungere la stabilità.
  7. Dopo 10 minuti di registrazione stabile al basale, iniziare la nanoiniezione e annotare l'ora di inizio dell'iniezione nel sistema di registrazione LSCI. Una volta completata l'iniezione, segnare l'ora di fine e continuare la registrazione per altri 20 minuti o più. Dopo aver completato l'esperimento, perfondere transcardiaca i topi con PBS e raccogliere i tessuti cerebrali per l'analisi istologica.

Risultati

Dopo aver completato l'intervento chirurgico, abbiamo fissato il topo in un frame stereotassico con una lettura digitale (Figura 1A, B). Per la misurazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF), abbiamo accuratamente separato la pelle sopra il cranio dopo l'incisione e applicato un gel per ultrasuoni trasparente per mantenere l'umidità sulla superficie del cranio (Figura 1C). Per facilitare l'iniezione intracisternale di magna (ICM), abbiamo sezionato i muscoli del collo attorno alla cresta occipitale per esporre la cisterna magna. Successivamente, ritiriamo la soluzione target con una pipetta di vetro e utilizziamo il micromanipolatore per guidare la pipetta di vetro a penetrare nelle membrane della cisterna magna a una profondità di 1-2 mm (Figura 1D, E). Il braccio stereotassico è stato inclinato con un angolo di 45o per facilitare l'inserimento.

Successivamente, abbiamo esaminato i cambiamenti dinamici del CBF in risposta a tre diversi vasodilatatori: (S)-3,5-diidrossifenilglicina (DHPG), acetilcolina e adenosina 22,23,24,25. Inizialmente abbiamo registrato un basale di 10 minuti prima di iniettare 1,5 μL di ciascun vasodilatatore alla velocità di 300 nL/min per 5 minuti. Dopo l'iniezione, abbiamo registrato altri 20 minuti di dati. I nostri risultati hanno mostrato che tutti e tre i vasodilatatori hanno aumentato il CBF, anche se con dinamiche distinte. Il DHPG ha indotto un forte aumento del CBF, seguito da un graduale declino dopo l'iniezione (Figura 2A, B). Al contrario, l'acetilcolina ha suscitato un graduale aumento del CBF durante il periodo di registrazione (Figura 2C, D). L'adenosina ha anche prodotto un aumento transitorio del CBF, che è tornato al livello basale circa 15-20 minuti dopo l'iniezione (Figura 2E, F).

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Figura 1: Riassunto delle procedure chirurgiche. (A) Principali procedure chirurgiche passo-passo per nanoiniezione + modello LSCI. (B) Schemi che mostrano il sistema combinato nanoiniezione + LSCI. Il nanoiniettore è fissato stabilmente sul braccio stereotassico e il braccio è inclinato di 45° per facilitare la penetrazione della membrana atlanto-occipitale nella cisterna magna. (C) Vista dall'alto verso il basso del cranio del topo sotto il sistema LSCI. Il cranio è ricoperto di gel per ultrasuoni. (D) Vista posteriore che mostra la pipetta di vetro che penetra nella cisterna magna. La pipetta di vetro è stata riempita con blu di Evans per facilitare la visualizzazione. Per questo esperimento, utilizzate il fotogramma stereotassico digitale in modo da quantificare con precisione la distanza di penetrazione. (E) Schemi che mostrano la posizione della punta della pipetta in vetro nella magna cisternale. La testa del topo è stata inclinata di 30o per facilitare l'iniezione di magna cisternale. Abbreviazione: LCSI = imaging laser speckle contrast imaging. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Aumento del flusso sanguigno cerebrale dopo la nanoiniezione di vasodilatatori. (A) Immagini rappresentative che mostrano i cambiamenti del flusso sanguigno cerebrale prima e dopo l'iniezione di DHPG. La velocità del sangue è codificata a colori. Il blu rappresenta la bassa velocità e il rosso rappresenta l'alta velocità. (B) Flusso sanguigno in tempo reale nella regione contrassegnata da una linea rossa, che indica la finestra temporale per l'iniezione di DHPG. (C) Immagini rappresentative che mostrano i cambiamenti del flusso sanguigno cerebrale prima e dopo l'iniezione di ACh. La velocità del sangue è codificata a colori. Il blu e il rosso indicano rispettivamente la bassa e l'alta velocità. (D) Flusso sanguigno in tempo reale nella regione contrassegnata dalla linea rossa, che indica la finestra temporale per l'iniezione di ACh. (E) Immagini rappresentative che mostrano i cambiamenti del flusso sanguigno cerebrale prima e dopo l'iniezione di adenosina. La velocità del sangue è codificata a colori. Il blu e il rosso indicano rispettivamente la bassa e l'alta velocità. (F) Flusso sanguigno in tempo reale nella regione contrassegnata dalla linea rossa, che indica la finestra temporale per l'iniezione di adenosina. Abbreviazioni: DHPG = (S)-3,5-diidrossifenilglicina; ACh = acetilcolina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Presentiamo un nuovo metodo per studiare la regolazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) in vivo combinando una precisa nanoiniezione di magna cisternale con l'imaging laser speckle contrast (LSCI). Questo approccio consente un'accurata somministrazione di farmaci nel liquido cerebrospinale (CSF) consentendo al contempo il monitoraggio in tempo reale della CBF, facilitando la valutazione della reattività vascolare cerebrale.

La manipolazione farmacologica e le tecniche di somministrazione dei farmaci sono fondamentali per lo studio della CBF e della reattività vascolare cerebrale in vivo. I metodi tradizionali per l'applicazione dei farmaci, come l'uso di vasodilatatori o costrittori, spesso richiedono la rimozione del cranio, che può danneggiare le leptomeningi e persino il parenchima cerebrale 9,10,18. Queste tecniche invasive possono disturbare il microambiente cerebrale, in particolare causando danni vascolari ed emorragie, non riuscendo così a replicare le reali condizioni fisiologiche. Al contrario, il nostro metodo offre quattro vantaggi significativi.

In primo luogo, il nostro approccio per l'applicazione dei farmaci non è invasivo e preserva le condizioni fisiologiche. In secondo luogo, i classici metodi di iniezione ICM si basano in genere su siringhe o cannule, che possono portare a perdite di farmaci o tracce e liquido cerebrospinale a causa delle grandi dimensioni delle punte. Questi metodi tradizionali spesso richiedono grandi quantità di farmaco o tracce, di solito 5 μl o più, che possono alterare la pressione intracranica. Al contrario, la nostra iniezione ICM guidata da nanoiniettori richiede solo un piccolo volume di appena 1,5 μl o meno. Inoltre, la velocità di iniezione può essere controllata con precisione in un'ampia gamma, da 1 nL/s a 100 nL/s. In genere utilizziamo una velocità di 5 nL/s (300 nL/min), poiché questa velocità non influisce sulla pressione intracranica. In terzo luogo, a differenza delle iniezioni di farmaci guidate da pipette nel parenchima cerebrale o della perfusione di farmaci sulla superficie corticale, la nostra somministrazione di farmaci basata su iniezione di magna cisternale segue il flusso naturale del liquido cerebrospinale, imitando da vicino le condizioni fisiologiche. Infine, poiché il nostro metodo preserva l'integrità del cranio e delle meningi, possiamo condurre misurazioni sullo stesso gruppo di topi in momenti diversi, consentendo confronti longitudinali, cosa che non è fattibile con altri metodi di applicazione dei farmaci. Per gli studi di sopravvivenza e i confronti longitudinali, devono essere seguite rigorose tecniche asettiche, tra cui un'adeguata preparazione della pelle, l'uso di strumenti e materiali sterili e il rispetto delle linee guida istituzionali per la cura degli animali. Dovrebbe essere previsto un periodo di recupero di due settimane per la guarigione della ferita.

Il metodo di anestesia può avere un impatto significativo sul CBF. Ad esempio, l'anestesia ketamina-xilazina può aumentare il CBF di oltre il 50% rispetto ai livelli basali, mentre l'isoflurano può raddoppiare il livello basale di CBF. Nei nostri esperimenti, abbiamo optato per l'uretano e il cloralosio per i loro effetti minimi sul sistema cardiovascolare, che aiuta a mantenere i livelli fisiologici di CBF, come comunemente usato sul campo26,27. Inoltre, abbiamo saltato l'incannulamento intraarterioso per non invasiva la misurazione ripetuta dei gas nel sangue, sebbene tali procedure possano essere combinate con il nostro metodo26.

Il nostro approccio integra due sistemi: il sistema di iniezione ICM basato su nanoiniezione28 e il sistema di imaging a contrasto laser speckle (LSCI)29. Gli sperimentatori devono essere addestrati in entrambi i sistemi per eseguire con successo la procedura. Poiché il sistema LSCI occupa tutto lo spazio sopra la testa del mouse, l'inclinazione del braccio di 45o non solo facilita l'iniezione ICM, ma garantisce anche la compatibilità tra i due sistemi. Questa configurazione è fondamentale per il successo dell'esperimento.

Per i principianti che utilizzano l'iniezione ICM guidata da nanoiniettori, è necessaria una lunga pratica per padroneggiare la coordinazione della separazione dei muscoli con una pinzetta in una mano mentre si manovra il micromanipolatore per guidare la pipetta di vetro con l'altra. Una buona luce laser e uno stereomicroscopio a braccio articolato sono essenziali per una visualizzazione ottimale durante la procedura.

Utilizzando questo metodo, abbiamo valutato come i vasodilatatori classici come DHPG, acetilcolina e adenosina influenzano il CBF. Come anticipato, tutti e tre i vasodilatatori hanno aumentato il CBF; Tuttavia, hanno indotto dinamiche diverse. Il DHPG ha causato un forte aumento del CBF, seguito da un lento decadimento, mentre l'acetilcolina ha provocato un aumento graduale. Al contrario, l'adenosina ha prodotto solo un aumento transitorio del CBF.

Questo metodo dovrebbe essere applicabile anche ai modelli di ratto. Tuttavia, dato che lo spessore del cranio di ratto è di circa 0,5-1 mm, dovrà essere assottigliato per l'imaging a contrasto con macchie laser. Inoltre, mentre il metodo attuale può essere adattato per i topi svegli con la testa fissata, richiede un addestramento approfondito per ridurre al minimo il movimento degli animali durante gli esperimenti. Abbiamo utilizzato un numero limitato di topi per dimostrare il nostro metodo; Pertanto, il nostro studio è statisticamente limitato e si dovrebbe prestare attenzione quando si traggono conclusioni generali dai nostri risultati.

Per misurazioni CBF coerenti e affidabili, è importante che gli sperimentatori riconoscano che altri parametri fisiologici, come la temperatura corporea, la pressione sanguigna e i livelli di CO2 , svolgono un ruolo fondamentale nella valutazione fisiologica completa e dovrebbero essere attentamente considerati negli studi futuri. In sintesi, presentiamo un nuovo metodo in vivo per studiare la regolazione del CBF nei topi. Questo approccio è preciso e minimamente invasivo, il che lo rende adatto per lo studio delle dinamiche CBF indotte da farmaci.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(RS)-3,5-diidrossifenilglicinaTocrisCat. N. 0342
Cloruro di acetilcolinaSigmaA6625-25G
AdenosineSigmaA9251-25G
Tampone imbevuto di alcol al 70% Alcool isopropilicoVitrex Medical A / S520213
AmScope SM-8T Series Microscopio stereo zoom a braccio articolatoAmScopeSM-8TZ-144S-10M
Geltrasparente per la trasmissione degli ultrasuoni AquasonicAquasonicGelPLI 03-50
Digital Mouse Strumenti stereotassiciStoelting51730D
Alcool etilicoSigma459836-2L
Fiber-Lite DC950 IlluminatoreDolan-Jenner industriesDC950H
Sostituzione del vetro 1,14 MMWorld Precision Instruments504949
Kimtech Science Salviette di precisione TergicristalliKimberly Clark Professional5511
Laser Speckle Contrast Imagerstrumenti di moroMOORFLPI-2
Lasik Eye Spear (100 per caso) hospeqBV40815
MICROFIL AGO FLESSIBILEWorld Precision InstrumentsMF34G-5
Olio mineraleSigmaM5904
Tappetino riscaldante per mouseFisher scientific50-195-4000
Nair Lozione depilante al burro di cacaoAmazonASIN ‏ : ‎
NANOLITER 2020 INJECTORWorld Precision InstrumentsNANOLITER2020
P-2000 estrattore per micropipetteSutter InstrumentP-2000
Puritan® Tamponi, testina di cotone, albero di legno,Puritan Medical806-WC
Lubrificante oculare sterileMedi-Vet11897
UretanoSigmaU2500
Colla tissutale VetbondWorld Precision InstrumentsVETBOND
α-ChloralosioSigma23120
B000GCW5CS

Riferimenti

  1. Lassen, N. A., Ingvar, D. H., Skinhøj, E. Brain function and blood flow. Sci Am. 239 (4), 62-71 (1978).
  2. Leenders, K., et al. Cerebral blood flow, blood volume and oxygen utilization: normal values and effect of age. Brain. 113 (Pt 1), 27-47 (1990).
  3. Armstead, W. M. Cerebral blood flow autoregulation and dysautoregulation. Anesthesiolo Clin. 34 (3), 465-477 (2016).
  4. Claassen, J. A., Thijssen, D. H., Panerai, R. B., Faraci, F. M. Regulation of cerebral blood flow in humans: physiology and clinical implications of autoregulation. Physiol Rev. 101 (4), 1487-1559 (2021).
  5. Strandgaard, S., Paulson, O. Cerebral autoregulation. Stroke. 15 (3), 413-416 (1984).
  6. Iadecola, C. The neurovascular unit coming of age: a journey through neurovascular coupling in health and disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  7. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  8. Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
  9. Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nat Neurosci. 6 (1), 43-50 (2003).
  10. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  11. Grafton, S. T., et al. Functional anatomy of human procedural learning determined with regional cerebral blood flow and PET. J Neurosci. 12 (7), 2542-2548 (1992).
  12. Tillfors, M., et al. Cerebral blood flow in subjects with social phobia during stressful speaking tasks: a PET study. Am J Psychiatry. 158 (8), 1220-1226 (2001).
  13. Goense, J., Merkle, H., Logothetis, N. K. High-resolution fMRI reveals laminar differences in neurovascular coupling between positive and negative BOLD responses. Neuron. 76 (3), 629-639 (2012).
  14. Wang, J., et al. Perfusion functional MRI reveals cerebral blood flow pattern under psychological stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (49), 17804-17809 (2005).
  15. Takano, T., et al. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci. 9 (2), 260-267 (2006).
  16. Holstein-Rønsbo, S., et al. Glymphatic influx and clearance are accelerated by neurovascular coupling. Nat Neurosci. 26 (6), 1042-1053 (2023).
  17. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
  19. Cai, C., et al. Stimulation-induced increases in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (25), E5796-E5804 (2018).
  20. Xavier, A. L., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378(2018).
  21. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e939(2008).
  22. Liu, X., et al. Epoxyeicosatrienoic acid-dependent cerebral vasodilation evoked by metabotropic glutamate receptor activation in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H373-H381 (2011).
  23. Yamada, M., et al. Cholinergic dilation of cerebral blood vessels is abolished in M5 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 14096-14101 (2001).
  24. O'Regan, M. Adenosine and the regulation of cerebral blood flow. Neurol Res. 27 (2), 175-181 (2005).
  25. Morii, S., Ngai, A., Ko, K. R., Winn, H. R. Role of adenosine in regulation of cerebral blood flow: effects of theophylline during normoxia and hypoxia. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H165-H175 (1987).
  26. Park, L., et al. Aβ-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 24 (3), 334-342 (2004).
  27. Park, L., et al. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species mediate the cerebrovascular dysfunction induced by the amyloid β peptide. J. Neurosci. 25 (7), 1769-1777 (2005).
  28. Herz, J., et al. GABAergic neuronal IL-4R mediates T cell effect on memory. Neuron. 109 (22), 3609-3618.e9 (2021).
  29. Sun, Y. -Y., et al. Prophylactic edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).

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