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Articolo metodologico

Un approccio non virale per generare cellule T transitorie del recettore dell'antigene chimerico utilizzando l'mRNA per l'immunoterapia del cancro

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DOI:

10.3791/67548

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21 febbraio 2025

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1ProMab Biotechnologies

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea una procedura dettagliata per la generazione di cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) transitorio utilizzando mRNA non integrato per l'immunoterapia del cancro e fornisce metodi affidabili per valutare le cellule CAR-T e la loro funzione citotossica.

Abstract

La terapia con cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) è emersa come un trattamento pionieristico del cancro, ottenendo un successo senza precedenti nel trattamento di alcune neoplasie ematologiche come linfomi e leucemie. Tuttavia, poiché sempre più pazienti oncologici ricevono terapie cellulari CAR-T, le neoplasie primarie secondarie associate al trattamento vengono sempre più segnalate in parte a causa dell'inaspettato inserimento del transgene CAR, sollevando seri problemi di sicurezza. Per affrontare questo problema, descriviamo qui un approccio non virale e non integrativo per generare cellule CAR-T transitorie utilizzando l'mRNA. Abbiamo elettroporato le cellule T con mRNA modificato che codifica per un CAR specifico per il recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2) e generato cellule CAR-T transitorie mirate a HER2. Il CAR è stato espresso in modo efficiente sulla superficie delle cellule T 1 giorno dopo l'elettroporazione, è aumentato entro il giorno 2 e ha diminuito drasticamente entro il giorno 5. Le cellule CAR-T transitorie hanno mostrato una potente citotossicità contro le cellule di carcinoma ovarico SKOV-3 HER2-positive e hanno secreto alti livelli di IFN-Υ. Questo protocollo fornisce una guida passo passo per lo sviluppo di cellule CAR-T transitorie su piccola scala senza integrazione permanente del transgene CAR, descrivendo procedure dettagliate per la preparazione dell'mRNA CAR, l'attivazione e la trasfezione delle cellule T, la valutazione dell'espressione CAR e l'analisi in vitro della funzione delle cellule CAR-T. Questo metodo è adatto per la generazione transitoria di cellule CAR-T sia in studi preclinici che clinici.

Introduzione

Il cancro è una minaccia sempre più importante per la salute umana, con una stima annua di 23,6 milioni di nuovi casi diagnosticati e 10 milioni di decessi a livello globale1. Il trattamento chirurgico combinato con la radioterapia e la chemioterapia rimane il gold standard di cura per vari tipi di tumori localizzati non invasivi e invasivi 2,3,4. Sebbene il trattamento sistematico tradizionale abbia ottenuto un enorme successo nella gestione dei tumori in stadio iniziale, è molto tossico e ha un effetto limitato sui tumori metastatici ed ematologici5. I pazienti con questi tumori vengono sottoposti a trattamenti frequenti e subiscono una tossicità significativa nella speranza di stabilizzare e ritardare la progressione della malattia. La terapia con cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) è recentemente emersa come una terapia mirata rivoluzionaria che dimostra una potente efficacia per i tumori ematologici a cellule B e offre speranza a questi pazienti disperati6.

Le cellule CAR-T sono linfociti T ingegnerizzati che esprimono un CAR sulla superficie cellulare che riconosce specificamente gli antigeni associati al tumore (TAA) e attiva le cellule senza richiedere la presentazione antigenica da parte delle principali proteine del complesso di istocompatibilità (MHC)7. Dopo l'attivazione, le cellule CAR-T secernono un pannello di citochine e lisano le cellule tumorali indipendentemente dalle MHC, migliorando così la distruzione dei tumori anche quando le MHC sono sottoregolate o perse a causa del microambiente tumorale immunosoppressivo 8,9. I CAR sono costituiti da almeno tre domini distinti: una variante extracellulare a catena singola (scFv) contenente le regioni variabili che riconoscono l'antigene di un anticorpo specifico per TAA, un dominio transmembrana che ancora il CAR alla superficie cellulare e un dominio intracellulare che media il reclutamento della proteina adattatrice e la segnalazione a valle10. Sulla base delle variazioni nei domini intracellulari, le strutture CAR si sono evolute attraverso cinque generazioni finora, con la prima generazione che contiene solo il dominio di attivazione CD3ζ e le generazioni successive che possiedono uno o più domini costimolatori extra da molecole come 4-1BB e CD2811. Questi domini intracellulari influenzano i meccanismi di segnalazione delle cellule CAR-T, la proliferazione, la sopravvivenza e la tossicità, che insieme determinano l'efficacia clinica antitumorale. Il successo clinico della terapia cellulare CAR-T deriva dalle cellule CAR-T di seconda generazione che hanno come bersaglio specifico il CD19, un biomarcatore altamente espresso sulle cellule del lignaggio B, per il trattamento delle leucemie e dei linfomi a cellule B12,13. Ad oggi, la Food and Drug Administration (FDA) ha approvato sei terapie cellulari CAR-T di seconda generazione mirate al CD-19 o all'antigene di maturazione delle cellule B (BCMA) per neoplasie ematologiche recidivanti o refrattarie, tra cui il linfoma a grandi cellule B, il linfoma mantellare e il mieloma multiplo 6. Le nuove generazioni di cellule CAR-T sono attualmente in fase di studi preclinici e clinici intensivi 14,15.

La produzione clinica di cellule CAR-T è un processo complesso, costoso e dispendioso in termini di tempo. Attualmente, i leucociti utilizzati per la preparazione delle cellule CAR-T provengono dai pazienti stessi per evitare reazioni allogeniche, sebbene le cellule CAR-T universali (o pronte all'uso) derivate da donatori siano in fase di sviluppo attivo e valutazione clinica16. Dopo l'isolamento dei leucociti dal sangue periferico del paziente mediante leucaferesi, un frammento di gene estraneo che codifica per il CAR viene introdotto nelle cellule T attivate utilizzando approcci virali o non virali 17,18,19. I retrovirus e i lentivirus sono i vettori virali più comuni per la consegna del gene CAR, che si traduce in un'integrazione casuale e permanente del DNA codificante CAR nel genoma delle cellule T20. Gli approcci non virali, tra cui le nanoparticelle mRNA-lipidi, i sistemi di trasposoni e l'editing genomico CRISPR/Cas9, sono meno comuni21. Successivamente, le cellule T che esprimono CAR vengono espanse ex vivo su larga scala e quindi raccolte e reinfuse nei pazienti22,23. La produzione di vettori virali che soddisfano i rigorosi standard delle buone pratiche di fabbricazione (GMP) è molto difficile, complessa e costosa, e pone un onere significativo su produttori, agenzie regolatorie e pazienti, limitandone così l'ampia applicazione clinica.

Nonostante l'entusiasmante successo della terapia CAR-T, c'è una crescente preoccupazione per la sua sicurezza. Data la natura casuale dell'integrazione del transgene CAR nel genoma delle cellule T durante la trasduzione virale o dei trasposoni, può verificarsi l'interruzione dei geni oncosoppressori o l'attivazione di oncogeni, che porta alla trasformazione maligna delle cellule T24,25. Dall'approvazione da parte della FDA del primo prodotto di terapia cellulare CAR-T nel 2017, gli studi di follow-up mostrano che ben il 15% dei pazienti che ricevono la terapia sviluppa tumori maligni primari secondari (SPM) come il linfoma a cellule T (TCL), il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e il cancro della pelle 26,27,28,29. Sorprendentemente, i transgeni CAR sono stati altamente rilevati in alcuni SPM30,31 e alcuni casi di TCL sono stati direttamente causati da un'espansione anomala delle cellule CAR-T 24,32,33, indicando un ruolo diretto dei prodotti CAR-T nell'induzione di alcuni SPM. Altri studi hanno inoltre identificato l'inserzione di transgeni CAR in geni critici come TET234, JAK135 e PBX236 nelle cellule tumorali SPM. Alla luce dell'accumulo di prove di tumori maligni delle cellule T a seguito della terapia cellulare CAR-T, la FDA ha recentemente concluso che è necessaria un'avvertenza in scatola che evidenzi un grave rischio di malignità delle cellule T per tutte le terapie cellulari CAR-T attualmente approvate dirette al CD19 e mirate al BCMA37. Tuttavia, studi su un'ampia coorte che seguono gli effetti a lungo termine del trattamento con CAR-T riportano un'incidenza di SPM che varia dal 3,8% al 15% tra i pazienti trattati 26,27,28,38,39. L'incidenza non è significativamente superiore a quella osservata nei pazienti con carcinoma del sangue che ricevono un trattamento sistematico tradizionale40,41, suggerendo un profilo relativamente sicuro per la terapia cellulare CAR-T. Ciononostante, vi è l'urgente necessità di sviluppare cellule CAR-T sicure ed efficaci che riducano al minimo il rischio di SPM attraverso approcci più convenienti.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per un approccio non virale e non integrativo per generare cellule CAR-T. L'obiettivo è quello di fornire una guida semplice e passo dopo passo per generare cellule CAR-T efficaci e su piccola scala con espressione transitoria di CAR, evitando così la mutagenesi inserzionale e riducendo al minimo il rischio di SPM. Abbiamo dimostrato che l'elettroporazione di cellule T con mRNA modificato che codifica per un CAR specifico per TAA HER2 ha portato a un'espressione robusta e transitoria del CAR anti-HER2 sulla superficie delle cellule T. Durante l'espressione del CAR, le cellule T hanno ucciso potentemente le cellule tumorali HER2-positive e hanno secreto un alto livello di IFN-Υ. Il protocollo è descritto in quattro sezioni separate ma continue che includono la preparazione dell'mRNA CAR, l'attivazione e l'elettroporazione delle cellule T, la valutazione dell'espressione di CAR e l'analisi della funzione delle cellule CAR-T. Questo approccio è adatto per lo sviluppo e la produzione di cellule CAR-T transitorie sia per la ricerca accademica che per le terapie cellulari cliniche.

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Protocollo

I PBMC utilizzati qui sono stati precedentemente isolati da sangue intero proveniente dallo Stanford Hospital Blood Center secondo il protocollo approvato dall'Institutional Review Board (IRB) (13942) utilizzando il gradiente di densità di Ficoll-Paque descritto prima di42. Il consenso informato dei partecipanti non era applicabile in quanto il sangue che abbiamo utilizzato per raccogliere i PBMC è stato ottenuto commercialmente dallo Stanford Hospital Blood Center.

1. Preparazione dell'mRNA CAR

  1. Preparazione del modello
    NOTA: Sia un plasmide linearizzato che un frammento di PCR possono fungere da modello per sintetizzare l'mRNA CAR in vitro, a condizione che contengano un promotore 5' SP6 o T7 appropriato, una regione non tradotta 5' (UTR), un transgene CAR e un 3'UTR con una coda di poli(A) appropriata. In questo studio, abbiamo utilizzato un costrutto di DNA plasmidico CAR contenente un promotore SP6, una beta-globina umana corta 5'UTR, un transgene CAR e un 3'UTR composto da due beta-globina tandem 3'UTR seguite da una coda43 di poli(A) da 112 bp. Gli UTR, la sequenza codificante e la coda di poli(A) influenzano tutti la stabilità dell'RNA e l'efficienza traduzionale 43,44,45. È stato dimostrato che una coda di poli(A) di 120 bp aumenta la resa proteica in coltura cellulare rispetto alle code di poli(A) più corte43.
    1. Preparare il DNA plasmidico del costrutto CAR utilizzando un kit di preparazione del plasmide secondo le istruzioni del produttore. Il DNA plasmidico di alta qualità è essenziale per generare un'elevata resa di mRNA CAR.
    2. Linearizzare il DNA plasmidico CAR con l'enzima di restrizione BglII. Scegli un enzima di restrizione che tagli dopo la coda di poli(A), preferenzialmente vicino all'estremità della coda di poli(A). Digerire 10 μg (o 10.000 ng) del plasmide quantificato da uno spettrofotometro in una miscela di reazione da 100 μl contenente 10 U dell'enzima, 10 μl di tampone di digestione e acqua priva di nucleasi per una notte a 37 °C.
      NOTA: Assicurarsi che l'enzima di restrizione non tagli all'interno del transgene CAR e delle sue sequenze promotorie fiancheggiatrici, UTR e poli(A) di coda. La linearizzazione completa del plasmide CAR è necessaria per un'efficiente trascrizione dell'mRNA CAR.
    3. Aggiungere 200 μg/mL di proteasi K e 0,5% p/v di SDS nella miscela di digestione e incubare a 50 °C per 1 ora.
    4. Purificare il DNA plasmidico CAR linearizzato. Aggiungere un volume uguale di fenolo: cloroformio: alcol isoamilico (25:24:1, v/v) alla reazione di digestione. Agitare energicamente per circa 15 s. Centrifugare il campione in una centrifuga da banco alla massima velocità per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
    5. Trasferire lo strato acquoso superiore, che contiene il DNA, in una nuova provetta da microcentrifuga. Evitare il trasferimento di uno qualsiasi degli strati intermedi e inferiori, che contengono impurità proteiche e fenoliche. Eseguire un secondo ciclo di estrazione con cloroformio per ridurre le impurità.
    6. Aggiungere 1/10di volume di acetato di ammonio 7,5 M o acetato di sodio 3 M e mescolare delicatamente. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo per far precipitare il DNA. Conservare il campione a -20 °C per almeno 30 minuti.
    7. Centrifugare il campione alla massima velocità per 15 minuti a 4 °C per pellettare il DNA. Rimuovere con cura il surnatante. Aggiungere 500 μl di etanolo al 70% per lavare il pellet di DNA.
    8. Centrifugare nuovamente il campione per 2 minuti a 4 °C. Rimuovere con cautela il surnatante. Lasciare una piccola quantità di soluzione nel tubo.
    9. Ripetere la centrifuga per 2 minuti a 4°C. Rimuovere con cautela il surnatante rimanente. Asciugare all'aria il pellet di DNA a RT per circa 10 minuti in una cappa sterile fino a quando non è visibile alcuna soluzione di etanolo sul fondo della provetta.
      NOTA: Evitare di asciugare eccessivamente il pellet di DNA, poiché potrebbe essere difficile da sciogliere.
    10. Aggiungere 20 μl di acqua priva di nucleasi e pipettare delicatamente su e giù per sciogliere il DNA. Centrifugare brevemente il campione alla massima velocità. Misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro.
    11. Conservare il campione su ghiaccio per un uso immediato o a -20 °C per un uso futuro. Caricare 100 ng di DNA purificato su un gel di agarosio e verificarne le dimensioni e l'integrità. Il DNA dovrebbe apparire come una singola banda distinta delle dimensioni previste. Non si devono osservare bande extra o macchiate.
      NOTA: La qualità del DNA stampo è fondamentale per un'efficiente trascrizione dell'mRNA. Evitare di utilizzare DNA impuro, frammentato e degradato come modello per la trascrizione dell'mRNA.
  2. Trascrizione in vitro (IVT)
    1. Sintetizzare l'mRNA CAR in vitro. Assicurati di utilizzare reagenti, provette e puntali per pipette privi di nucleasi durante le procedure.
    2. Scongelare i reagenti elencati nella tabella 1 della RT, ad eccezione della miscela di RNA polimerasi SP6, che deve essere conservata a -20 °C fino all'uso. Preparare la reazione di trascrizione nell'ordine indicato nella Tabella 1 di RT. Mescolare delicatamente e incubare a 37 °C per almeno 2 ore.
      NOTA: La reazione può essere aumentata o diminuita in base alla quantità di mRNA necessaria. La reazione mostrata sopra produce tipicamente almeno 100 μg (o 100.000 ng) di mRNA con cappuccio quando si utilizza DNA stampo di alta qualità. Un'incubazione più lunga, cioè durante la notte, può aumentare la resa dell'mRNA.
    3. Aggiungere 2 μl di DNasi I priva di RNasi alla reazione, mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti a 37 °C per degradare il DNA stampo.
    4. Purificare l'mRNA CAR trascritto utilizzando un kit di pulizia dell'RNA (vedere la tabella dei materiali). Seguire le istruzioni del produttore del kit per la purificazione. Eluire l'mRNA in acqua priva di nucleasi.
      NOTA: L'mRNA può anche essere purificato utilizzando il metodo di estrazione fenolo-cloroformio mostrato sopra (passaggio 1.1.4).
    5. Misurare la concentrazione di mRNA con uno spettrofotometro. Caricare almeno 200 ng di mRNA su un gel di agarosio e verificarne le dimensioni e l'integrità. L'mRNA dovrebbe apparire come una banda dominante delle dimensioni previste, senza bande aggiuntive o spalmate. Conservare l'mRNA a -80 °C fino al momento dell'uso.

2. Attivazione ed elettroporazione delle cellule T

  1. Sospendere 1 x 106 cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) crioconservate in 1 ml di terreno CAR-T (terreno AIM-V integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina/streptomicina e 10 ng/ml di IL-2 ricombinante umana). Attivare le cellule T con un numero uguale di perle CD3/CD28 di Human T-Activator CD3/CD28 prelavate (vedi Tabella dei Materiali). Coltivare ed espandere le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 per diversi giorni.
    NOTA: La quantità di PBMC può essere aumentata o diminuita in base alla quantità di cellule T necessarie per gli esperimenti successivi.
  2. Scongelare l'mRNA CAR preparato con ghiaccio. Aggiungere 1 mL di terreno CAR-T per pozzetto a due pozzetti di una piastra a 12 pozzetti ed equilibrare il terreno posizionando la piastra nell'incubatore a 37 °C.
  3. Trasferire 5 x 106 cellule T in una provetta sterile e rimuovere le perle inserendo la provetta su un supporto magnetico e pipettando accuratamente la sospensione cellulare in una nuova provetta.
  4. Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS sterile.
  5. Centrifugare nuovamente la provetta. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 200 μL di tampone Neon T (vedi Tabella dei materiali).
  6. Pipettare 100 μL di cellule in una nuova provetta e aggiungere 5 μg (o 5.000 ng) di mRNA CAR alle cellule46. Integrare il tampone Neon T fino a un totale di 125 μL e miscelare pipettando su e giù.
    NOTA: La quantità di mRNA CAR da trasfettare mediante elettroporazione può essere aumentata fino a 8 μg (o 8.000 ng) per 1 x 106 cellule T senza influire negativamente sulla vitalità cellulare, e una quantità maggiore di mRNA può portare ad un aumento dell'espressione di CAR46.
  7. Aggiungere 25 μl di tampone Neon T alle restanti celle da 100 μl. Questo serve come controllo negativo.
  8. Elettroporare le cellule T. Utilizzare la pipetta al neon per aspirare la miscela di cellule T/mRNA CAR o le cellule T di controllo negativo in una punta Neon da 100 μL ed elettroporare le cellule con un impulso di 10 ms di 1800 V.
  9. Trasferire immediatamente le cellule nel terreno di coltura bilanciato nella piastra a 12 pozzetti (preparata al punto 2.2) dopo l'elettroporazione.
  10. Rimetti la piastra nell'incubatore ed espandi le celle fino al momento dell'uso. Per garantire una crescita sana e rapida delle cellule CAR T, mantenere la densità cellulare tra 1-3 x 10e 6 cellule/mL con terreno fresco fino al momento del bisogno.

3. Valutazione dell'espressione RCA

  1. Miscelare le cellule CAR T pipettandole delicatamente su e giù più volte in ciascun pozzetto e trasferire almeno 1 x 105 cellule in una provetta FACS da 5 mL.
  2. Aggiungere 3 mL di tampone di lavaggio a freddo (PBS contenente 2 mM di EDTA e 0,5% p/v BSA) nella provetta. Centrifugare la provetta a 500 x g per 5 minuti a RT. Rimuovere con cura il surnatante.
  3. Risospendere il pellet di cella in 100 μl di tampone di lavaggio. Aggiungere 2 μl del reagente di rilevazione CAR anticorpo IgG F(ab')2 di capra coniugato con alloficocianina (APC) (vedere la tabella dei materiali) e 2 μl di un colorante vitale 7-AAD nelle cellule sospese.
    NOTA: Il CAR può anche essere rilevato utilizzando un antigene bersaglio opportunamente marcato o un anticorpo anti-tag se il CAR contiene un tag (ad esempio, FLAG). Se per la rilevazione delle CAR viene utilizzato un anticorpo non marcato, è necessaria l'incubazione con un anticorpo secondario marcato con fluorescenza appropriato dopo la fase 3.4.
  4. Mescolare il campione agitando delicatamente la provetta e incubare con ghiaccio per 30 minuti. Evitare la luce durante l'incubazione. Lavare le cellule con 3 mL di tampone di lavaggio a freddo e centrifugare la provetta a 500 x g per 5 minuti a RT.
  5. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μL di tampone di lavaggio. Analizzare immediatamente le cellule utilizzando un citometro a flusso. Assicurarsi che l'etichetta fluorescente del reagente di rilevamento e il colorante di vitalità siano adeguatamente compensati utilizzando appropriati controlli positivi e negativi.
  6. Valutare l'espressione CAR utilizzando la seguente strategia di gating: Gate sulle celle utilizzando il grafico FSC-A vs SSC-A; Gate sulle singole celle utilizzando il grafico FSC-A vs FSC-H; Gate sulle cellule vive utilizzando la colorazione 7-AAD.
  7. Calcola la percentuale di cellule T vive che sono state colorate dall'anticorpo anti-umano IgG F(ab')2. Confronta le cellule CAR-T con le cellule T di controllo negative, che dovrebbero avere una colorazione minima.

4. Analisi della funzione delle cellule CAR-T

  1. Analisi di citotossicità
    1. Assicurarsi che le cellule tumorali bersaglio esprimano l'antigene in una conformazione che possa essere riconosciuta dal CAR. Per confermare l'espressione dell'antigene, analizzare le cellule tumorali mediante citometria a flusso utilizzando l'anticorpo genitore da cui è derivato il CAR. Se il CAR non è in grado di riconoscere le cellule tumorali, le cellule CAR-T non riusciranno a uccidere le cellule tumorali.
    2. Preparare le cellule tumorali bersaglio che esprimono l'antigene del CAR sulla superficie cellulare. Tripsinizzare le cellule tumorali aderenti con una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% per 1 minuto a 37 °C e preparare una sospensione a singola cellula con un terreno di coltura appropriato a 1-4 x 105 cellule/mL.
      NOTA: Le cellule tumorali devono essere ben aderenti per garantire un'analisi accurata nelle fasi successive. Se le cellule tumorali aderiscono male, si staccano facilmente o crescono in sospensione, rivestire i pozzetti della piastra utilizzata nella fase successiva con un anticorpo appropriato, un polimero policationico o materiale biologico come fibronectina o collagene per facilitare l'adesione delle cellule.
    3. Preparare una E-Plate (vedi Tabella dei materiali). Progetta la configurazione sperimentale. Aggiungere 50 μl di terreno di coltura di cellule tumorali preriscaldato in ciascun pozzetto e posizionare la E-Plate nello strumento RTCA (Real-Time Cell Analysis) per misurare l'impedenza di fondo. Misurare l'impedenza a 1 minuto per misurazione (o sweep) per 3 sweep.
      NOTA: L'impedenza di fondo viene utilizzata per impostare l'indice della cella su zero. Senza la misurazione dell'impedenza di fondo, i pozzetti non possono essere confrontati tra loro, rendendo i risultati non interpretabili.
    4. Rimuovere la E-Plate dallo strumento RTCA e aggiungere 100 μl di sospensione di cellule tumorali a ciascun pozzetto. Pertanto, ogni pozzetto contiene 1−4 x 104 celle in un volume totale di 150 μl.
      NOTA: Il numero di cellule tumorali da seminare in ciascun pozzetto deve essere determinato prima dell'esperimento. Semina la piastra E con un intervallo di numeri di cellule, quindi monitora gli indici delle cellule nelle successive 24-48 ore. Il numero desiderato di cellule mantiene un aumento costante dell'indice cellulare per almeno 24 ore senza stabilizzarsi. Un'eccessiva semina cellulare può accelerare l'esaurimento dei nutrienti e l'acidificazione media, con conseguente plateau precoce dell'indice cellulare. Inoltre, i pozzetti di replica dovrebbero essere inclusi per ciascun gruppo per identificare potenziali misurazioni anomale.
    5. Equilibrare la E-Plate a RT per 30 minuti. Questo passaggio consente alle cellule tumorali di depositarsi e aderire al fondo dei pozzetti.
      NOTA: Questo passaggio è necessario per una misurazione accurata dell'indice cellulare. Saltare questo passaggio di solito causa variabilità da pozzetto a pozzetto nelle misurazioni dell'indice cellulare e un'adesione non uniforme delle cellule tumorali all'interno dei pozzetti, con conseguente aumento del rumore nel saggio.
    6. Riposizionare la E-Plate sullo strumento RTCA e monitorare gli indici delle celle per circa 24 ore, con scansioni effettuate ogni 5-15 minuti.
    7. Il giorno successivo, preparare la sospensione delle celle CAR-T. Sospendere le cellule CAR-T (le cellule effettrici) dal passaggio 2.10 nel terreno RPMI 1640 più il 10% di FBS a una concentrazione determinata dalla cellula tumorale (la cellula bersaglio) e dal rapporto effettore:cellula bersaglio (E:T) desiderato. Ad esempio, se la sospensione delle cellule tumorali aveva una densità di 2 x 105 cellule/mL e si desidera un rapporto E:T di 10:1, allora le cellule CAR-T devono essere sospese a 2 x 106 cellule/mL. Includere controlli adeguati come le sole cellule tumorali (nessuna cellula effettrice) e le cellule T di controllo (cellule T elettroporate senza mRNA o con mRNA di controllo).
      NOTA: Per risultati ottimali, utilizzare le cellule CAR-T 1-2 giorni dopo l'elettroporazione quando l'espressione CAR di superficie è elevata. Per esplorare il rapporto E:T ottimale, è possibile testare una gamma di rapporti E:T (ad esempio, da 3:1 a 20:1). A meno che la frequenza CAR-T non sia molto bassa, cioè inferiore al 10%, un rapporto E:T di 10:1 o 20:1 è solitamente sufficiente per ottenere l'uccisione quasi completa delle cellule tumorali.
    8. Mettere in pausa la registrazione dell'indice delle celle e rimuovere la E-Plate dallo strumento RTCA.
    9. Inclinare leggermente la piastra, rimuovere con cura 50 μL di terreno di coltura da ciascun pozzetto senza toccare le cellule tumorali e aggiungere 100 μL di cellule CAR-T o di cellule T di controllo in ciascun pozzetto.
    10. Riportare la E-Plate nello strumento RTCA e riprendere il monitoraggio dell'indice cellulare per almeno 24 ore con scansioni effettuate ogni 5-15 minuti.
      NOTA: La durata del monitoraggio dell'indice cellulare dipende dalla velocità con cui le cellule CAR-T prendono di mira le cellule tumorali. Un periodo di incubazione di 24 ore è solitamente sufficiente affinché le cellule CAR-T esercitino il massimo effetto citotossico.
    11. Interrompere il monitoraggio dell'indice cellulare, rimuovere la E-Plate dallo strumento RTCA e analizzare il risultato della citotossicità. Calcola la citotossicità come la percentuale di cellule tumorali che sono state uccise dalle cellule CAR-T. Calcola la citotossicità media delle cellule CAR-T e controlla le cellule T utilizzando il software RTCA. Per calcolare manualmente la citotossicità, utilizzare la formula
      citotossicità = ((indice cellulare delle cellule tumorali) − (indice cellulare delle cellule tumorali più cellule effettrici)) / (indice cellulare delle cellule tumorali) × 100%.
  2. Analisi della secrezione di citochine
    1. Per analizzare le citochine come l'IFN-Υ secrete dalle cellule CAR-T durante l'analisi di citotossicità, trasferire il surnatante dalla piastra E a una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo o a forma di V.
      NOTA: Se si desidera un'analisi dell'andamento temporale della secrezione di citochine, sospendere il monitoraggio dell'indice cellulare al passaggio 4.1.10, raccogliere una piccola porzione del surnatante da ciascun pozzetto, reinserire la piastra E nello strumento RTCA e riprendere il monitoraggio.
    2. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 300 x g per 5 minuti a RT. Trasferire con cura i surnatanti in una nuova piastra a 96 pozzetti senza disturbare i pellet della cella.
    3. Misurare i livelli di citochine nei surnatanti utilizzando i kit ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) commerciali secondo le istruzioni del produttore. I surnatanti di solito richiedono una diluizione prima della misurazione, a volte superiore a 100 volte, a seconda delle citochine analizzate.
    4. Analizzare i dati interpolando i valori di assorbanza del campione rispetto a una curva standard generata da standard diluiti in serie. Preparare grafici con barre di errore che rappresentano la media ± la deviazione standard (SD) utilizzando un software appropriato. Per confrontare la differenza tra i trattamenti, è possibile eseguire un test t di Student. Un valore p inferiore a 0,05 è solitamente considerato statisticamente significativo.
      NOTA: i punti dati che sono chiaramente anomali, probabilmente dovuti a errori sperimentali, devono essere esclusi dall'analisi.

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Risultati

Abbiamo costruito un CAR mirato a HER2 di seconda generazione contenente un scFv derivato dall'anticorpo monoclonale di topo (mAb) umanizzato anti-HER2 4D547, una regione transmembrana e un dominio costimolatorio intracellulare 4-1BB seguito dal dominio di attivazione CD3ζ (Figura 1A). La sequenza di DNA che codifica per il CAR conteneva un promotore 5' SP6 per guidare la trascrizione dell'mRNA del CAR in vitro (Figura 1B). L'mRN...

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Discussione

In questo studio, descriviamo un approccio dettagliato non virale e non integrativo per la generazione di cellule CAR-T transitorie e forniamo procedure tecniche per valutare la funzione delle cellule CAR-T. Questo approccio evita l'uso di vettori retrovirali e lentivirali convenzionali per la consegna permanente e casuale di transgeni CAR, sfruttando invece l'elettroporazione per introdurre in modo efficiente l'mRNA CAR modificato in vitro nelle cellule T. Questo metodo consent...

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Dichiarazioni

Gli autori Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li e Vita Golubovskaya sono dipendenti di ProMab Biotechnologies. Lijun Wu è un dipendente e azionista di ProMab Biotechnologies.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da ProMab Biotechnologies.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Colorante vitale 7-AAD Biolegend420404
ACEA Citometro a flusso per novocitiAgilentNovoCyte 3000
AIM-V mediumGibco12055083
APC capra anticorpo IgG F(ab')2 umanoJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
Enzima di restrizione BglIINew England BioLabs (NEB)R0144L
3&acuto;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Struttura AnalogicoNEBS1411S
DMEM, alto glucosioGibco11965092
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 perlineGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
Kit di sintesi dell'RNA HiScribe SP6 NewEngland BioLabs (NEB)E2070S
Proteina ricombinante umana IL-2Gibco15140122
Millennium RNA MarkersInvitrogenAM7150
Monarch (500 μ g)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Strumento di trasfezione al neonInvitrogenMPK5000
Sistema di trasfezione al neon 100-μ L KitInvitrogenMPK10096
Penicillina-Streptomicina (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MediumGibco11875135
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenoloGibco25300120
Fenolo ultrapuro:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Strumento per l'analisi cellulare in tempo reale (RTCA)AgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmid Midiprep KitZymo ResearchD4201
Kit di pulizia dell'RNA

Riferimenti

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