Method Article

Identificazione di siti di integrazione di lentivirus funzionalmente rilevanti in una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale

DOI:

10.3791/67552

⸱

January 10th, 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mutagenesi inserzionale è uno strumento essenziale nella genetica avanzata per identificare gli elementi genomici funzionali. Qui, descriviamo l'Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), un metodo per rilevare i siti di integrazione dei lentivirus all'interno di una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale basata su lentivirus.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'estensione delle sequenze funzionali all'interno del genoma umano è un argomento cruciale ma dibattuto in biologia. Sebbene gli screening genetici inversi ad alto rendimento abbiano fatto passi da gigante nell'esplorazione di questo aspetto, spesso limitano il loro campo di applicazione a elementi genomici noti e possono introdurre effetti non specifici. Ciò sottolinea l'urgente necessità di nuovi strumenti di genomica funzionale che consentano una comprensione più profonda e imparziale della funzionalità del genoma. Questo protocollo introduce l'Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), un metodo per identificare i siti di integrazione dei lentivirus all'interno di una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale basata su lentivirus. InSET facilita la cattura di siti di integrazione lentivirale a livello di genoma, con il sequenziamento di nuova generazione utilizzato per rilevare e quantificare le sequenze fiancheggianti. Il design di InSET consente l'analisi delle variazioni di abbondanza del sito di integrazione negli schermi fenotipici su larga scala, affermandolo come uno strumento robusto per la genetica avanzata e per l'identificazione di elementi genomici funzionali. Un vantaggio chiave di InSET è la sua capacità di rivelare elementi genomici precedentemente non identificati, inclusi nuovi esoni funzionali di RNA codificanti e non codificanti per proteine, indipendentemente dall'annotazione precedente. Nel complesso, InSET ha un valore significativo nello studio dell'intricata complessità del genoma umano e del trascrittoma, dove molti elementi genomici attendono la caratterizzazione funzionale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La genomica funzionale rimane un campo cruciale e impegnativo, anche nell'era post-genoma, con una parte significativa delle regioni genomiche ancora prive di caratterizzazione funzionale. Una ragione chiave per queste sfide risiede nella natura intricata del genoma umano e del trascrittoma, che sono caratterizzati da una trascrizione pervasiva e da uno splicing alternativo universale sia nelle regioni codificanti che in quelle non codificanti1,2,3,4,5. Questa complessità è stata ampiamente evidenziata attraverso studi di arricchimento mirati all'RNA6,7,8,9. È sempre più riconosciuto che numerosi nuovi elementi genomici rimangono non mappati e funzionalmente non annotati10,11,12oltre ai segmenti ben annotati del genoma umano.

Negli ultimi anni, si sono visti progressi negli strumenti di genetica inversa, come l'interferenza dell'RNA (RNAi) e i sistemi CRISPR/Cas13,14,15,16,17,18,19,20,21. Tuttavia, questi metodi presentano notevoli svantaggi, inclusi effetti non specifici e costi elevati associati alla generazione di librerie complesse di RNA a forcina corta (shRNA) o RNA guida singola (sgRNAs)22,23,24,25. Inoltre, questi metodi si concentrano prevalentemente su elementi genomici annotati. Al contrario, la genetica avanzata ha il vantaggio di identificare nuovi elementi genomici funzionali non annotati. Data la complessità del genoma umano e del trascrittoma, nonché il vasto numero di nuovi elementi genomici, questa capacità della genetica avanzata è di notevole importanza.

Le librerie cellulari di genetica diretta sono spesso generate attraverso l'integrazione retrovirale casuale, rendendo il rilevamento efficiente dei siti di integrazione dell'intero genoma cruciale per un saggio di genetica in avanti. Il rilevamento di questi siti di integrazione in genere coinvolge strumenti di camminamento del genoma26. Sebbene ci siano stati progressi significativi in questi strumenti, pochi sono ottimizzati per applicazioni di sequenziamento di nuova generazione (NGS) e successivamente applicati negli studi di mutagenesi inserzionale. La mutagenesi inserzionale nelle linee cellulari utilizza spesso metodi come la PCR inversa (I-PCR) o la PCR mediata dall'amplificazione lineare (LAM-PCR) per rilevare i siti di integrazione27,28,29. Questi metodi, tuttavia, di solito richiedono la digestione con enzimi di restrizione o fasi di legatura, che possono ridurre l'efficienza e introdurre distorsioni nei risultati.

Per migliorare l'efficiente rilevamento dei siti di integrazione dell'intero genoma negli screening genetici in avanti, è stato introdotto un metodo chiamato InSET (Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts). Integrando il genome-walking con NGS, InSET consente l'identificazione ad alto rendimento dei siti di integrazione dei lentivirus nelle librerie di mutagenesi inserzionale basate su lentivirus. Rispetto ai metodi esistenti27,28,29, InSET è relativamente diretto e semplice, eliminando le fasi di digestione o legatura dell'enzima di restrizione, rendendolo più comodo e accessibile. Inoltre, sebbene l'attuale screening genetico in avanti nelle cellule di mammifero sia limitato a pochissime linee cellulari aploidi o quasi aploidi27,28,29,30,31, InSET ha dimostrato di funzionare in linee cellulari aneuploidi32.

Questo studio fornisce un protocollo dettagliato e passo dopo passo per l'implementazione del metodo InSET. Inoltre, dimostra l'applicazione di InSET negli studi di mutagenesi inserzionale. InSET funge da potente strumento per identificare nuovi esoni all'interno di elementi genomici, comprendendo sia RNA codificanti proteine che non codificanti in linee cellulari umane.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La Figura 1 fornisce una panoramica schematica del metodo InSET. Per una copertura ottimale, preparare cinque librerie parallele da 1 μg di DNA genomico, quindi raggrupparle per il sequenziamento di nuova generazione. Questa procedura è stata completata con successo continuamente nei test precedenti, anche se gli utenti possono introdurre punti di pausa a loro discrezione. Informazioni dettagliate sui reagenti e sulle attrezzature utilizzate in questo studio sono disponibili nella Tabella dei materiali.

1. Cattura dei siti di integrazione dei lentivirus nel genoma

  1. Utilizzare il DNA genomico isolato da una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale basata su lentivirus (1 μg), come descritto in uno studio precedente32, come modello per una PCR lineare in una reazione da 50 μL contenente 1x tampone Taq, 2,5 U Taq DNA polimerasi, 4 μL di miscela dNTP (2,5 mM ciascuno) e 0,3 μM di primer biotinilato 3-LTR_prime (Tabella 1) in una provetta PCR.
    NOTA: Il primer a 3 LTR_prime ricottura nella regione LTR della sequenza del lentivirus. Se ricottura al 5' LTR, il frammento amplificato include la sequenza genomica fiancheggiante. Se ricottura al 3' LTR, il frammento amplificato contiene una sequenza interna di lentivirus, che non può essere allineata al genoma ospite e che, pertanto, verrà filtrata durante l'analisi dei dati di sequenziamento a valle. Questo primer può anche essere modificato per adattarsi ad altri tipi di vettori utilizzati per generare una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale.
  2. Eseguire 50 cicli di PCR lineare in un termociclatore PCR standard, aggiungendo 2,5 U di Taq DNA polimerasi all'inizio e di nuovo subito dopo 25 cicli. Le condizioni di PCR sono le seguenti: 94 °C per 5 min; 50 cicli a 94 °C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; 72 °C per 5 min.
    NOTA: Per mantenere l'attività della Taq DNA polimerasi durante le reazioni prolungate, si raccomanda di aggiungere l'enzima sia all'inizio che al punto medio della reazione.
  3. Trasferire i prodotti PCR in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml pulita.
  4. Miscelare accuratamente i prodotti della PCR con 10 μL di biglie magnetiche di biotina-streptavidina.
  5. Incubare la miscela per 2 ore a temperatura ambiente, agitando a 400 giri/min in un bagno di metallo.
    NOTA: Estrarre la provetta per mescolare bene con la pipetta ogni 15 minuti.
  6. Utilizzare un supporto magnetico per raccogliere le perline, quindi rimuovere con cura il surnatante.
  7. Lavare le perle con 300 μL di tampone legante/lavaggio (10 mM di Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM di EDTA, 1 M di NaCl, 0,1% Tween-20) 6 volte e scartare il surnatante.
  8. Lavare due volte con 300 μl (65 °C) di acqua distillata priva di DNasi/RNasi ed eliminare il surnatante.
  9. Per la sintesi del secondo filamento, risospendere le perle in un volume di reazione di 24 μl contenente 1x tampone per frammenti Klenow, 2 μl di miscela dNTP (2,5 mM ciascuna) e 6,25 μM di primer P5_N6 (Tabella 1) in una provetta per PCR.
    NOTA: Preparare una soluzione madre da 100 μM di primer P5_N6. Il primer P5_N6 è composto da una sequenza fissa di adattatori P5 all'estremità 5' e da una sequenza di esameri casuale all'estremità 3'. L'esamero casuale può legarsi a una vasta gamma di sequenze bersaglio, rendendolo adatto per amplificare vari frammenti di DNA generati attraverso la PCR lineare.
  10. Pre-incubare la miscela a 15 °C per 20 minuti in un termociclatore per PCR.
  11. Aggiungere 2 U di frammento di Klenow (frammento grande di E.coli DNA polimerasi).
  12. Incubare le miscele in un termociclatore per PCR alle seguenti condizioni: rampa lenta a 0,5 °C/min da 15 °C a 25 °C seguita da 30 minuti di incubazione; quindi rampa lenta a 0,5 °C/min a 37 °C seguita da 1 ora di incubazione.
  13. Trasferire i prodotti PCR in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml pulita.
  14. Utilizzare un supporto magnetico per catturare le perline, quindi scartare il surnatante.
  15. Lavare delicatamente le perle con 300 μl di acqua distillata priva di DNasi/RNasi a 4 °C. Raccogli le perline e scarta il surnatante.

2. Costruzione di una libreria NGS con PCR nidificata

  1. Risospendere le perle del passaggio 1.15 in un volume di reazione PCR da 25 μL contenente 1x tampone Taq, 1,25 U Taq DNA polimerasi, 0,5 μM di primer P5 (Tabella 1), 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM ciascuna) e 0,5 μM di primer 3-LTR_Nest (Tabella 1) in una provetta PCR.
  2. Eseguire le reazioni di PCR in un termociclatore PCR nelle seguenti condizioni: 94 °C per 3 min; 20 cicli di 94 °C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 30 s; 72 °C per 7 min.
  3. Utilizzare 5 μL dei prodotti PCR del passaggio 2.2 come modello per il successivo ciclo di PCR in un volume di 50 μL contenente 1x tampone Taq, 2,5 U Taq DNA polimerasi, 4 μL di miscela dNTP (2,5 mM ciascuno), 0,4 μM di Illumina_P5 di primer (Tabella 1) e 0,4 μM di primer Illumina_P7-3LTR (Tabella 1).
  4. Eseguire le reazioni di PCR in un termociclatore PCR nelle seguenti condizioni: 94 °C per 3 minuti; 15 cicli di 94 °C per 30 secondi, 55 °C per 30 secondi e 72 °C per 30 secondi; 72 °C per 7 minuti.
  5. Trasferire i prodotti della PCR in una provetta da centrifuga pulita da 1,5 ml.
    NOTA: In questa fase il protocollo può essere messo in pausa e i campioni possono essere conservati a -20 °C.
  6. Purificare i prodotti PCR utilizzando 1,2 volte i volumi di perle di DNA pulito, portando il volume finale a 21 μL.
    NOTA: Prelevare 10 μl di prodotti PCR da ciascuna delle 5 librerie preparate in parallelo, raggrupparli insieme e purificarli fino a un volume finale di 21 μl. Il protocollo di purificazione per i prodotti PCR è adattato dalle istruzioni del produttore per le perle di DNA clean (vedi Tabella dei materiali).
    1. Equilibrare le perle da 2-8 °C a temperatura ambiente per 30 minuti.
    2. Mescolare accuratamente le perle invertendo o vortice.
    3. Pipettare 1,2 volte i volumi delle microsfere in una provetta da centrifuga pulita da 1,5 mL.
    4. Aggiungere i prodotti PCR nelle perle e mescolare accuratamente pipettando su e giù 10 volte.
    5. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire il legame del DNA alle perle.
    6. Posizionare i campioni su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante una volta che la soluzione è limpida (circa 5 minuti).
    7. Aggiungere 200 μl di etanolo all'80% per lavare le perle, incubare a temperatura ambiente per 30 s e rimuovere il surnatante.
      NOTA: L'etanolo all'80% deve essere preparato fresco.
    8. Ripetere il passaggio 2.6.7 una volta.
    9. Asciugare le perle all'aria a temperatura ambiente con il coperchio aperto per circa 5 minuti.
    10. Estrarre la provetta dal supporto magnetico, aggiungere 22 μl di acqua distillata priva di DNasi/RNasi, mescolare accuratamente pipettando su e giù 10 volte e lasciarla riposare a temperatura ambiente per 2 minuti.
    11. Posizionare la provetta sul supporto magnetico fino a quando la soluzione non è limpida (circa 2 minuti), quindi trasferire 21 μL di surnatante in una provetta da centrifuga pulita da 1,5 mL.
      NOTA: In questa fase il protocollo può essere messo in pausa e i campioni possono essere conservati a -20 °C.
  7. Utilizzare 1 μL di prodotti PCR purificati per misurare la concentrazione utilizzando il fluorimetro con il kit di rilevamento della fluorescenza dsDNA disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: Il protocollo di misurazione della concentrazione segue le istruzioni del produttore per il kit di rilevamento del dsDNA.
    1. Preparare la preparazione della soluzione di lavoro mescolando il reagente e il tampone (forniti nel kit) in un rapporto di 1:200.
    2. Preparare gli standard del saggio mescolando 10 μL di Standard #1 e 10 μL di Standard #2 (forniti nel kit), ciascuno con 190 μL di soluzione di lavoro. Agitare delicatamente il composto per 2-3 s.
    3. Preparare il campione di analisi mescolando 1 μl di prodotti PCR purificati con 190 μl di soluzione di lavoro. Agitare delicatamente il composto per 2-3 s.
    4. Incubare gli standard del saggio e i campioni del saggio per 2 minuti a temperatura ambiente, mantenendoli al riparo dalla luce.
    5. Accendi il fluorimetro.
    6. Selezionare il programma dsDNA High Sensitivity dal menu principale.
    7. Per la calibrazione, inserire lo standard #1 nella macchina, premere il pulsante Leggi standard per misurare il primo standard, quindi inserire lo standard #2 e premere il pulsante Leggi standard per misurare il secondo standard.
    8. Per la misurazione del campione, premere il pulsante Esegui campioni per accedere alla pagina della misurazione del campione. Inserire ciascuna provetta contenente il campione di analisi e premere il pulsante Leggi provetta per ottenere la concentrazione.
      NOTA: In questa fase il protocollo può essere messo in pausa e i campioni possono essere conservati a -20 °C.
  8. Esecuzione di NGS su piattaforme Illumina utilizzando la strategia paired-end 150 bp (PE150) su una scala di base di 30 giga (GB).
    NOTA: Questo passaggio è solitamente esternalizzato alle società di sequenziamento.

3. Analisi dei dati

NOTA: L'analisi in linee cellulari umane è stata utilizzata come esempio in questa sezione.

  1. Mappatura dei siti di integrazione dei lentivirus
    1. Filtra le letture di sequenziamento con più del 50% di basi di bassa qualità (punteggio Phred <20), più di 15 basi 'N' o più corte di 150 basi utilizzando fastp tool33 (vedi Tabella dei materiali).
    2. Selezionare solo le letture paired-end con la lettura 2 che inizia con il tag LTR "GCCTTGTGTGTGTTAGATCCACAG
      ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      NOTA: Questa sequenza dipende dalla sequenza del vettore utilizzato per generare la libreria di celle di mutagenesi inserzionale.
    3. Tagliare la sequenza di tag LTR dalle letture selezionate al punto 3.1.2.
    4. Allineare le letture tagliate al GRCh37/hg19 utilizzando BWA-MEM 34 (vedi Tabella dei materiali) con le impostazioni predefinite.
    5. Mantenere solo le coppie di lettura in cui sia la lettura 1 che la lettura 2 sono mappate in modo univoco sul genoma con configurazione e spaziatura corrette, indicate da FLAG 147 e FLAG 163.
    6. Definisce la posizione di inserimento come la prima base allineata della lettura rifilata 2.
    7. Normalizzare i conteggi delle letture in ogni sito di inserimento univoco al numero totale di letture allineate in modo univoco in ciascun campione.
  2. Identificazione delle inserzioni che influenzano la fitness cellulare (IACF)
    NOTA: Nell'analisi statistica, è consigliabile condurre confronti a coppie tra le tre repliche biologiche di entrambi i campioni di controllo e trattati per identificare posizioni significativamente arricchite o impoverite. Il numero di repliche sopra menzionato è minimo. Si consiglia di utilizzare il maggior numero possibile di repliche per garantire l'affidabilità e l'accuratezza dei risultati.
    1. Convertire i conteggi delle letture normalizzate di ogni posizione in registrare10 valori.
    2. Impostare i valori del log10 delle posizioni con zero letture come -5.
    3. Eseguire il t-test di Student accoppiato su due lati sui valori del log10.
    4. Regolare i valori p per confronti multipli utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg all'interno dell'ambiente R.
    5. Seleziona le posizioni con una soglia di tasso di false scoperte (FDR) del 25% come IACF.
  3. Identificazione dei cluster che influenzano la fitness cellulare (CACFs
    NOTA: Per questa analisi sono state raccomandate tre repliche biologiche di campioni di controllo e trattati.
    1. Identificare i cluster di inserzione significativamente arricchiti o impoveriti tra i campioni di controllo e quelli trattati utilizzando SICER35 (vedi Tabella dei materiali) con una soglia FDR dell'1%. Il comando per l'analisi SICER è "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01".
      NOTA: I significati dei parametri nel comando precedente sono i seguenti: ["InputDir"] ["file di letto dei siti di inserimento del campione trattati"] ["file di letto dei siti di inserimento del campione di controllo"] ["OutputDir"] ["species"] ["soglia di ridondanza"] ["dimensione della finestra (bp)"] ["dimensione del frammento"] ["frazione del genoma efficace"] ["dimensione del gap (bp)"] ["E-value"].
    2. Ottenere regioni di cluster condivise da almeno due repliche biologiche con la funzione "intersect" della suite BEDTools36 (vedi Tabella dei materiali) e denotare queste regioni di cluster come CACF.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La valutazione del controllo di qualità di una libreria NGS, tipicamente eseguita dal fornitore di sequenziamento, funge da controllo di qualità standard prima del sequenziamento. Per dimostrare l'impatto della qualità della biblioteca, sono stati confrontati due campioni. La libreria di alta qualità, etichettata s2-20-15, è stata preparata utilizzando il protocollo PCR nidificato standard, costituito da due fasi di amplificazione sequenziali: la prima con 20 cicli, seguita dalla seconda con 15 cicli. Al contrario, la li...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nell'analisi genetica diretta, il genome-walking è essenziale per la profilazione dei siti di integrazione nelle librerie cellulari di mutagenesi inserzionale. I metodi classici di camminamento del genoma come la I-PCR e la LAM-PCR spesso richiedono la digestione e la legatura di enzimi di restrizione, che possono ridurre la complessità della libreria e introdurre distorsioni dovute alla dipendenza dal sito enzimatico 27,28,29. ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno divulgazioni.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (32000441), dalla Natural Science Foundation della provincia del Fujian, Cina (2023J01130), dai fondi per la ricerca di base per le università centrali dell'Università di Huaqiao (ZQN-924) e dai fondi per la ricerca scientifica dell'Università di Huaqiao (18BS205). P.K. è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (32170619), dal Fondo di ricerca per scienziati senior internazionali del National Natural Scientist Science Foundation of China (32150710525) e la Natural Science Foundation della provincia del Fujian, Cina (2020J02006).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5 M EDTAInvitrogenAM9260GPer fare un tampone di legatura/lavaggio
1 M Tris-HCl (Ph 8,0)Invitrogen15568025Per fare un tampone di legatura/lavaggio
10&volte; Buffer per frammenti di Klenow Takara2140A
10&volte; Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659Per fare Binding / Wash Buffer
BeaverBeads StreptavidinBeaver22307-11 μ m
Software BEDTools, v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMSoftware, v0.7.12
dNTP MiscelaTakara40302,5 mM ciascuno
Equalbit dsDNA HS Kit di testVazymeEQ111-02
fastpSoftware
HiSeq X TenIlluminaPiattaforma SY-412-1001Illumina, esternalizzata a Novogene Corporation (Pechino)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850piattaforma Illumina, esternalizzata a Novogene Corporation (Pechino)
Qubit 3.0 FluorimeterThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware, v1.1
Taq DNA polimerasiTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328per rendere il tampone di legatura / lavaggio
distillata ultrapuraInvitrogen10977015
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411-01
acqua

References

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