Articolo metodologico

Rilevamento di autoanticorpi anti-MDA5 mediante cellule HeLa e immunocitochimica con microscopia ottica

DOI:

10.3791/67575

⸱

31 ottobre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Forniamo una metodologia di immunocitochimica (ICC) passo-passo per rilevare l'anti-MDA5. Questo approccio prevede la fissazione cellulare, la permeabilizzazione, l'incubazione degli anticorpi e le tecniche di imaging, che consentono il rilevamento accurato degli autoanticorpi anti-MDA5, aiutando nella diagnosi della malattia polmonare interstiziale in rapida progressione nei pazienti con miosite.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autoanticorpi anti-MDA5 sono biomarcatori fondamentali per la dermatomiosite (DM), la dermatomiosite amiopatica (CADM) e la polimiosite (PM), in particolare nell'identificazione dei pazienti a rischio di malattia polmonare interstiziale rapidamente progressiva (RP-ILD). La diagnosi precoce di questi autoanticorpi è essenziale per migliorare gli esiti dei pazienti, poiché la diagnosi tardiva spesso porta a prognosi sfavorevoli. Attualmente, il dosaggio radioimmunologico è il gold standard per la rilevazione dell'anti-MDA5, ma il suo uso è limitato dai costi elevati, dalle lunghe procedure e dalla necessità di competenze specialistiche. Inoltre, il blot test, uno strumento clinico ampiamente utilizzato, mostra un alto tasso di falsi positivi per gli autoanticorpi MDA5, compromettendo potenzialmente l'accuratezza diagnostica. Per affrontare queste limitazioni, proponiamo un metodo di test di conferma non radioattivo, altamente sensibile e standardizzato che utilizza l'immunocitochimica (ICC). Questo protocollo prevede il trattamento delle cellule HeLa con un costrutto MDA5, la permeabilizzazione delle cellule con Triton X-100 per facilitare il legame degli autoanticorpi primari anti-MDA5 e il rilevamento degli anticorpi legati utilizzando anticorpi secondari coniugati con enzimi (ad esempio, perossidasi di rafano) con cromogeno DAB per l'imaging al microscopio. L'ICC offre un approccio pratico, economico e ad alta sensibilità per la visualizzazione degli autoanticorpi anti-MDA5 all'interno delle strutture cellulari. Integrando l'ICC come procedura di conferma supplementare, questo studio mira a migliorare l'affidabilità del rilevamento dell'anti-MDA5, migliorando così le strategie diagnostiche e prognostiche per RP-ILD nei pazienti con DM, CADM e PM.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le miopatie infiammatorie idiopatiche (IIM), comunemente indicate come miosite, sono un gruppo eterogeneo di malattie autoimmuni caratterizzate da infiammazione muscolare cronica, manifestazioni cliniche variabili e diversi esiti terapeutici. I sintomi comuni includono debolezza muscolare, ridotta resistenza e mialgia1. I sottotipi primari di IIM includono la polimiosite (PM) e la dermatomiosite (DM), mentre la dermatomiosite clinicamente amiopatica (CADM) si distingue per le caratteristiche eruzioni cutanee simili a quelle osservate nel DM ma con un coinvolgimento muscolare minimo o nullo. Una delle principali complicanze di PM, DM e CADM è la malattia polmonare interstiziale (ILD), che colpisce circa il 40% dei pazienti ed è associata a un aumento della mortalità2.

Il decorso clinico e la prognosi dell'ILD nell'IIM variano notevolmente. L'ILD associata a DM e CADM (DM-/CADM-ILD) tende ad essere più resistente al trattamento e comporta una prognosi peggiore rispetto all'ILD associata a PM. Tra queste, l'ILD acuta o subacuta, che progredisce rapidamente entrotre mesi3, è particolarmente grave, con un tasso di sopravvivenza a cinque anni riportato di solo il 52%, rispetto all'87% per l'ILD cronica, che progredisce lentamente o rimane stabile. L'ILD rapidamente progressiva (RP-ILD), un sottotipo di ILD acuta/subacuta, è caratterizzata da una rapida insorgenza di dispnea e da un esteso danno alveolare visibile all'imaging del torace. La RP-ILD è una condizione pericolosa per la vita con una prognosi infausta, sottolineando l'urgente necessità di una diagnosi precoce e di un intervento tempestivo per migliorare gli esiti dei pazienti 4,5,6.

Gli autoanticorpi specifici per la miosite (MSA) sono emersi come biomarcatori critici nell'ILD associata alla miosite, con gli autoanticorpi anti-MDA5 che svolgono un ruolo particolarmente significativo. Questi autoanticorpi sono frequentemente rilevati in pazienti con PM-/DM-/CADM-ILD e fungono da importanti indicatori prognostici per RP-ILD 7,8,9. MDA5 (melanoma differentiation-associated gene 5) è un recettore citosolico di riconoscimento del pattern codificato da un gene inducibile dall'interferone che rileva l'RNA virale e mitocondriale a doppio filamento, avviando risposte immunitarie mediate dall'interferone10. Sebbene i precisi meccanismi patogenetici rimangano poco chiari, si ritiene che gli autoanticorpi anti-MDA5 interrompano la funzione di MDA5, contribuendo così alla patogenesi autoimmune.

La rilevazione tempestiva degli autoanticorpi anti-MDA5 è essenziale per l'identificazione precoce e la gestione di RP-ILD. Tradizionalmente, l'immunoprecipitazione radiomarcata (IP) utilizzando 35estratti cellulari K562 marcati con S-metionina è stata considerata il gold standard per la rilevazione degli autoanticorpi anti-MDA511. Tuttavia, questo metodo non è pratico per l'uso clinico di routine a causa del suo costo elevato, della dipendenza da attrezzature specializzate e personale addestrato, delle rigide normative sullo smaltimento dei rifiuti radioattivi e della durata di conservazione limitata dei reagenti radiomarcati. Nella pratica clinica, i saggi di blot sono comunemente impiegati come alternative; tuttavia, sono associati a un alto tasso di falsi positivi per gli autoanticorpi anti-MDA512,13, sollevando preoccupazioni sull'accuratezza diagnostica. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di un test di conferma affidabile e non radioattivo per convalidare i risultati positivi e migliorare l'affidabilità diagnostica.

Per colmare questa lacuna, proponiamo l'uso dell'immunocitochimica (ICC) come test di conferma supplementare per gli autoanticorpi anti-MDA5. Questo approccio prevede la trasfetzione di cellule HeLa con un costrutto MDA5, l'incubazione delle cellule con il plasma del paziente e la rilevazione di autoanticorpi anti-MDA5 legati utilizzando anticorpi secondari coniugati con enzimi (ad esempio, perossidasi di rafano) combinati con un substrato cromogenico per la visualizzazione al microscopio ottico. L'ICC fornisce una piattaforma non radioattiva, altamente sensibile e standardizzata per la visualizzazione di autoanticorpi anti-MDA5 all'interno dei compartimenti cellulari. Integrando l'ICC con il test blot, questo metodo mira a ridurre i tassi di falsi positivi, migliorare l'accuratezza diagnostica e, in ultima analisi, migliorare la gestione clinica e gli esiti per i pazienti.

L'obiettivo di questo studio è stabilire un protocollo robusto e non radioattivo per la rilevazione di autoanticorpi anti-MDA5, affrontando i limiti degli attuali metodi di rilevamento e offrendo ai medici uno strumento pratico e affidabile per la diagnosi precoce di RP-ILD in pazienti con PM, DM e CADM. Nella narrazione video di accompagnamento, questo decorso pericoloso per la vita è colloquialmente descritto come "morte rapida"; Scientificamente, corrisponde alla ILD rapidamente progressiva (RP-ILD). Questo lavoro si basa sulle prove esistenti e ha il potenziale per migliorare significativamente la valutazione prognostica e il processo decisionale terapeutico nella pratica clinica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Colture cellulari e trasfezione

  1. Mantenere le cellule HeLa con il terreno Modified Eagle di Dulbecco, contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotico-antimicotico a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 .
  2. Passaggio delle celle ogni 2-3 giorni o quando le cellule raggiungono il 90%-100% di confluenza.
  3. Seminare 7 × 104 cellule HeLa in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (1,9 cm2/pozzetto) 24 ore prima della trasfezione per consentire alle cellule di raggiungere circa il 90% di confluenza.
  4. Diluire 500 ng di plasmide (pENTER-MDA5) e 1,5 μL di reagente di trasfezione ciascuno in 25 μL di terreno sierico ridotto.
  5. Aggiungere il DNA diluito al reagente di trasfezione diluito (rapporto 1:1). Mescolare bene e incubare per 5 minuti.
  6. Aggiungere la miscela alle cellule seminate un giorno prima e agitare per mescolare immediatamente il complesso DNA-lipidi. Verificare che le celle siano confluenti all'80%-90%.
  7. Incubare le cellule a 37 °C in atmosfera umidificata di CO2 al 5% per 24 ore e procedere all'esecuzione dell'ICC.
    NOTA: Abbiamo utilizzato un vettore disponibile in commercio (pEnter-MDA5); maggiori informazioni sono disponibili nella Tabella dei materiali. L'efficacia della trasfezione è ~50%.
    Il successo della trasfezione e dell'espressione della proteina bersaglio può essere determinato trasfettando le cellule con un plasmide fluorescente che esprime la proteina e conducendo un Western blot per visualizzare l'espressione della proteina bersaglio.

2. Fissazione cellulare

  1. Dopo l'incubazione, lavare le cellule 2 volte con PBS per rimuovere eventuali residui di terreno.
    NOTA: Il lavaggio può essere effettuato agitando la piastra su uno scuotitore orbitale.
  2. Fissare le cellule in paraformaldeide al 4% in PBS. Lasciare le celle per 15 minuti a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica. Utilizzare linee guida per la manipolazione appropriate.
  3. Aspirare il reagente fissativo e utilizzare PBS per lavare le cellule 2 volte.

3. Permeabilizzazione cellulare

  1. Aggiungere il reagente Triton X-100 (0,3% in PBS) e lasciare riposare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente.
  2. Dopo 10 minuti, smaltire il detersivo.
  3. Aggiungere PBS per lavare le celle una volta.

4. Blocco cellulare

  1. Eseguire il blocco con siero fetale bovino al 10% in PBS (1x) e incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere il reagente bloccante, quindi aggiungere PBS per lavare le cellule una volta.

5. Ibridazione dell'anticorpo del paziente

  1. Aggiungere il plasma diluito del paziente alle cellule. Assicurarsi di diluire il campione del paziente (diluizione 1:5.000 in PBS) in PBS prima dell'uso.
    NOTA: Regolare la diluizione per migliorare il segnale o ridurre lo sfondo secondo necessità. Per garantire risultati imparziali, il personale che conduceva i test non era a conoscenza di quali campioni appartenessero ai pazienti e quali provenissero da individui sani.
  2. Incubare il campione a 4 °C per 12-16 ore (durante la notte).
  3. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il campione del paziente e lavare le cellule 3 volte con PBS.

6. Ibridazione di anticorpi secondari

  1. Trattare le cellule con IgG di capra anti-umana coniugata con perossidasi di rafano diluito (diluizione 1:250 in PBS) e lasciare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente.
  2. Un'ora dopo, smaltire gli anticorpi secondari.
  3. Risciacquare con PBS 3x.

7. Colorazione cellulare

  1. Dopo aver lavato le celle, colorare le cellule con 300 μL di soluzione/pozzetto di lavoro DAB.
    NOTA: Questa soluzione è stata preparata mescolando il concentrato di cromogeno DAB e il diluente DAB secondo le istruzioni del produttore.
  2. Dopo aver colorato le cellule per 5 minuti, rimuovere il colorante, sciacquare con acqua distillata deionizzata e agitare per 5 minuti.

8. Controcolorazione cellulare

  1. Controcolorare il nucleo cellulare con ematossilina diluita.
    NOTA: Usiamo l'ematossilina Gill II in una diluizione di 10 volte e attendiamo 5 minuti per il processo di colorazione.
  2. Dopo 5 minuti, smaltire l'ematossilina, quindi lavare con acqua distillata deionizzata per 2 x 5 minuti.

9. Osservazione

  1. Osservare i risultati della colorazione utilizzando un microscopio ottico.
    NOTA: Un vero positivo mostra una forte colorazione marrone all'interno delle cellule HeLa che esprimono MDA5; questo conferma gli autoanticorpi anti-MDA5 nel campione del paziente. Un risultato negativo mostra cellule HeLa senza colorazione marrone, indicando l'assenza di autoanticorpi anti-MDA5. Un risultato falso positivo mostra un'estesa colorazione marrone in tutte le cellule, indipendentemente dall'espressione di MDA5. Questa colorazione aspecifica, osservata in altre condizioni autoimmuni, deve essere distinta da una vera positività per evitare diagnosi errate.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il personale che conduceva i test era all'oscuro dell'identità dei campioni, compresi i pazienti specifici da cui erano stati ottenuti, per ridurre al minimo le potenziali distorsioni nel processo di valutazione. Tuttavia, sebbene i campioni di controllo sani non siano stati sottoposti ad accecamento, hanno costantemente prodotto risultati chiari e inequivocabili.

La Figura 1A mostra il successo del...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La nostra tecnica basata su ICC per l'identificazione degli autoanticorpi anti-MDA5 offre vantaggi significativi rispetto ai metodi tradizionali come l'analisi line blot e il dosaggio radioimmunologico. In precedenza, Nombel et al. hanno riportato valori di sensibilità e specificità rispettivamente del 96% e del 100%, confrontando l'immunofluorescenza indiretta (IIF) su cellule trasfettate con MDA5 con ELISA in una coorte di 23 pazienti con dermatomiosite anti-MDA5-positivi e 22 controll...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.

Parti di questo manoscritto sono state generate con l'assistenza di GPT-4 di OpenAI. Gli autori hanno esaminato e modificato il contenuto per garantire accuratezza e originalità.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio nazionale per la scienza e la tecnologia di Taiwan assegnate a Jye-Lin Hsu (NSTC 114-2320-B-039-038 e NSTC 113-2320-B-039-032). Questo studio è stato anche supportato in parte dalle sovvenzioni della China Medical University and Hospital assegnate a Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 e C1110812016-12).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre a 24 pozzi (1,9 cm²/pozzo)Corning354541
Antimicotico antibioticoGibco15240062
BecherPIREX1000-600
Tubi conici (15 mL)Corning430052
Tubi conici (50 mL)Corning430290
Acqua distillata deionizzataLa nostra acqua distillata deionizzata viene prodotta internamente utilizzando un sistema Milli-Q (Colonna 1: Quantum TEX, SN: F4EB53476; Colonna 2: Prepak, SN: F1CB11442)
Siero bovino fetale caratterizzatoCytivaSH30396.03
cilindri graduati (50 mL)VITLAB64804
Ematossilina Gill IILeica3801522
Hyclone Dulbecco' s Eagle Medium Modificato con alto livello di glucosioCytivaSH30243.02
Reagente di trasfezione Lipofectamin 2000Invitrogen11668019Reagente di trasfezione
MDA-5 (D74E4) Rabbit mAbTecnologia di segnalazione cellulare5321
Tubi microcentrifughe (tubi Eppendorf da 1,5 mL)ASSYGEN142503
Medio siero ridotto Opti-MEM IGibco31985070
Oscillatore orbitale (opzionale)FIRSTEKS300R
ParaformaldeideSigma-Aldrich4% in 1x PBS
PBSPRO TECHME222605
pENTER-MDA5Vigene Biosciences Inc.CH863586
Perossidasi AffiniIgG Anti-Umano (H+L)Jackson ImmunoResearch109-035-003
Controller a pipetteThermo Scientific130165
Pipettes GILSON
Pipette e punte per pipette (10 & micro; L)QSP104-Q
Pipette e punte per pipette (200 & micro; L)QSPT090-Q
Pipette e punte per pipette (1000 & micro; L)QSP111-Q
Pipette sierologiche (5 mL)SPL91005
Pipette sierologiche (10 mL)SPL91010
Pipette sierologiche (25 mL)SPL91025
Kit di substrato DAB SignalStainSegnalazione cellulare80590,3% su PBS

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry. Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).
  2. Tansley, S. L., McHugh, N. J., Wedderburn, L. R. Adult and juvenile dermatomyositis: are the distinct clinical features explained by our current understanding of serological subgroups and pathogenic mechanisms. Arthritis Res Ther. 15 (2), 211(2013).
  3. Fujisawa, T. Management of myositis-associated interstitial lung disease. Medicina. 57 (4), 347(2021).
  4. Sasaki, N., et al. Early initiation of plasma exchange therapy for a patient with anti-MDA5 autoantibody-positive dermatomyositis developing rapidly progressive interstitial lung disease. Mod Rheumatol Case Rep. 5 (1), 87-92 (2021).
  5. Go, D. J., et al. Survival benefit associated with early cyclosporine treatment for dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Rheumatol Int. 36 (2), 125-132 (2015).
  6. Tsuji, H., et al. Multicenter prospective study of the efficacy and safety of combined immunosuppressive therapy with high-dose glucocorticoid, tacrolimus, and cyclophosphamide in interstitial lung diseases accompanied by anti-melanoma differentiation-associated gene 5-positive dermatomyositis. Arthritis Rheumatol. 72 (3), 488-498 (2020).
  7. Hozumi, H., et al. Comprehensive assessment of myositis-specific autoantibodies in polymyositis/dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Respir Med. 122, 1-8 (2016).
  8. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  9. Koga, T., et al. The diagnostic utility of anti-melanoma differentiation-associated gene 5 antibody testing for predicting the prognosis of Japanese patients with DM. Rheumatology. 51 (7), 1278-1284 (2012).
  10. Fuzzi, E., et al. Anti-MDA5 dermatomyositis: an update from bench to bedside. Curr Opin Rheumatol. 34 (6), 365-373 (2022).
  11. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  12. Tansley, S. L., Diederichsen, L. P., Zampeli, V. A., McHugh, N. J. The reliability of immunoassays to detect autoantibodies in patients with myositis is dependent on autoantibody specificity. Rheumatology. 59 (5), 1029-1034 (2020).
  13. Chen, Y. L., Li, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (3), 345-350 (2024).
  14. Nombel, A., Pin, J. J., Fabien, N., Miossec, P., Coutant, F. Evaluation of the performance of an indirect immunofluorescence assay for the detection of anti-MDA5 antibodies. Biomedicines. 10 (12), 3125(2022).
  15. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  16. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  17. Chang, Y. C., Yang, L., Budhram, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (5), 626-630 (2024).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Saggio di immunocitochimicamalattia polmonare interstizialebiomarcatori della dermatomiositepermeabilizzazione con Triton X 100rilevazione con perossidasi di rafanocolorazione con cromogeno DABmarcatura con anticorpo secondario

Articoli correlati