Rilevamento di autoanticorpi anti-MDA5 mediante cellule HeLa e immunocitochimica con microscopia ottica

Le miopatie infiammatorie idiopatiche (IIM), comunemente indicate come miosite, sono un gruppo eterogeneo di malattie autoimmuni caratterizzate da infiammazione muscolare cronica, manifestazioni cliniche variabili e diversi esiti terapeutici. I sintomi comuni includono debolezza muscolare, ridotta resistenza e mialgia¹. I sottotipi primari di IIM includono la polimiosite (PM) e la dermatomiosite (DM), mentre la dermatomiosite clinicamente amiopatica (CADM) si distingue per le caratteristiche eruzioni cutanee simili a quelle osservate nel DM ma con un coinvolgimento muscolare minimo o nullo. Una delle principali complicanze di PM, DM e CADM è la malattia polmonare interstiziale (ILD), che colpisce circa il 40% dei pazienti ed è associata a un aumento della mortalità².

Il decorso clinico e la prognosi dell'ILD nell'IIM variano notevolmente. L'ILD associata a DM e CADM (DM-/CADM-ILD) tende ad essere più resistente al trattamento e comporta una prognosi peggiore rispetto all'ILD associata a PM. Tra queste, l'ILD acuta o subacuta, che progredisce rapidamente entro^{tre mesi3}, è particolarmente grave, con un tasso di sopravvivenza a cinque anni riportato di solo il 52%, rispetto all'87% per l'ILD cronica, che progredisce lentamente o rimane stabile. L'ILD rapidamente progressiva (RP-ILD), un sottotipo di ILD acuta/subacuta, è caratterizzata da una rapida insorgenza di dispnea e da un esteso danno alveolare visibile all'imaging del torace. La RP-ILD è una condizione pericolosa per la vita con una prognosi infausta, sottolineando l'urgente necessità di una diagnosi precoce e di un intervento tempestivo per migliorare gli esiti dei pazienti ^4,5,6.

Gli autoanticorpi specifici per la miosite (MSA) sono emersi come biomarcatori critici nell'ILD associata alla miosite, con gli autoanticorpi anti-MDA5 che svolgono un ruolo particolarmente significativo. Questi autoanticorpi sono frequentemente rilevati in pazienti con PM-/DM-/CADM-ILD e fungono da importanti indicatori prognostici per RP-ILD ^7,8,9. MDA5 (melanoma differentiation-associated gene 5) è un recettore citosolico di riconoscimento del pattern codificato da un gene inducibile dall'interferone che rileva l'RNA virale e mitocondriale a doppio filamento, avviando risposte immunitarie mediate dall'interferone¹⁰. Sebbene i precisi meccanismi patogenetici rimangano poco chiari, si ritiene che gli autoanticorpi anti-MDA5 interrompano la funzione di MDA5, contribuendo così alla patogenesi autoimmune.

La rilevazione tempestiva degli autoanticorpi anti-MDA5 è essenziale per l'identificazione precoce e la gestione di RP-ILD. Tradizionalmente, l'immunoprecipitazione radiomarcata (IP) utilizzando ³⁵estratti cellulari K562 marcati con S-metionina è stata considerata il gold standard per la rilevazione degli autoanticorpi anti-MDA5¹¹. Tuttavia, questo metodo non è pratico per l'uso clinico di routine a causa del suo costo elevato, della dipendenza da attrezzature specializzate e personale addestrato, delle rigide normative sullo smaltimento dei rifiuti radioattivi e della durata di conservazione limitata dei reagenti radiomarcati. Nella pratica clinica, i saggi di blot sono comunemente impiegati come alternative; tuttavia, sono associati a un alto tasso di falsi positivi per gli autoanticorpi anti-MDA5^12,13, sollevando preoccupazioni sull'accuratezza diagnostica. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di un test di conferma affidabile e non radioattivo per convalidare i risultati positivi e migliorare l'affidabilità diagnostica.

Per colmare questa lacuna, proponiamo l'uso dell'immunocitochimica (ICC) come test di conferma supplementare per gli autoanticorpi anti-MDA5. Questo approccio prevede la trasfetzione di cellule HeLa con un costrutto MDA5, l'incubazione delle cellule con il plasma del paziente e la rilevazione di autoanticorpi anti-MDA5 legati utilizzando anticorpi secondari coniugati con enzimi (ad esempio, perossidasi di rafano) combinati con un substrato cromogenico per la visualizzazione al microscopio ottico. L'ICC fornisce una piattaforma non radioattiva, altamente sensibile e standardizzata per la visualizzazione di autoanticorpi anti-MDA5 all'interno dei compartimenti cellulari. Integrando l'ICC con il test blot, questo metodo mira a ridurre i tassi di falsi positivi, migliorare l'accuratezza diagnostica e, in ultima analisi, migliorare la gestione clinica e gli esiti per i pazienti.

L'obiettivo di questo studio è stabilire un protocollo robusto e non radioattivo per la rilevazione di autoanticorpi anti-MDA5, affrontando i limiti degli attuali metodi di rilevamento e offrendo ai medici uno strumento pratico e affidabile per la diagnosi precoce di RP-ILD in pazienti con PM, DM e CADM. Nella narrazione video di accompagnamento, questo decorso pericoloso per la vita è colloquialmente descritto come "morte rapida"; Scientificamente, corrisponde alla ILD rapidamente progressiva (RP-ILD). Questo lavoro si basa sulle prove esistenti e ha il potenziale per migliorare significativamente la valutazione prognostica e il processo decisionale terapeutico nella pratica clinica.

1. Colture cellulari e trasfezione

1. Mantenere le cellule HeLa con il terreno Modified Eagle di Dulbecco, contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotico-antimicotico a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂ .
2. Passaggio delle celle ogni 2-3 giorni o quando le cellule raggiungono il 90%-100% di confluenza.
3. Seminare 7 × 10⁴ cellule HeLa in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (1,9 cm²/pozzetto) 24 ore prima della trasfezione per consentire alle cellule di raggiungere circa il 90% di confluenza.
4. Diluire 500 ng di plasmide (pENTER-MDA5) e 1,5 μL di reagente di trasfezione ciascuno in 25 μL di terreno sierico ridotto.
5. Aggiungere il DNA diluito al reagente di trasfezione diluito (rapporto 1:1). Mescolare bene e incubare per 5 minuti.
6. Aggiungere la miscela alle cellule seminate un giorno prima e agitare per mescolare immediatamente il complesso DNA-lipidi. Verificare che le celle siano confluenti all'80%-90%.
7. Incubare le cellule a 37 °C in atmosfera umidificata di CO₂ al 5% per 24 ore e procedere all'esecuzione dell'ICC.
   NOTA: Abbiamo utilizzato un vettore disponibile in commercio (pEnter-MDA5); maggiori informazioni sono disponibili nella Tabella dei materiali. L'efficacia della trasfezione è ~50%.
   Il successo della trasfezione e dell'espressione della proteina bersaglio può essere determinato trasfettando le cellule con un plasmide fluorescente che esprime la proteina e conducendo un Western blot per visualizzare l'espressione della proteina bersaglio.

2. Fissazione cellulare

1. Dopo l'incubazione, lavare le cellule 2 volte con PBS per rimuovere eventuali residui di terreno.
   NOTA: Il lavaggio può essere effettuato agitando la piastra su uno scuotitore orbitale.
2. Fissare le cellule in paraformaldeide al 4% in PBS. Lasciare le celle per 15 minuti a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica. Utilizzare linee guida per la manipolazione appropriate.
3. Aspirare il reagente fissativo e utilizzare PBS per lavare le cellule 2 volte.

3. Permeabilizzazione cellulare

1. Aggiungere il reagente Triton X-100 (0,3% in PBS) e lasciare riposare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente.
2. Dopo 10 minuti, smaltire il detersivo.
3. Aggiungere PBS per lavare le celle una volta.

4. Blocco cellulare

1. Eseguire il blocco con siero fetale bovino al 10% in PBS (1x) e incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente.
2. Rimuovere il reagente bloccante, quindi aggiungere PBS per lavare le cellule una volta.

5. Ibridazione dell'anticorpo del paziente

1. Aggiungere il plasma diluito del paziente alle cellule. Assicurarsi di diluire il campione del paziente (diluizione 1:5.000 in PBS) in PBS prima dell'uso.
   NOTA: Regolare la diluizione per migliorare il segnale o ridurre lo sfondo secondo necessità. Per garantire risultati imparziali, il personale che conduceva i test non era a conoscenza di quali campioni appartenessero ai pazienti e quali provenissero da individui sani.
2. Incubare il campione a 4 °C per 12-16 ore (durante la notte).
3. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il campione del paziente e lavare le cellule 3 volte con PBS.

6. Ibridazione di anticorpi secondari

1. Trattare le cellule con IgG di capra anti-umana coniugata con perossidasi di rafano diluito (diluizione 1:250 in PBS) e lasciare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente.
2. Un'ora dopo, smaltire gli anticorpi secondari.
3. Risciacquare con PBS 3x.

7. Colorazione cellulare

1. Dopo aver lavato le celle, colorare le cellule con 300 μL di soluzione/pozzetto di lavoro DAB.
   NOTA: Questa soluzione è stata preparata mescolando il concentrato di cromogeno DAB e il diluente DAB secondo le istruzioni del produttore.
2. Dopo aver colorato le cellule per 5 minuti, rimuovere il colorante, sciacquare con acqua distillata deionizzata e agitare per 5 minuti.

8. Controcolorazione cellulare

1. Controcolorare il nucleo cellulare con ematossilina diluita.
   NOTA: Usiamo l'ematossilina Gill II in una diluizione di 10 volte e attendiamo 5 minuti per il processo di colorazione.
2. Dopo 5 minuti, smaltire l'ematossilina, quindi lavare con acqua distillata deionizzata per 2 x 5 minuti.

9. Osservazione

1. Osservare i risultati della colorazione utilizzando un microscopio ottico.
   NOTA: Un vero positivo mostra una forte colorazione marrone all'interno delle cellule HeLa che esprimono MDA5; questo conferma gli autoanticorpi anti-MDA5 nel campione del paziente. Un risultato negativo mostra cellule HeLa senza colorazione marrone, indicando l'assenza di autoanticorpi anti-MDA5. Un risultato falso positivo mostra un'estesa colorazione marrone in tutte le cellule, indipendentemente dall'espressione di MDA5. Questa colorazione aspecifica, osservata in altre condizioni autoimmuni, deve essere distinta da una vera positività per evitare diagnosi errate.

Il personale che conduceva i test era all'oscuro dell'identità dei campioni, compresi i pazienti specifici da cui erano stati ottenuti, per ridurre al minimo le potenziali distorsioni nel processo di valutazione. Tuttavia, sebbene i campioni di controllo sani non siano stati sottoposti ad accecamento, hanno costantemente prodotto risultati chiari e inequivocabili.

La Figura 1A mostra il successo dell'espressione di MDA5 nelle cellule HeLa trasfettate con il costrutto pENTER-MDA5. Per convalidare l'efficienza della trasfezione, l'ICC è stata eseguita utilizzando un anticorpo anti-MDA5 commerciale. In circa il 50% delle cellule trasfettate è stata osservata una forte colorazione citoplasmatica marrone, indicando una robusta espressione della proteina MDA5. Al contrario, le cellule non trasfettate processate in condizioni identiche non hanno mostrato alcuna colorazione citoplasmatica, confermando la specificità dell'anticorpo e l'assenza di espressione endogena di MDA5.

Seguendo il protocollo ICC, campioni rappresentativi di pazienti anti-MDA5-positivi, confermati dall'immunoprecipitazione radiomarcata, hanno dimostrato una chiara colorazione citoplasmatica marrone nelle cellule HeLa che esprimono MDA5, mentre le cellule non trasfettate sono rimaste non colorate (Figura 1B). Questo modello di colorazione indica la presenza di autoanticorpi anti-MDA5 nel plasma del paziente e si allinea con il rilevamento gold standard stabilito utilizzando 35estratti di cellule K562 marcate con S-metionina.

Le caratteristiche del paziente sono riassunte nella Tabella supplementareS1, che delinea le diagnosi cliniche, lo stato degli anticorpi anti-MDA5 e la classificazione in tre gruppi: anti-MDA5-positivo, falso positivo e controllo sano. Oltre allo stato degli anticorpi, la Tabella Supplementare S1 ora riassume anche i dati demografici dei pazienti, tra cui età, sesso e diagnosi di base per ciascuna coorte. La reattività anticorpale è stata classificata semiquantitativamente come debole (1+), moderata (2+) o forte (3+) in base all'intensità della banda, riflettendo l'aumento dei livelli di anticorpi. Ciò fornisce un contesto clinico per l'interpretazione dei risultati dell'ICC, pur mantenendo l'obiettivo metodologico primario del presente studio. La coorte di studio comprendeva 10 pazienti con autoanticorpi anti-MDA5 confermati (gruppo positivo), cinque pazienti con malattie autoimmuni che hanno prodotto risultati falsi positivi mediante test blot commerciale (gruppo falso positivo) e 10 individui sani (gruppo di controllo sano). Ogni campione è stato testato insieme a controlli positivi e negativi e verificato in modo indipendente utilizzando l'immunoprecipitazione radiomarcata. Per i campioni con risultati di colorazione chiari e conclusivi, è stata ritenuta sufficiente una singola esecuzione ICC. Nei casi in cui la colorazione era ambigua o borderline, sono stati condotti ulteriori test, tra cui diluizioni seriali e saggi ICC replicati, per garantire un'interpretazione accurata. Questo approccio ha garantito sia il rigore metodologico che l'efficienza delle risorse nella convalida delle prestazioni del metodo di rilevamento basato su ICC.

I risultati falsi positivi sono illustrati nella Figura 2. In questi campioni è stato utilizzato plasma di pazienti con malattie autoimmuni diverse dalle miopatie infiammatorie idiopatiche (IIM). A differenza della Figura 1, la colorazione citoplasmatica marrone è stata osservata ampiamente in tutte le cellule, indipendentemente dallo stato di espressione di MDA5. Questo modello di colorazione indica un legame non specifico ed evidenzia il potenziale di falsi positivi nei campioni di pazienti con altre condizioni autoimmuni. I risultati negativi sono presentati nella Figura 3, dove è stato testato il plasma di individui sani. Praticamente non è stata osservata alcuna colorazione citoplasmatica marrone nelle cellule HeLa trasfettate o non trasfettate, indicando l'assenza di autoanticorpi anti-MDA5 in questi campioni.

Figura 1: Convalida dell'espressione di MDA5 e rilevamento di autoanticorpi anti-MDA5 mediante ICC. (A) Le cellule HeLa trasfettate con un plasmide che esprime MDA5 sono state colorate utilizzando un anticorpo anti-MDA5 commerciale. È stata osservata una forte colorazione citoplasmatica marrone, che indica una robusta espressione della proteina MDA5. Al contrario, le cellule non trasfettate processate in condizioni identiche non hanno mostrato alcuna colorazione, confermando sia la specificità anticorpale che l'assenza di espressione endogena di MDA5. (B) Le cellule HeLa trasfettate con MDA5 sono state incubate con plasma di pazienti confermati positivi all'anti-MDA5 mediante immunoprecipitazione radiomarcata. È stata osservata una chiara colorazione marrone citoplasmatica, dimostrando la presenza di autoanticorpi anti-MDA5 nel campione del paziente. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazione: ICC = immunocitochimica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rilevamento di segnali falsi positivi utilizzando il plasma di pazienti con malattie autoimmuni diverse dall'IIM. È stata osservata una diffusa colorazione citoplasmatica marrone sia nelle cellule trasfettate che in quelle non trasfettate, suggerendo un legame anticorpale non specifico. Questi risultati illustrano il potenziale di rilevamento di falsi positivi nei saggi di line blot quando si utilizza plasma proveniente da pazienti con malattie autoimmuni non correlate a pazienti IIM anti-MDA5-positivi. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazione: IIM = miopatie infiammatorie idiopatiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati negativi della colorazione con plasma di individui sani di controllo. Le cellule HeLa trasfettate con MDA5 e incubate con plasma da individui sani hanno mostrato poca o nessuna colorazione citoplasmatica marrone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare S1: Caratteristiche del paziente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno interessi concorrenti da dichiarare.

Parti di questo manoscritto sono state generate con l'assistenza di GPT-4 di OpenAI. Gli autori hanno esaminato e modificato il contenuto per garantire accuratezza e originalità.