Qui, presentiamo la manipolazione genetica acuta di organoidi corticali umani affettati mediante elettroporazione. Questi modelli di organoidi corticali sono particolarmente suscettibili di iniezione in quanto le strutture simili a ventricole possono essere facilmente identificate dopo lo slicing, consentendo l'indagine funzionale dello sviluppo corticale umano, dei disturbi dello sviluppo neurologico e dell'evoluzione corticale.
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Articolo metodologico
Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi corticali umani sono diventati strumenti importanti per studiare lo sviluppo del cervello umano, i disturbi dello sviluppo neurologico e l'evoluzione del cervello umano. Gli studi che analizzano la funzione genica per sovraespressione o knockout sono stati determinanti nei modelli animali per fornire intuizioni meccanicistiche sulla regolazione dello sviluppo della neocorteccia. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il knockout genico acuto mediato da CRISPR/Cas9 mediante elettroporazione di organoidi corticali umani affettati. Lo slicing degli organoidi corticali aiuta l'identificazione di strutture simili a ventricole per l'iniezione e la successiva elettroporazione, rendendolo un modello particolarmente adatto per la manipolazione genetica acuta durante lo sviluppo corticale umano. Descriviamo la progettazione di RNA guida e la validazione dell'efficienza del targeting in vitro e in organoidi corticali. L'elettroporazione degli organoidi corticali viene eseguita a stadi neurogenici medi, consentendo il targeting della maggior parte delle principali classi cellulari nella neocorteccia in via di sviluppo, tra cui la glia radiale apicale, le cellule progenitrici basali e i neuroni. Nel complesso, l'elettroporazione di organoidi corticali umani affettati rappresenta una potente tecnica per studiare la funzione genica, la regolazione genica e la morfologia cellulare durante lo sviluppo corticale.
Introduzione
La neocorteccia si riferisce al rivestimento esterno degli emisferi cerebrali ed è una struttura unica per i mammiferi. La neocorteccia rappresenta la sede delle funzioni cognitive superiori 1,2,3,4,5. Durante lo sviluppo, le cellule staminali neurali e le cellule progenitrici danno origine ai neuroni in un processo chiamato neurogenesi. Gli studi funzionali che indagano lo sviluppo della neocorteccia umana forniscono la base per chiarire i meccanismi alla base della regola....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) sono stati eseguiti in conformità con gli standard etici delineati nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e approvati dal Comitato di revisione etica dell'ospedale universitario di Dresda (IRB00001473; IORG0001076; numero di approvazione etica SR-EK-456092021).
1. Progettazione di RNA guida per knockout genico acuto mediato da CRISPR/Cas9
- Progettare una coppia di RNA guida (gRNA) che hanno come bersaglio lo stesso esone con una distanza idealmente di 7-11 bp (evitando multipli di 3 b....
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Risultati
L'ablazione genica mediata da CRISPR/Cas9 richiede la progettazione di gRNA. Generalmente, il targeting di uno dei primi esoni di un gene di interesse con una coppia di gRNA distanziati di 7-11 bp l'uno dall'altro (evitando multipli di 3 bp) funziona bene (Figura 1A). Come primo test, l'efficienza del riconoscimento del modello da parte dei gRNA può essere interrogata in vitro utilizzando un modello di PCR 26,40,62.
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Discussione
Gli organoidi cerebrali e corticali umani sono diventati modelli chiave per studiare lo sviluppo della neocorteccia umana 7,16,17. Per la modellazione dei disturbi umani, le linee isogeniche hiPSC e gli organoidi sono diventati il gold standard68. Tuttavia, poiché la generazione di nuove linee iPSC richiede tempo e denaro, la manipolazione acuta di modelli di organoidi co.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Siamo grati alle strutture del CRTD e ai partner del Dresden Concept per l'eccezionale supporto fornito, in particolare K. Neumann e il suo team presso la Stem Cell Engineering Facility, H. Hartmann e il suo team presso la Light Microscopia Facility, A. Gompf e il suo team presso la Flow Cytometry Facility e Hartmut Wolf dell'officina MPI-CBG per la costruzione delle camere di elettroporazione. Ringraziamo Joshua Schmidt per il suo feedback sul manoscritto. MA riconosce il finanziamento del Center for Regenerative Therapies TU Dresden, del DFG (Emmy Noether, AL 2231/1-1) e della Schram Foundation.
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Materiali
Provette da trattato con nunclon DNA integrate Acido Ascorbico 16520100 ultra puro Camera di conteggio
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| centrifuga in PP da 15 mL, coniche | Corning | 430791 | |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | ||
| 4D-Nucleofector X Unit | Lonza | ||
| 5 mL in polistirene provetta a fondo tondo con tappo per filtro a celle | Corning | Falcon 352235 | |
| piastra a 6 pozzetti, Thermo | Fisher | 140675 | per hiPSC piastra |
| a 6 pozzetti per coltura, attacco ultra basso | Corning | 3471 | Per coltura di organoidi |
| A83-01 | STEMCELL Technologies | 72022 | Terreno proencefalico 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Compressore d'aria | Aerotec | ||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immuno Research | 703-545-155 | Anticorpo secondario, RRID: AB_2340375; diluizione 1:1000 |
| Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-31572 | Anticorpo secondario, RRID: AB_162543; diluizione 1:1000 |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol | Tecnologie | Design personalizzato (ordinare come 2 nmol) | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA Tecnologie | DNA integrate | 1072532 | 5 nmol |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi V3 | Tecnologie DNA integrate | 1081060 | 100 &; g, da Streptococcus pyogenes |
| Amfotericina B (Fungizone) | Gibco | 15290018 | Proencefalo terreno 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Anticorpo primario anti-GFP (pollo, policlonale) | Abcam | ab13970 | RRID: AB_300798; diluizione 1:2000 |
| Anticorpo primario anti-PCGF4 (topo, monoclonale) | Millipore | 05-637 | RRID: AB_309865; diluizione 1:300 |
| Microscopio fluorescente ApoTome | Zeiss | ||
| Sigma Aldrich | 1043003 | Proencefalo medium 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 | |
| B27-integratore (+ vitamina A) | Gibco | 17504044 | Proencefalo medium 3, 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Kit di cavi da banana a micrograbber | Apparecchio Harvard BTX | 45-0216 | |
| Biometra TRIO-Thermocycler (macchina PCR) | Analytik Jena | 846-2-070-723 | |
| Capillari, vetro borosilicato con filamento, OD 1,2 mm; ID 0,69 mm; 10 cm di lunghezza | Scienza Prodotti | BF120-69-10 | Deve essere tirato a spessore specifico |
| CHIR-99021 | STEMCELL Technologies | 72052 | Proencefalo medio 2 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Collagenasi di tipo IV | Gibco | 17104019 | |
| CRTDi004-A | Impianto di ingegneria delle cellule staminali presso CMCB DD | https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A | Linea hiPSC adattata a singola cellula da donatore sano |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 1 mg/mL, utilizzare 1:1000 diluito per IF |
| Dibutirril-cAMP | STEMCELL Technologies | 73884 | Proencefalo medio 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Fisher Scientific | 31330095 | Forebrain medium 1, 2 e 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Dorsomorfina | STEMCELL Technologies | 72102 | Proencefalo medium 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Dumont #55 Pinze, dritto, 11 cm | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| ECM 830 Sistema di elettroporazione a onda quadra | Apparecchio Harvard BTX | 45-2052 | |
| Etanolo | Sigma Aldrich | 32205-1L-M | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Fast Green | FCF Sigma Aldrich | F7252 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | GE Healthcare | SH30070.03 | |
| Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone | Sutter Instrument Co. | P-97 | Per l'estrazione di microcapillari |
| Geneious Prime | GraphPad Software LLC d.b.a Geneious | Software versione 2024.0.5 | |
| gLACZ | Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014 | 5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; nucleotidi sottolineati = PAM | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050038 | Terreno del proencefalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | |
| gPCGF4 KO1 | questo articolo | 5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corrisponde alle immagini KO in Figura 3I+J) | |
| gPCGF4 KO2 | questo articolo | 5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corrisponde al KO immagini in Figura 3I+J) | |
| HEPES | prodotto in casa | 1 M stock | |
| Siero di cavallo, inattivato termicamente | Gibco | 26050088 | |
| Proteina ricombinante GDNF umana | Thermo Fisher | 450-10 | Mezzo proencefalico 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Proteina ricombinante BDNF umana/topo/ratto | Thermo Fisher | 450-02 | Proencefalo medio 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Acido cloridrico (HCl) | Sigma Aldrich | 258148 | Per fare TrisHCl |
| ImmEdge (cera) Penna | Vettoriale Laboraories | H-4000 | |
| Soluzione di insulina umana | Sigma Aldrich | I9278 | Proencefalo medio 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Isopropanolo | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| Siero di sostituzione knockout | Gibco | 10828-010 | Proencefalo medio 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Microscopio confocale 980 a scansione laser | Agarosio Zeiss | ||
| a basso punto di fusione, | Thermo Fisher | per l'inclusione di hCOs durante il sezionamento del vibratomo | |
| Matrice a membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR) Matrigel, senza LDEV | Corning | 354230 | Per la coltura |
| di organoidiMatrice qualificata Matrigel hESC, senza LDEV | Corning 354277 | Per coltura hiPSC | |
| MgCl2, 1 M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Microiniettore PicoPump + Interruttore a pedale | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Microloader Puntali per pipette da 0,5 a 20 e micro; L | Eppendorf | 5242956003 | Per il caricamento di capillari in vetro |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | |
| mTeSR 1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Integratore di cellule staminali |
| N-2 Integratore | Gibco | 17502048 | Forebrain 2 e 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NEB Next Mastermix PCR 2x ad alta fedeltà | New England Biolabs | M0541S | |
| Neubauer | Marca | 718605 | |
| Medium neurobasale | Gibco | 21103049 | Forebrain medium 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140050 | Terreno del proencefalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Tampone duplex privo di nucleasi Tecnologie | DNA integrate | 1072570 | |
| O. C. T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Terreno di inclusione per campione di tessuto congelato |
| P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | |
| Paraformaldeide | Fisher Chemical | P/0840/53 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Peel-A-Way Stampo per inclusione troncatoT12 | Polysciences Inc. | 18986-1 | Per l'inclusione di hCO per vibratomo e criosezione |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Forebrain medium 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 e per il terreno delle cellule staminali dopo nucleofeczione |
| Piastra di Petri 60 mm x 15 mm, senza sfiato, sterile | Corning | BP50-02 | |
| Piastra di Petri Camera dell'elettrodo in platino, interasse 5 mm | Apparecchio Harvard BTX | 45-0504 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | prodotta internamente | ||
| Proteinasi K | Sigma Aldrich | P2308 | Da Titrachium album; 10 mg/mL stock |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| Inibitore della via RHO/ROCK (Y-27632) | STEMCELL Technologies | 72308 | |
| SB-431542 | STEMCELL Technologies | 72232 | Terreno proencefalico 2 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
| Citrato di sodio diidrato | Sigma Aldrich | W302600-1KG-K | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Saccarosio | Vetrini di adesione Sigma Aldrich | S7903 | |
| SuperFrost Plus | Fisher Scientific | 10149870 | |
| SZX10 con un KL 300 LED | Olympus | SZX10 | O stereoscopio alternativo |
| Thermo Shaker | Grant bio | PSC24N | |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T9284 | a.k.a. Octoxinol 9 |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | Per fare TrisHCl |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Thermo Fisher | 12604021 | Dissociazione enzmye per fare sospensioni unicellulari |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | a.k.a. Polisorbato 20 |
| Sale di Tyrode | Sigma Aldrich | T2145-10x1l | |
| Vibrante Microtomo (vibratomo) | Leica | VT1200 S | |
| Wide-Bore 1000 &; L Puntali Filtro Universali Corning | TF-1005-WB-R-S | ||
| β-Mercaptoetanolo | Gibco | 21985-023 | Proencefalo medio 1, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 |
Riferimenti
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: A perspective from developmental biology. Nat Rev Neurosci. 10 (10), 724-735 (2009).
- Pollen, A. A., Kilik, U., Lowe, C. B., Camp, J. G. Human-specific genetics: New tools to explore the molecular and cellu....
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Ristampe e permessi
