Articolo metodologico

Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

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DOI:

10.3791/67598

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29 novembre 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo la manipolazione genetica acuta di organoidi corticali umani affettati mediante elettroporazione. Questi modelli di organoidi corticali sono particolarmente suscettibili di iniezione in quanto le strutture simili a ventricole possono essere facilmente identificate dopo lo slicing, consentendo l'indagine funzionale dello sviluppo corticale umano, dei disturbi dello sviluppo neurologico e dell'evoluzione corticale.

Abstract

Gli organoidi corticali umani sono diventati strumenti importanti per studiare lo sviluppo del cervello umano, i disturbi dello sviluppo neurologico e l'evoluzione del cervello umano. Gli studi che analizzano la funzione genica per sovraespressione o knockout sono stati determinanti nei modelli animali per fornire intuizioni meccanicistiche sulla regolazione dello sviluppo della neocorteccia. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il knockout genico acuto mediato da CRISPR/Cas9 mediante elettroporazione di organoidi corticali umani affettati. Lo slicing degli organoidi corticali aiuta l'identificazione di strutture simili a ventricole per l'iniezione e la successiva elettroporazione, rendendolo un modello particolarmente adatto per la manipolazione genetica acuta durante lo sviluppo corticale umano. Descriviamo la progettazione di RNA guida e la validazione dell'efficienza del targeting in vitro e in organoidi corticali. L'elettroporazione degli organoidi corticali viene eseguita a stadi neurogenici medi, consentendo il targeting della maggior parte delle principali classi cellulari nella neocorteccia in via di sviluppo, tra cui la glia radiale apicale, le cellule progenitrici basali e i neuroni. Nel complesso, l'elettroporazione di organoidi corticali umani affettati rappresenta una potente tecnica per studiare la funzione genica, la regolazione genica e la morfologia cellulare durante lo sviluppo corticale.

Introduzione

La neocorteccia si riferisce al rivestimento esterno degli emisferi cerebrali ed è una struttura unica per i mammiferi. La neocorteccia rappresenta la sede delle funzioni cognitive superiori 1,2,3,4,5. Durante lo sviluppo, le cellule staminali neurali e le cellule progenitrici danno origine ai neuroni in un processo chiamato neurogenesi. Gli studi funzionali che indagano lo sviluppo della neocorteccia umana forniscono la base per chiarire i meccanismi alla base della regolazione delle cellule staminali neurali umane, delle patologie neurali e dell'evoluzione del cervello umano 2,6,7.

Storicamente, gli studi sullo sviluppo del cervello umano si basavano su approcci istologici descrittivi che utilizzavano tessuti post-mortem, con sistemi di coltura tissutale fluttuanti più recenti che consentivano indagini funzionali con tessuto fetale umano 8,9. Inoltre, è stato dimostrato che il tessuto cerebrale fetale umano ha la capacità di auto-organizzarsi in organoidi in espansione a lungo termine10. La ricerca sui tessuti fetali ha fornito importanti informazioni sullo sviluppo umano11,12, ma la limitata disponibilità di tessuti e le considerazioni etiche ne limitano l'applicazione diffusa per gli studi meccanicistici sullo sviluppo del cervello umano. Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati protocolli che consentono la generazione di organoidi neurali tridimensionali da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), inclusa la PSC indotta umana (hiPSC)13,14.

Gli organoidi cerebrali mostrano importanti caratteristiche del cervello in via di sviluppo, come la formazione di strutture ventricolari, la polarità apicobasale, la citoarchitettura corticale, la migrazione nucleare intercinetica durante la divisione della glia radiale e la migrazione neuronale. È importante sottolineare che questi nuovi modelli di organoidi umani ricapitolano le caratteristiche del cervello umano in via di sviluppo che non sono ben modellate nel topo, inclusi i tipi di progenitori neurali chiave evolutivamente rilevanti, in particolare la glia radiale basale (o glia radiale esterna)7,14,15. Diverse limitazioni dei primi protocolli di organoidi cerebrali - come problemi con l'eterogeneità degli organoidi, l'apporto limitato di nutrienti al nucleo interno e la varia identità regionale - sono state affrontate nei recenti progressi del protocollo e ci si può aspettare ulteriori miglioramenti nei prossimi anni 15,16,17,18,19. Gli organoidi cerebrali e corticali umani sono diventati rapidamente modelli chiave per studiare lo sviluppo corticale umano20, i disturbi neurologici 21,22,23,24 e l'evoluzione cerebrale 25,26,27,28,29 e per eseguire approcci di screening su larga scala 30,31,32.

Per la manipolazione genetica acuta, due metodi sono stati utilizzati principalmente in modelli animali di sviluppo della neocorteccia: la somministrazione virale mediante infezione di cellule bersaglio33 e l'elettroporazione in utero o in vitro 34,35. L'iniezione di DNA e, più recentemente, dei complessi ribonucleoproteici (RNP)36 CRISPR/Cas9 nei ventricoli laterali, seguita dall'elettroporazione, offre il vantaggio che specifiche regioni del cervello possono essere mirate in base all'orientamento degli elettrodi di elettroporazione. L'elettroporazione comporta brevi impulsi elettrici che aumentano temporaneamente la permeabilità della membrana cellulare, consentendo l'introduzione di DNA e altre molecole cariche nelle cellule. L'elettroporazione in utero è stata eseguita per la prima volta nel topo37, dove è diventata rapidamente una metodologia ampiamente applicata per la neurobiologia dello sviluppo. Il metodo è stato successivamente applicato anche ad altre specie, come il ratto 38,39 e il furetto 40,41,42, una specie girrencefalica utilizzata per studiare l'espansione della neocorteccia e il ripiegamento corticale 3,43,44,45.

L'elettroporazione è diventata anche un metodo importante nella ricerca sugli organoidi del cervello umano46. Negli organoidi cerebrali, l'elettroporazione è stata applicata per visualizzare la morfologia cellulare e gli assoni neuronali14,47, per fornire reagenti di knockdown genico 22,48,49 e per lo studio della funzione genica mediante sovraespressione50. Il metodo non è limitato ai modelli umani, ma è stato applicato anche per la modificazione genetica di organoidi cerebrali di primati50,51. Inoltre, è stata descritta l'elettroporazione di organoidi corticali generati in un bioreattore rotante di Spin Ω52.

In questo protocollo, delineiamo l'elettroporazione di organoidi corticali umani affettati15 per studi sulla funzione genica nello sviluppo corticale. Gli organoidi specifici della regione cerebrale aumentano la riproducibilità e la coerenza, che sono fondamentali per il successo dell'analisi quantitativa, ad esempio, nella modellazione delle malattie. Nel protocollo15 dell'organoide corticale umano affettato, potenti segnali di patterning vengono applicati durante la differenziazione delle iPSC per ottenere una popolazione omogenea di progenitori del prosencefalo dorsale, seguita dall'applicazione di terreni di coltura che promuovono la crescita dei tessuti con meno segnali istruttivi 53,54. È stato dimostrato che lo slicing di organoidi corticali riduce la morte cellulare derivante dalla ridotta disponibilità di nutrienti e ossigeno nel nucleo dell'organoide15. Inoltre, lo slicing supporta lo sviluppo di strutture simili a ventricole contenenti un'abbondante glia radiale basale, con una neurogenesi sostenuta che porta alla formazione di una regione espansa simile a una placca corticale15. Lo slicing ripetuto in questo protocollo rende anche questi organoidi corticali particolarmente adatti all'elettroporazione, poiché i lumi ventricolari possono essere facilmente identificati e bersagliati mediante iniezione. L'elettroporazione di organoidi corticali affettati è stata applicata per studiare le regioni regolatorie geniche e l'evoluzione corticale26,55.

Durante la procedura di elettroporazione, la miscela di iniezione viene erogata al lume delle strutture ventricolari. Dopo l'applicazione di un campo elettrico pulsato, la miscela viene assorbita dalla glia radiale apicale che riveste il ventricolo. Quando la glia radiale apicale si divide e dà origine a tipi di cellule più impegnate4, gli agenti elettroporati vengono trasmessi alle cellule progenitrici basali e ai neuroni. I progeni elettroporati sono distribuiti nella zona ventricolare (VZ) e nella zona subventricolare (SVZ) dopo 3 giorni e coprono la maggior parte della parete corticale, compresa la regione simile alla placca corticale (CP), a 7 giorni dopo l'elettroporazione durante gli stadi neurogeni medi26,55.

Qui, descriviamo la distruzione genica56 mediata da CRISPR/Cas9 mediante elettroporazione in organoidi corticali umani affettati26. Inoltre, il metodo dell'elettroporazione può essere applicato anche per la sovraespressione genica, la visualizzazione della morfologia cellulare e dei processi cellulari mediante l'espressione di proteine fluorescenti, la consegna di librerie di plasmidi per saggi Massive Parallel Reporter (MPRA), la consegna di strumenti di editing dell'epigenoma e la marcatura di cellule per l'imaging dal vivo.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) sono stati eseguiti in conformità con gli standard etici delineati nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e approvati dal Comitato di revisione etica dell'ospedale universitario di Dresda (IRB00001473; IORG0001076; numero di approvazione etica SR-EK-456092021).

1. Progettazione di RNA guida per knockout genico acuto mediato da CRISPR/Cas9

  1. Progettare una coppia di RNA guida (gRNA) che hanno come bersaglio lo stesso esone con una distanza idealmente di 7-11 bp (evitando multipli di 3 bp) tra i motivi adiacenti del protospaziatore (PAM) per aumentare la probabilità di distruzione delle proteine utilizzando software o strumenti online.
    NOTA: Idealmente, gli esoni che codificano domini funzionali dovrebbero essere mirati. In alternativa, si possono scegliere i primi esoni del trascritto (Figura 1A). Seleziona gli RNA guida in base al punteggio di attività (vicino a 1)57 e al punteggio di specificità (vicino al 100%)58.

2. Coltura di cellule staminali pluripotenti indotte umane

  1. Per generare organoidi corticali umani e convalidare la funzione del gRNA, utilizzare la linea hiPSC CRTDi004-A59 che deriva da un donatore sano.
  2. Coltura delle iPSC come descritto in precedenza60 su piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice basale di membrana in terreno di cellule staminali in condizioni standard (37 °C, 5% CO2). Le PSC indotte devono essere fatte passare all'80% di confluenza utilizzando un enzima per la dissociazione di singole cellule con l'integrazione dell'inibitore della via ROCK (1:1.000) durante le prime 24 ore.
    NOTA: Altre linee di iPSC possono essere utilizzate per la generazione di organoidi e la validazione del gRNA.

3. Estrazione di DNA genomico da cellule staminali pluripotenti indotte umane

  1. Utilizzare 2 pozzetti di hiPSC confluente all'80%-90% di una piastra a 6 pozzetti per l'estrazione del DNA genomico. Dissociare le cellule dalla piastra con un enzima per ottenere una sospensione a cellula singola. Prelevare le cellule in 1 mL di terreno di coltura staminale (volume totale), quindi centrifugare per 10 minuti a 600 x g e rimuovere il surnatante.
  2. Risospendere il pellet cellulare in 250 μL di tampone di lisi (50 mM TrisHCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 0,5 % SDS, 5 mM EDTA in H2O) e 12,5 μL di proteinasi K (10 mg/mL stock). Incubare per 2 ore a 55 °C e 250 giri/min.
  3. Miscelare in 100 μl di NaCl 5 mM. Centrifugare per 10 minuti a 18.000 x g a 4 °C e trasferire il surnatante in nuove provette di reazione da 1,5 mL.
  4. Aggiungere 250 μl di isopropanolo, capovolgere più volte le provette e centrifugare per 15 minuti a 18.000 x g a 4 °C.
  5. Rimuovere il surnatante, lavare con 500 μl di EtOH al 70 % (grado di biologia molecolare), capovolgere le provette e centrifugare per 10 minuti a 18.000 x g a 4 °C.
  6. Infine, rimuovere completamente il surnatante pipettandolo con cura e premendo le provette di reazione aperte su carta assorbente.
  7. Lasciare asciugare il pellet all'aria per 10 minuti a RT, quindi sciogliere il pellet in 100 μL di acqua priva di nucleasi per 30 minuti a 37 °C.
  8. Misurare la concentrazione del DNA con uno spettrometro. Il DNA genomico isolato è stabile a -20 °C per diversi mesi.

4. Verifica del riconoscimento del modello mediante gRNA (in vitro)

NOTA: Come primo approccio per convalidare il successo del riconoscimento del modello da parte dei gRNA, eseguire una reazione Cas9 in vitro in cui il DNA a doppio filamento viene scisso in due frammenti che possono essere distinti mediante elettroforesi su gel di agarosio 40,61,62.

  1. Per generare il modello, eseguire una reazione a catena della polimerasi (PCR) con una master mix PCR ad alta fedeltà e primer da 10 μM su DNA genomico isolato da hiPSC (sezione 3) utilizzando le seguenti condizioni cicliche: denaturazione iniziale a 98 °C per 30 s, 40 cicli [98 °C, 10 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 1 min] e allungamento finale a 72 °C per 5 min.
    1. Regolare la temperatura di ricottura in base ai primer PCR. Assicurarsi che l'amplicone abbia una dimensione compresa tra 800 bp e 1,5 kb con localizzazione asimmetrica dei siti di legame del gRNA.
    2. Risolvere il prodotto della PCR mediante elettroforesi su gel su un gel di agarosio all'1,5%, tagliare la banda corrispondente dal gel ed estrarre il DNA26.
    3. Misurare la concentrazione di DNA del prodotto PCR estratto con uno spettrometro.
  2. Assemblare il gRNA funzionale combinando 10 μM di RNA CRISPR (crRNA, sequenza personalizzata, stock da 100 μM) e 10 μM di tracrRNA (stock da 100 μM) in tampone duplex privo di nucleasi (volume totale da 5 μL). Incubare la miscela per 5 minuti a 95 °C, quindi lasciarla raffreddare a temperatura ambiente (RT).
  3. Creare il complesso ribonucleoproteico (RNP) combinando 10 μM di gRNA dal passaggio 4.2 e 1 μM di enzima Cas9 (da Streptococcus pyogenes, 62 μM stock) in PBS per 15 minuti a RT (25 μL di volume totale).
  4. Per eseguire la reazione di digestione in vitro , miscelare 1 μM del complesso RNP (dalla fase 4.3) con 0,1 μM di DNA stampo (prodotto della PCR dalla fase 4.1) e 1x tampone di reazione nucleasica Cas9 (contenente 200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM EDTA; pH 6,5; può essere conservato in aliquote a -20 °C).
    1. Riempire fino a un volume finale di 10 μl con acqua priva di nucleasi.
    2. Incubare la reazione a 37 °C per 1 ora.
    3. Aggiungere 2 mg/mL di proteinasi K e incubare per altri 10 minuti a 56 °C per rilasciare il substrato del DNA dall'enzima Cas9. Conservare la miscela di reazione digerita a 4 °C o -20 °C fino all'analisi finale.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare un rapporto molare 10:1 del substrato Cas9-RNP:DNA per ottenere la migliore efficienza di scissione. Se necessario, diluire il prodotto della PCR in acqua priva di nucleasi alla concentrazione richiesta. Come controllo negativo, può essere utilizzata una miscela di reazione priva del gRNA o dell'enzima Cas9.
  5. Visualizza i prodotti scissi mediante elettroforesi su gel di agarosio su un gel di agarosio al 2%.
    NOTA: Idealmente, dovrebbero essere visibili due bande di dimensioni diverse e la banda stampo dovrebbe essere scomparsa o essere fortemente ridotta per ottenere gRNA efficienti (Figura 1B).

5. Verifica della funzione del gRNA in cellule staminali pluripotenti indotte umane

NOTA: Si raccomanda di testare l'efficienza dei gRNA che hanno come bersaglio la stessa linea cellulare da cui verranno generati gli organoidi corticali26. Per questo, i complessi RNP contenenti i gRNA rilevanti vengono co-trasfettati con un plasmide di espressione GFP in hiPSC, le cellule vengono coltivate per 3 giorni e il DNA genomico viene successivamente isolato per l'analisi di sequenziamento. Per ogni test del gRNA, sono necessarie circa 200.000 cellule. Le cellule non devono essere confluenti per più del 70%-80% e devono essere state fatte passare almeno due volte dopo lo scongelamento. È importante portare con sé un controllo negativo (gLACZ)36,63 e una condizione simulata (soluzione di nucleofecazione senza RNP).

  1. Modificare il mezzo della hiPSC per includere l'inibitore ROCK (1:1.000) 2 ore prima dell'esperimento per aumentare la vitalità delle cellule in una cappa di coltura cellulare.
  2. Rivestire il numero appropriato di pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con una matrice di membrana basale.
  3. Avviare l'unità nucleofettrice ("unità X" per strisce a 16 pozzetti) e selezionare il programma "Celle ES, H9" come preprogrammato (impulso CB150). Selezionare il numero appropriato di pozzetti della striscia.
  4. Preparare i complessi RNP combinando 24 μM di crRNA e 24 μM di tracrRNA in Duplex Buffer.
    1. Incubare a 95 °C per 5 minuti, quindi lasciare raffreddare fino a RT, come descritto al punto 4.2.
    2. Nel frattempo, diluire l'enzima Cas9 a 8 μM in PBS.
    3. Combinare 3 μL di gRNA e 3 μL di Cas9 e incubare 15 minuti a RT per assemblare l'RNP.
      NOTA: Un rapporto molare di 3:1 gRNA:Cas9 offre un'efficienza di scissione ottimale. Per testare i gRNA in coppia, preparare ciascun RNP separatamente e combinare 1,5 μL di ciascun RNP alla fine.
  5. Durante l'incubazione di 15 minuti dell'RNP, preparare l'hiPSC per la nucleofeczione sotto una cappa di coltura cellulare.
    1. Sostituire il rivestimento della membrana basale con 1,5 mL di terreno di cellule staminali integrato con l'inibitore ROCK (1:1.000) e 1x Penicillina/Streptomicina per pozzetto.
    2. Preparare la soluzione di nucleofecazione come miscela master su ghiaccio seguendo le istruzioni del produttore.
    3. Staccare le hiPSC dalla piastra per ottenere una sospensione a singola cellula (come descritto nel paragrafo 2) e contare le cellule con colorazione con blu di tripano in una camera di conteggio Neubauer.
    4. Pellet 200.000 cellule vive per coppia di gRNA a 600 x g per 5 min.
  6. Nella cappa di coltura cellulare, su ghiaccio, aggiungere 3 μL di RNP a 20 μL di soluzione di nucleofecazione più 0,2 μg/μL di plasmide pCAG-GFP.
  7. Risospendere le cellule pellettate nei 23 μL della miscela di nucleofecazione finale e trasferirle in 1 pozzetto di una striscia di nucleofecazione a 16 pozzetti su ghiaccio.
  8. Una volta che tutte le condizioni sono nella striscia, posizionarla nell'unità X della macchina nucleofector all'esterno del cofano e premere il pulsante Start per avviare la nucleofezione.
  9. Successivamente, trasportare nuovamente la striscia di nucleofecazione sotto la cappa di coltura cellulare e trasferire le cellule nucleofettesse sulla piastra a 6 pozzetti preparata risciacquando i pozzetti con un po' di terreno dalla piastra.
  10. Coltivare l'hiPSC per 3 giorni, cambiando il terreno contenente 1x Penicillina/Streptomicina al giorno. Dopo 24 ore, l'inibitore ROCK non è più necessario.
  11. Verificare la presenza di segnale GFP con un microscopio a fluorescenza convenzionale (Figura 1C).
    1. Il giorno 3, selezionare e raccogliere le cellule GFP-positive mediante smistamento cellulare attivato fluorescente (FACS).
    2. Preparare il tampone di selezione con il 2% di FBS in PBS e mantenerlo a 4 °C.
    3. Raffreddare una centrifuga da tavolo a 4 °C. Preparare provette di reazione da 1,5 mL con 50 μL di tampone di smistamento contenente l'inibitore ROCK (1:1.000) per la raccolta di cellule dopo FACS su ghiaccio e provette a fondo tondo in polistirene da 5 mL con tappi per filtri cellulari su ghiaccio.
    4. Realizzare sospensioni a singola cellula delle cellule nucleofettate.
    5. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura contenente l'inibitore ROCK (1:1.000) per campione e centrifugare a 600 x g per 5 minuti.
    6. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 200 μL di tampone di smistamento con l'inibitore ROCK (1:1.000), quindi aggiungere 0,4 μL di DAPI (2 ng/μL) per identificare le cellule vive mediante FACS.
    7. Pipettare la soluzione cellulare attraverso il tappo del filtro cellulare delle provette a fondo tondo raffreddate per rimuovere eventuali grumi di cellule residue.
      NOTA: Il DAPI può compromettere la vitalità cellulare nel tempo e, pertanto, è meglio aggiungere una quantità di nuovo a ciascun campione prima della selezione.
    8. Smistare 10.000 cellule vive GFP-positive (DAPI-negative) nelle provette di reazione da 1,5 mL precedentemente preparate con 50 μL di tampone di smistamento contenente l'inibitore ROCK (su ghiaccio).
  12. Dopo il FACS, estrarre direttamente il DNA genomico dalle cellule selezionate.
    1. Centrifugare le celle raccolte e ordinate nel buffer di selezione a 600 x g per 10 minuti.
    2. Rimuovere il surnatante e prelevare il pellet cellulare in 250 μl di tampone di lisi più 12,5 μl di proteinasi K per campione.
    3. Continuare come descritto nel paragrafo 3.
    4. Infine, sciogliere il pellet di DNA in 50 μL di acqua priva di nucleasi.
  13. Eseguire una PCR per generare un modello per il sequenziamento Sanger come descritto nel passaggio 4.1. Come controllo, utilizzare il DNA della condizione gLACZ e i primer che hanno come bersaglio il gene di interesse (gli stessi primer utilizzati nella sezione 4). Estrarre le bande appropriate dall'elettroforesi su gel di agarosio, purificarle su una colonna e inviarle per il sequenziamento Sanger.
  14. Allinea i risultati del sequenziamento Sanger utilizzando un allineamento globale a coppie.
    NOTA: Il successo del targeting può essere identificato da segnali sovrapposti o sequenze incomplete risultanti da inserimenti/delezioni casuali attorno al sito di legame del gRNA (Figura 1D).

6. Generazione di organoidi corticali umani affettati

NOTA: Gli organoidi corticali umani (hCO) sono generati secondo il metodo dell'organoide neocorticale affettato (SNO), come precedentemente descritto in dettaglio15,60.

  1. Staccare piccole colonie di hiPSC da 1 pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mg/mL di collagenasi incubando per 30-40 minuti a 37 °C in un incubatore. Nel frattempo, rivestire una nuova piastra a 6 pozzetti con la matrice di membrana basale.
    1. Arrestare l'enzima con 1 mL di terreno di coltura di cellule staminali e raccogliere le colonie con una punta a foro largo in 5 mL di terreno di cellule staminali in una provetta conica da 15 mL.
      NOTA: Tutte le operazioni che menzionano "puntali per pipette a foro largo" possono essere eseguite anche con puntali tagliati a un'apertura di almeno 2 mm di diametro.
    2. Una volta che le colonie si sono depositate sul fondo, rimuovere il vecchio terreno e sostituirlo con un terreno di coltura con cellule staminali fresche.
    3. Utilizzando una punta a foro largo, distribuire uniformemente le colonie sulla piastra rivestita a 6 pozzetti con 1,5 mL di terreno di cellule staminali per pozzetto.
    4. Coltivare l'hiPSC per 2-3 giorni in condizioni standard.
  2. Una volta che le colonie di hiPSC hanno raggiunto circa 1,5 mm di diametro, staccare nuovamente tutte le colonie con 1 mg/mL di collagenasi incubando per un massimo di 1 ora a 37 °C.
    1. Arrestare l'enzima con 6 mL di terreno 115 per il proencefalo e raccogliere le colonie staccate in una provetta conica da 15 mL utilizzando punte a foro largo.
    2. Una volta che le colonie si sono depositate, rimuovere il vecchio terreno e lavare con 5 ml di terreno 1 per il proencefalo.
    3. Infine, trasferire le colonie in una piastra a 6 pozzetti con attacco ultra-basso contenente 3 mL di terreno proencefalico 1 per pozzetto con punte a foro largo e lasciare che formino corpi embrioidi (EB). Questo passaggio indica il giorno 0 del protocollo dell'organoide corticale umano. Da qui in poi, seguire il protocollo pubblicato15.
  3. Il giorno 7, incorporare gli EB in una matrice di membrana basale, con circa 20 EB per "biscotto" e coltura per 1 settimana nel terreno del proencefalo 2 15. Al giorno 14, rilasciare meccanicamente gli organoidi dalla matrice e continuare la coltura in piastre di attacco ultra-basse a 6 pozzetti nel terreno del proencefalo 315 su un agitatore orbitale a 120 giri/min.
  4. Dal giorno 35, la matrice basale della membrana all'1% v/v viene integrata al terreno.
  5. Alla settimana 6, incorporare gli organoidi in agarosio a basso punto di fusione al 3% e tagliarli su un vibratomo in fette spesse 500 μm (Figura 2A, B), che supporta l'apporto di ossigeno e nutrienti in tutti gli organoidi. Se necessario, ripetere l'affettatura degli organoidi ogni 4 settimane.
  6. Dal giorno 70, coltura di organoidi nel terreno del proencefalo 415.

7. Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati

NOTA: Gli organoidi corticali umani possono essere iniettati ed elettroporati non appena sono visibili strutture simili a ventricoli, all'incirca dalla settimana 2 in poi. Per gli organoidi in fase avanzata (dalla 5ª settimana in su), l'elettroporazione è più efficiente e la vitalità delle cellule è migliore quando la procedura viene eseguita 2 giorni dopo l'affettamento degli organoidi26,55. Dopo l'affettatura, le strutture ventricolari sono facili da identificare, il che facilita la procedura di iniezione (Figura 2C, D). Inoltre, le strutture ventricolari rimangono parzialmente aperte per un po' di tempo dopo l'affettatura, consentendo la fuoriuscita della soluzione iniettabile in eccesso, che protegge l'integrità della cintura di giunzione aderente che riveste i ventricoli. Il programma di slicing può essere spostato in modo che corrisponda alla sequenza temporale sperimentale. L'affettatura deve essere ripetuta ogni 3-4 settimane per colture a lungo termine.

  1. Estrarre i capillari in vetro borosilicato per le iniezioni con un estrattore microcapillare con le seguenti impostazioni: P 500, calore 600, trazione 30, velocità 40, tempo 1. Conservare i capillari in una grande capsula di Petri usando del nastro adesivo per il fissaggio.
  2. Il giorno dell'elettroporazione, preparare nuovamente il complesso RNP CRISPRR/Cas9 come descritto al punto 5.4 con una concentrazione finale di 24 μM di RNP. La co-elettroporazione di 0,1 μg/μL di plasmide pCAG-GFP (o di qualsiasi altro reporter fluorescente) supporta l'identificazione di celle elettroporate. Inoltre, aggiungere lo 0,1% di soluzione Fast Green in acqua alla miscela di iniezione finale, il che consente di confermare l'avvenuta erogazione della miscela.
    NOTA: Preparare miscele separate per ogni gene di interesse e per il controllo gLACZ .
  3. Preriscaldare la soluzione di Tyrode (una confezione di sale di Tyrode, 1 g di NaHCO3, 13 mL di 1 M HEPES pH 7,25 in 1 L di dH2O) a 37 °C. Conservare la restante soluzione di Tyrode a 4 °C per diversi mesi.
  4. Selezionare hCO con strutture ventricolari ben sviluppate (Figura 2E) e scartare tutti gli organoidi che non mostrano strutture ventricolari (Figura 2F). Trasferire fino a 10 organoidi in una piastra di Petri di 6 cm contenente la soluzione di Tyrode e conservare gli hCO rimanenti nell'incubatore.
  5. Riempire un microcapillare di vetro con 10 μl di soluzione iniettabile con l'aiuto di un puntale per pipetta microloader e aprire il capillare pizzicando l'estremità sottile con una pinzetta. Controllare se il capillare è aperto rilasciando un po' di miscela per iniezione nella soluzione di Tyrode. Effettuare le iniezioni con un microiniettore in un ambiente continuo con gating controllato tramite un interruttore a pedale.
  6. Inserire il capillare al centro di strutture ventricolari (Figura 2C) e iniettare 0,2-0,5 μL della miscela premendo l'interruttore a pedale.
    NOTA: Possono essere iniettati fino a 5 ventricoli per hCO con un totale di 7-8 hCO processati per replica. Idealmente, i ventricoli rivolti verso l'esterno dell'hCO dovrebbero essere mirati poiché questi sono generalmente i più sviluppati (Figura 2G, H).
  7. Usa una pinza fine per spingere l'organoide contro per limitare i movimenti. Non afferrare effettivamente gli organoidi (Figura 2C).
  8. Dopo l'iniezione, utilizzare una punta di pipetta a foro largo per trasferire 1-2 organoidi in una camera di elettroporazione contenente la soluzione di Tyrode (Figura 2C, D).
  9. Orientare gli organoidi iniettati verso gli elettrodi in modo da mirare alla glia radiale apicale nelle regioni ventricolari rivolte verso l'esterno dell'organoide.
  10. Collegare i cavi alla camera di elettroporazione con il lato iniettato dell'organoide rivolto verso il polo positivo (anodo; Figura 2D).
  11. Premere il pulsante Pulse dell'elettroporatrice per elettroporare con cinque impulsi da 38 V per 50 ms ciascuno a intervalli di 1 s.
    NOTA: Le impostazioni dell'elettroporazione possono dipendere dall'elettroporatore disponibile e potrebbero dover essere ottimizzate.
  12. Ripetere le fasi di iniezione ed elettroporazione fino a quando non viene elaborato il numero desiderato di organoidi.
  13. Raccogliere gli organoidi elettroporati in un mezzo a RT fino a quando tutti i campioni per la stessa condizione sono stati elaborati. Assicurarsi che non rimangano fuori dall'incubatrice per più di 30 minuti in totale.
  14. Successivamente, rimettere gli hCO elettroporati nel terreno di coltura appropriato e coltivarli senza agitarli per le prime 24 ore.
    NOTA: Dopo 2-3 giorni, il segnale GFP dovrebbe essere visibile nelle hCO elettroporate sotto uno stereoscopio fluorescente (Figura 2H). Il momento dell'analisi dopo l'elettroporazione dovrebbe essere scelto in base alla domanda biologica a cui rispondere. Dopo 3-7 giorni, le cellule GFP-positive si trovano in VZ, SVZ e CP15,60.

8. Fissazione e criosezione di organoidi corticali umani elettroporati

  1. Fissare gli organoidi elettroporati in paraformaldeide (PFA) al 4% per 30 minuti a RT in una provetta di reazione da 2 mL.
    ATTENZIONE: Il PFA è tossico e cancerogeno. Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono PFA sotto una cappa aspirante. Si consiglia vivamente l'uso di guanti in nitrile e occhiali protettivi.
  2. Lavare una volta in PBS per 5 minuti e conservare in saccarosio al 30% filtrato sterile in PBS a 4 °C fino a quando il tessuto non è completamente saturo di saccarosio.
  3. Incorporare organoidi fissati in un mezzo di inclusione per campioni di tessuto congelati più il 15% di saccarosio in PBS in blocchi su ghiaccio secco.
  4. Preparare sezioni da 20-30 μm in un criostato e raccogliere il tessuto su vetrini adesivi26,64.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa una volta che gli organoidi fissati sono in saccarosio (stabile a 4 °C per diversi mesi) o incorporati in un mezzo di inclusione (i blocchi congelati possono essere conservati in sacchetti ermetici a -20 °C per diversi mesi o anni).

9. Analisi immunoistochimica di organoidi corticali umani elettroporati

  1. Per l'analisi immunoistochimica26,64, eseguire il prelievo dell'antigene in tampone citrato (10 mM di citrato di sodio, polisorbato 0,05% 20 in dH2O, pH 6,0) per 1 ora a 70 °C in bagnomaria.
  2. Lavare una volta in PBS per 5 minuti, quindi asciugare brevemente i vetrini e cerchiare le sezioni con una penna a cera.
  3. Temprare con 0,1 M di glicina in PBS (pH 7,4) per 30 minuti a RT e successivamente lavarla due volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
  4. Coprire le sezioni in tampone bloccante (10% siero di cavallo, 0,1% Octoxinol 9 in PBS) e incubare per 30 minuti a RT.
  5. Preparare gli anticorpi primari nel tampone bloccante e incubare su sezioni per una notte a 4 °C.
  6. Il giorno successivo, lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna, incubare con anticorpi secondari e DAPI in tampone bloccante per 1 ora a RT e lavare nuovamente tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
  7. Montare i vetrini nel supporto di montaggio e scattare l'immagine su un microscopio a fluorescenza (Figura 3).
    NOTA: Si raccomanda di includere un anticorpo contro il fluoroforo utilizzato nella miscela di iniezione per identificare le cellule bersaglio poiché il segnale nativo viene spesso spento dopo la fissazione. Gli anticorpi e i coloranti utilizzati per la colorazione in immunofluorescenza, come rappresentato nella Figura 3, sono elencati nella Tabella 1.

10. Verifica del knockout mediato da CRISPR/Cas9 a livello proteico

  1. Per verificare il knockout a livello proteico, eseguire l'immunoistochimica per la proteina bersaglio sugli organoidi elettroporati (Figura 3I).
  2. Visualizzare sia il controllo gLACZ che gli organoidi mirati utilizzando le stesse impostazioni per consentire il confronto dell'intensità della fluorescenza (Figura 3I, J). Fallo in modo specifico per la zona per confrontare l'effetto sui diversi tipi di cellule della neocorteccia in via di sviluppo. Conta le celle in ImageJ/Fiji (plug-in Cell Counter) o segmentando utilizzando il plug-in StarDist 65.

Risultati

L'ablazione genica mediata da CRISPR/Cas9 richiede la progettazione di gRNA. Generalmente, il targeting di uno dei primi esoni di un gene di interesse con una coppia di gRNA distanziati di 7-11 bp l'uno dall'altro (evitando multipli di 3 bp) funziona bene (Figura 1A). Come primo test, l'efficienza del riconoscimento del modello da parte dei gRNA può essere interrogata in vitro utilizzando un modello di PCR 26,40,62. Il targeting efficiente e il taglio mediato da Cas9 sono visibili nella riduzione del DNA stampo e nella comparsa di prodotti di DNA scissi su un gel di agarosio (Figura 1B). Ulteriori test del gRNA possono essere eseguiti nella linea iPSC utilizzata per la generazione di organoidi corticali. Ciò richiede la nucleofezione di iPSC, che può essere visualizzata mediante un'espressione reporter fluorescente riuscita (Figura 1C). Il targeting efficiente del locus di interesse può essere verificato mediante sequenziamento Sanger, risultando in un cromatogramma che termina bruscamente o si sovrappone attorno al sito di targeting (Figura 1D), risultante da uno spettro di indel dalla riparazione della rottura del doppio filamento mediante l'unione di estremità non omologa66. I test di efficienza dell'RNA guida in vitro e in cellule iPSC aiutano a selezionare coppie di gRNA efficienti per l'ablazione genica negli organoidi corticali.

Prima dell'elettroporazione, gli organoidi corticali vengono affettati, il che supporta l'identificazione dei lumi ventricolari per l'iniezione della miscela di elettroporazione (Figura 2A-C). Gli organoidi iniettati vengono quindi trasferiti nella camera di elettroporazione (Figura 2D). Per l'elettroporazione, dovrebbero essere utilizzati organoidi corticali con strutture ventricolari ben sviluppate (Figura 2E), mentre gli organoidi corticali privi di strutture visibili dovrebbero essere scartati (Figura 2F). La miscela per elettroporazione contiene un colorante che consente la visualizzazione dei ventricoli iniettati durante la procedura (Figura 2G). Dopo 1-3 giorni di coltura, i ventricoli mirati con successo sono visibili dal segnale GFP nativo al microscopio a fluorescenza (Figura 2H).

Per un'analisi istologica approfondita, è possibile eseguire l'immunoistochimica delle criosezioni. Idealmente, più ventricoli mirati sono presenti all'interno di un organoide corticale elettroporato (Figura 3A, B). Le elettroporazioni più ottimali mirano a strutture simili a ventricole nella regione esterna dell'organoide rivolta verso l'esterno (Figura 3C), poiché questi sono tipicamente i ventricoli più espansi. In alcuni casi, l'elettroporazione può portare a un'eccessiva morte cellulare (Figura 3D, E), ad esempio, quando le concentrazioni di plasmidi sono troppo elevate o le impostazioni di elettroporazione sono subottimali. Le elettroporazioni rivolte verso l'interno dell'organoide (Figura 3F) spesso coinvolgono regioni meno espanse delle strutture ventricolari rispetto all'esterno. Nella nostra esperienza, è utile concentrare l'analisi quantitativa su regioni definite dell'organoide per ridurre la variabilità. A volte, l'elettroporazione può causare l'interruzione della superficie apicale (Figura 3G), ad esempio, quando il volume di iniezione è troppo elevato, causando la rottura dei ventricoli, o quando gli impulsi elettrici sono troppo forti, portando alla delaminazione cellulare. Infine, quando due ventricoli adiacenti sono presi di mira (Figura 3H), può diventare difficile assegnare i confini delle zone corticali e l'origine delle cellule bersaglio.

L'immunoistochimica può essere utilizzata per verificare il successo del knockout mediato da CRISPR/Cas9 a livello proteico nelle cellule di interesse (Figura 3I), esemplificato qui prendendo di mira la proteina PCGF467 del Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1). L'intensità del segnale può essere analizzata in cellule GFP-positive in condizioni di controllo rispetto a quelle sperimentali (Figura 3J). In alternativa, se non è disponibile un anticorpo adatto, le cellule bersaglio possono essere isolate mediante FACS da organoidi corticali60 e ulteriormente analizzate mediante Sanger o Next Generation Sequencing36. Inoltre, la riduzione dei livelli proteici può essere analizzata anche utilizzando il Western blotting.

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Figura 1: Progettazione e validazione dell'RNA guida per il knockout genico acuto mediato da CRISPR/Cas9. (A) Illustrazione schematica della strategia di progettazione dell'RNA guida (gRNA), con due gRNA che hanno come bersaglio un esone di un gene di interesse. Le frecce nere indicano i primer PCR per la preparazione del modello utilizzati per la convalida del gRNA. (B) Validazione dell'efficienza del gRNA in vitro. I modelli amplificati con PCR sono stati digeriti con complessi RNP. Dopo la scissione riuscita, due bande di dimensioni diverse sono visibili dopo l'elettroforesi su gel (a sinistra), mentre il modello rimane non tagliato per i gRNA a bassa efficienza (a destra). (C) Immagine in campo chiaro (a sinistra), fluorescenza GFP (al centro) e immagini unite (a destra) di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) 3 giorni dopo la nucleofeczione con il complesso RNP e un plasmide GFP. Barre della scala: 350 μm. (D) Convalida dell'efficienza del gRNA nelle hiPSC mediante sequenziamento Sanger di DNA amplificato da cellule GFP-positive. Dopo la scissione riuscita del DNA a doppio filamento, le tracce di sequenziamento mostrano segnali sovrapposti a partire dal sito bersaglio del gRNA (in alto, KO1). In caso di targeting non riuscito, la traccia della sequenza del DNA rimane invariata (in basso, KO2) rispetto al controllo LACZ . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati. (A) Illustrazione schematica che mostra il flusso di lavoro per l'elettroporazione di organoidi corticali umani (hCO). In primo luogo, gli hCO vengono sezionati in fette spesse 500 μm. Due giorni dopo, la miscela RNP contenente un plasmide di espressione GFP e Fast Green viene iniettata nei lumi di strutture simili a ventricoli, preferenzialmente nella regione esterna degli hCO. Per l'elettroporazione, gli hCO vengono inseriti nella camera di elettroporazione. Dopo diversi giorni di coltura, è possibile rilevare un segnale GFP nelle aree elettroporate. (B) Immagini del sezionamento vibratomico di hCO. Gli organoidi sono incorporati in agarosio a basso punto di fusione al 3% in un mezzo in un blocco (a sinistra). Il blocco viene sezionato in fette di 500 μm di spessore (al centro). Gli organoidi affettati vengono trasferiti nuovamente nel piatto di coltura con una punta della pipetta a foro largo (a destra). (C) Immagini che mostrano l'iniezione della miscela contenente RNP, pCAG-GFP e 0,1% Fast Green in strutture ventricolari degli organoidi. Gli organoidi sono immersi nella soluzione di Tyrode e il sottile capillare di vetro è inserito nel lume del centro delle strutture ventricolari (a sinistra). Le pinze vengono utilizzate per stabilizzare gli organoidi (sinistro e centrale). I ventricoli all'esterno degli organoidi sono mirati (al centro). Gli organoidi iniettati vengono trasferiti nella camera di elettroporazione, o successivamente nel piatto di coltura, con puntali di pipetta a foro largo (a destra). (D) Immagini della camera di elettroporazione, che è composta da una capsula di Petri di vetro e due lame metalliche incollate al vetro. Le lame metalliche fungono da elettrodi e contengono fori per fissare i cavi da collegare all'elettroportatore. Il lato iniettato dell'hCO, visibile attraverso un'ombra verde, deve essere rivolto verso l'anodo (polo positivo, cavo rosso) (a destra). (E) Immagini rappresentative di hCO che mostrano strutture simili a ventricole ben sviluppate. L'anello più chiaro rappresenta l'area simile alla zona ventricolare. Il cerchio più scuro al centro della struttura ventricolare rappresenta il lume e dovrebbe essere mirato per l'iniezione. (F) Immagini rappresentative di hCO prive di strutture ventricolari ben sviluppate, che si consiglia di non includere per ulteriori esperimenti. (G) Immagini rappresentative di hCO dopo l'iniezione della miscela di elettroporazione, in cui le aree mirate sono visibili da Fast Green (frecce arancioni). (H) Immagine rappresentativa di hCO che mostra il segnale nativo della GFP 24 ore dopo l'elettroporazione. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Analisi immunoistochimica di organoidi corticali umani affettati elettroporati. (A) Schema che rappresenta un organoide corticale umano elettroporato (hCO) con segnale fluorescente verde. (B) Colorazione DAPI (grigio) e immunofluorescenza per GFP (verde) di un hCO criosezionato con ventricoli elettroporati multipli, 7 giorni dopo l'elettroporazione. (C-H) Immagini di esempio di diversi risultati di elettroporazione, colorati per GFP (verde) e nuclei (DAPI, grigio). (C) Un'elettroporazione ottimale con nuclei intatti (vedi inserto 1, D), una struttura ventricolare ininterrotta e cellule elettroporate nell'area rivolta verso l'esterno dell'organoide, che di solito è più espansa. (E) Esempio di hCO che mostra una massiccia morte cellulare nell'area elettroporata (vedi anche inserto 2, D), caratterizzata da nuclei piccoli, densi di DAPI e distorti. (F) Una corretta elettroporazione diretta verso l'interno dell'organoide, che è spesso più difficile da interpretare a causa delle aree corticali simili a placche che si fondono con i ventricoli adiacenti. (G) Strutture ventricolari interrotte al centro dell'area elettroporata (freccia arancione). (H) Un esempio di hCO contenente più ventricoli più piccoli che sono parzialmente fusi e, quindi, difficili da quantificare. (I) Colorazione DAPI (grigio) e immunofluorescenza per GFP (verde) e PCGF4 (magenta) 7 giorni dopo l'elettroporazione di un complesso RNP mirato a LACZ (gLACZ KO, a sinistra) o PCGF4 (gPCGF4 KO, a destra) per knockout mediato da CRISPR/Cas9. Le cellule cerchiate evidenziano la ridotta intensità di PCGF4, indicando il successo dell'ablazione genica. Un segnale uniforme può essere visto nel controllo LACZ (a sinistra). (J) Il grafico mostra l'intensità quantificata di PCGF4 dopo immunofluorescenza in cellule GFP-positive per il controllo (gLACZ KO) e il KO di PCGF4 (gPCGF4 KO) rispetto all'espressione mediana di PCGF4 nella condizione gLACZ. Ogni punto rappresenta una cella. Dati provenienti da 3-4 organoidi provenienti da due lotti diversi (grigio e nero) della stessa linea hiPSC. p < 0,0001, test di Mann-Whitney. Tutte le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale a scansione laser (B, C) o fluorescente (E-I). Le immagini rappresentano proiezioni di intensità massima di z-stack di 10-15 μm di spessore. Le linee tratteggiate bianche indicano la superficie apicale rivolta verso il lume del ventricolo e le superfici esterne degli hCO. Le linee tratteggiate arancioni indicano il bordo VZ/SVZ nei ventricoli uniti. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Anticorpo/ColoranteDiluizione
Pollo anti-GFP1:2,000
Mouse anti-PCGF41:300
Alexa Fluor 488 Asino Anti-Pollo1:1,000
Alexa Fluor 555 Asino Anti-Coniglio1:1,000
DAPI1 mg/mL di brodo; 1:1,000

Tabella 1: Elenco degli anticorpi e dei coloranti e della loro diluizione utilizzati per la colorazione in immunofluorescenza.

Discussione

Gli organoidi cerebrali e corticali umani sono diventati modelli chiave per studiare lo sviluppo della neocorteccia umana 7,16,17. Per la modellazione dei disturbi umani, le linee isogeniche hiPSC e gli organoidi sono diventati il gold standard68. Tuttavia, poiché la generazione di nuove linee iPSC richiede tempo e denaro, la manipolazione acuta di modelli di organoidi corticali per studi sulla funzione genica è stata ampiamente applicata.

L'elettroporazione degli organoidi cerebrali e corticali 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 è facile da implementare e molti laboratori che hanno tradizionalmente utilizzato modelli animali per studi funzionali sono dotati degli strumenti necessari. Per l'iniezione in vivo, i ventricoli laterali sono tipicamente mirati 34,36,37,39,40,41,42. Questi sono modellati negli organoidi corticali da strutture simili a ventricole caratterizzate da un lume centrale che può essere iniettato allo stesso modo. L'elettroporazione degli organoidi corticali si rivolge principalmente ai piedi terminali delle cellule che rivestono i ventricoli, tipicamente la glia radiale apicale69. L'efficienza di targeting varia da un esperimento all'altro, ma in genere è possibile ottenere da 100 a 1.000 celle GFP-positive per organoide dopo 3-7 giorni di elettroporazione. La durata del ciclo cellulare nelle cellule progenitrici neurali umane è circa il doppio rispetto al topo, dove la glia radiale apicale ha una lunghezza del ciclo cellulare di 14 ore e le cellule progenitrici basali di 23 oree 70. Pertanto, dopo 3 giorni, principalmente la glia radiale apicale e le cellule progenitrici intermedie sono GFP-positive, mentre le cellule GFP-positive sono distribuite in tutte le zone dopo 7 giorni. Il segnale GFP può ancora essere osservato diversi mesi dopo l'elettroporazione, con le cellule GFP-positive che rappresentano principalmente neuroni sparsi in tutto l'organoide, permettendoci di analizzare la morfologia delle singole cellule. Il targeting delle cellule progenitrici neurali che rivestono il ventricolo è fattibile durante le fasi in cui le regioni ventricolari sono identificabili al microscopio a campo chiaro. Nell'attuale protocollo15, questo è possibile dalla settimana 2 alla settimana 12 di sviluppo dell'organoide corticale, dopo di che i ventricoli si restringono e non sono più visibili. Per uno sperimentatore esperto, è possibile iniettare 50-80 organoidi in una sessione.

Mentre la progenie della glia radiale apicale eredita i reagenti di manipolazione genica durante la divisione cellulare, il targeting diretto di cellule mature, come neuroni e astrociti, non è fattibile con l'approccio standard dell'elettroporazione. Invece, i metodi di targeting virale sono stati applicati alle cellule postmitotiche del sistema nervoso33,71. In particolare, i virus adeno-associati ricombinanti (AAV) sono ampiamente utilizzati per il trasferimento genico nel sistema nervoso in quanto sono facili da produrre e trasdurre cellule terminalmente differenziate con alta efficienza71. Inoltre, gli AAV possono essere indirizzati a specifiche sottopopolazioni neuronali. Diversi approcci di targeting virale, tra cui l'uso di adeno, Sendai e lentivirus, sono già stati applicati negli organoidi cerebrali e corticali 15,25,29,30,32,47,72,73,74.

Una limitazione nei protocolli degli organoidi cerebrali è lo sviluppo di un nucleo necrotico a causa dell'apporto limitato di ossigeno e nutrienti. Diverse strategie sono state implementate per migliorare la vitalità cellulare nel centro organoidi, tra cui la coltura di organoidi in bioreattori rotanti14,54, la co-coltura di cellule endoteliali o approcci di bioingegneria per modellare la vascolarizzazione75,76, il trapianto di organoidi in modelli di roditori18,77 e l'affettatura di organoidi15,47. Qui, abbiamo utilizzato il protocollo dell'organoide corticale umano affettato, che ha dimostrato di mostrare una ridotta ipossia nel nucleo dell'organoide e di supportare l'espansione delle strutture ventricolari e della regione15 simile alla placca corticale. Inoltre, lo slicing di organoidi cerebrali è utile anche per l'imaging dal vivo della glia radiale basale, che si trova nella zona subventricolare, consentendo la generazione di mappe decisionali del destino cellulare72. Allo stesso modo, l'imaging dal vivo è stato utilizzato per studiare organoidi cerebrali affettati coltivati all'interfaccia aria-liquido, che supporta la sopravvivenza neuronale e la crescita assonale47. Abbiamo scoperto che lo slicing di organoidi corticali umani rende anche questi modelli di organoidi particolarmente suscettibili all'elettroporazione, poiché le strutture ventricolari possono essere facilmente identificate dopo lo slicing. L'elettroporazione di organoidi corticali consente l'introduzione di plasmidi di DNA, classicamente utilizzati per la sovraespressione genica e, più recentemente, per la consegna di intere librerie di plasmidi55, e di strumenti di editing genico CRISPR/Cas9 per l'inattivazione della funzione genica26.

La tecnologia CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato lo studio della funzione genica 56,57,58,63,66. In questo protocollo, abbiamo delineato l'applicazione dei complessi ribonucleoproteici36 gRNA/Cas9 per l'inattivazione genica acuta in organoidi corticali umani. La convalida iniziale dell'efficienza del gRNA è stata eseguita in vitro, prima in provetta e poi in iPSC. Troviamo che questi semplici test iniziali aiutano la selezione di coppie di gRNA promettenti, in particolare in assenza di anticorpi funzionanti. Man mano che sempre più strumenti per il knockout genico mediato da CRISPR/Cas9 vengono caratterizzati, le fasi iniziali di convalida potrebbero essere omesse in futuro. Mentre il sequenziamento di nuova generazione di regioni di DNA mirate isolate da iPSC è più quantitativo e ha un contenuto informativo più elevato, troviamo che il sequenziamento Sanger può spesso offrire risultati molto più rapidi durante il pre-screening dei gRNA. In definitiva, la convalida dell'efficiente editing CRISPR/Cas9 negli organoidi corticali e la riduzione dei livelli proteici nelle cellule di interesse è la prova più definitiva del successo dell'ablazione genica mediata da CRISPR/Cas9.

L'elettroporazione di organoidi corticali umani affettati consente la manipolazione genetica acuta per studi di guadagno e perdita di funzione, la visualizzazione della morfologia cellulare e degli assoni neuronali, la consegna di librerie plasmidiche per approcci di screening e saggi reporter paralleli massivi, la marcatura di cellule per l'imaging dal vivo e la consegna di strumenti di editing dell'epigenoma. In quanto tale, l'elettroporazione di organoidi corticali umani affettati è un metodo potente che può rivelare intuizioni meccanicistiche sullo sviluppo corticale umano, sui disturbi dello sviluppo neurologico e sull'evoluzione corticale.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Siamo grati alle strutture del CRTD e ai partner del Dresden Concept per l'eccezionale supporto fornito, in particolare K. Neumann e il suo team presso la Stem Cell Engineering Facility, H. Hartmann e il suo team presso la Light Microscopia Facility, A. Gompf e il suo team presso la Flow Cytometry Facility e Hartmut Wolf dell'officina MPI-CBG per la costruzione delle camere di elettroporazione. Ringraziamo Joshua Schmidt per il suo feedback sul manoscritto. MA riconosce il finanziamento del Center for Regenerative Therapies TU Dresden, del DFG (Emmy Noether, AL 2231/1-1) e della Schram Foundation.

Materiali

Provette da trattato con nunclon DNA integrate Acido Ascorbico 16520100 ultra puro Camera di conteggio
Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
centrifuga in PP da 15 mL, conicheCorning430791
4D-Nucleofector Core UnitLonza
4D-Nucleofector X UnitLonza
5 mL in polistirene provetta a fondo tondo con tappo per filtro a celleCorningFalcon 352235
piastra a 6 pozzetti, ThermoFisher140675per hiPSC piastra
a 6 pozzetti per coltura, attacco ultra bassoCorning3471Per coltura di organoidi
A83-01STEMCELL Technologies72022Terreno proencefalico 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Compressore d'ariaAerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-155Anticorpo secondario, RRID: AB_2340375; diluizione 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-31572Anticorpo secondario, RRID: AB_162543; diluizione 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmolTecnologieDesign personalizzato (ordinare come 2 nmol)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA TecnologieDNA integrate10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi V3Tecnologie DNA integrate1081060100 &; g, da Streptococcus pyogenes
Amfotericina B (Fungizone)Gibco15290018Proencefalo terreno 2, 3 e 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Anticorpo primario anti-GFP (pollo, policlonale)Abcamab13970RRID: AB_300798; diluizione 1:2000
Anticorpo primario anti-PCGF4 (topo, monoclonale)Millipore05-637 RRID: AB_309865; diluizione 1:300
Microscopio fluorescente ApoTomeZeiss
Sigma Aldrich1043003Proencefalo medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-integratore (+ vitamina A)Gibco17504044Proencefalo medium 3, 4    (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Kit di cavi da banana a micrograbberApparecchio Harvard BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (macchina PCR)Analytik Jena846-2-070-723
Capillari, vetro borosilicato con filamento, OD 1,2 mm; ID 0,69 mm; 10 cm di lunghezzaScienza ProdottiBF120-69-10Deve essere tirato a spessore specifico
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Proencefalo medio 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Collagenasi di tipo IVGibco17104019
CRTDi004-AImpianto di ingegneria delle cellule staminali presso CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-ALinea hiPSC adattata a singola cellula da donatore sano
DAPIRoche102362760011 mg/mL, utilizzare 1:1000 diluito per IF
Dibutirril-cAMPSTEMCELL Technologies73884Proencefalo medio 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Forebrain medium 1, 2 e 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorfinaSTEMCELL Technologies72102Proencefalo medium 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Pinze, dritto, 11 cmFine Science Tools11295-51
ECM 830 Sistema di elettroporazione a onda quadraApparecchio Harvard BTX45-2052
EtanoloSigma Aldrich32205-1L-M
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Sigma AldrichEDS-500G
Fast GreenFCF Sigma AldrichF7252
Siero fetale bovino (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Estrattore per micropipette fiammeggiante/marroneSutter Instrument Co.P-97Per l'estrazione di microcapillari
Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a GeneiousSoftware versione 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; nucleotidi sottolineati = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Terreno del proencefalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycineSigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1questo articolo5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corrisponde alle immagini KO in Figura 3I+J)
gPCGF4 KO2questo articolo5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corrisponde al KO immagini in Figura 3I+J)
HEPESprodotto in casa1 M stock
Siero di cavallo, inattivato termicamenteGibco26050088
Proteina ricombinante GDNF umanaThermo Fisher450-10Mezzo proencefalico 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Proteina ricombinante BDNF umana/topo/rattoThermo Fisher450-02Proencefalo medio 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Acido cloridrico (HCl)Sigma Aldrich258148Per fare TrisHCl
ImmEdge (cera) PennaVettoriale LaboraoriesH-4000
Soluzione di insulina umanaSigma Aldrich  I9278Proencefalo medio 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IsopropanoloFisher ScientificBP2618-1
Siero di sostituzione knockoutGibco 10828-010Proencefalo medio 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Microscopio confocale 980 a scansione laserAgarosio Zeiss
a basso punto di fusione,Thermo Fisherper l'inclusione di hCOs durante il sezionamento del vibratomo
Matrice a membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR) Matrigel, senza LDEVCorning354230Per la coltura
di organoidiMatrice qualificata Matrigel hESC, senza LDEVCorning 354277Per coltura hiPSC
MgCl2, 1 MThermo FisherAM9530G
Microiniettore PicoPump + Interruttore a pedaleWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Microloader Puntali per pipette da 0,5 a 20 e micro; LEppendorf5242956003Per il caricamento di capillari in vetro
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850Integratore di cellule staminali
N-2 IntegratoreGibco17502048Forebrain 2 e 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Next Mastermix PCR 2x ad alta fedeltà New England BiolabsM0541S
NeubauerMarca718605
Medium neurobasaleGibco21103049Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Aminoacidi non essenzialiGibco 11140050Terreno del proencefalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Tampone duplex privo di nucleasi TecnologieDNA integrate1072570
O. C. T. CompoundTissue-Tek4583Terreno di inclusione per campione di tessuto congelato
P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
ParaformaldeideFisher ChemicalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Peel-A-Way Stampo per inclusione troncatoT12Polysciences Inc.18986-1Per l'inclusione di hCO per vibratomo e criosezione
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) Gibco15140122Forebrain medium 1, 2, 3 e 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 e per il terreno delle cellule staminali dopo nucleofeczione
Piastra di Petri 60 mm x 15 mm, senza sfiato, sterileCorningBP50-02
Piastra di Petri Camera dell'elettrodo in platino, interasse 5 mmApparecchio Harvard BTX45-0504
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)prodotta internamente
Proteinasi KSigma AldrichP2308Da Titrachium album; 10 mg/mL stock
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
Inibitore della via RHO/ROCK (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Terreno proencefalico 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Citrato di sodio diidratoSigma AldrichW302600-1KG-K
Sodio dodecil solfato (SDS)Sigma AldrichL3771
Saccarosio Vetrini di adesione Sigma AldrichS7903
SuperFrost PlusFisher Scientific10149870
SZX10 con un KL 300 LEDOlympusSZX10O stereoscopio alternativo
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284a.k.a. Octoxinol 9
Trizma baseSigma AldrichT1503Per fare TrisHCl
Trypan Blue Solution, 0,4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021Dissociazione enzmye per fare sospensioni unicellulari
Tween 20Sigma AldrichP1379a.k.a. Polisorbato 20
Sale di TyrodeSigma AldrichT2145-10x1l
Vibrante Microtomo (vibratomo)LeicaVT1200 S
Wide-Bore 1000 &; L Puntali Filtro Universali CorningTF-1005-WB-R-S
β-MercaptoetanoloGibco 21985-023Proencefalo medio 1, 3 e 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15

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