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Articolo metodologico

Dissociazione ad alto rendimento e impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario

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DOI:

10.3791/67607

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20 dicembre 2024

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1Division of Exercise Physiology, Department of Health Professions, West Virginia University School of Medicine, 2Cancer Institute, West Virginia University School of Medicine, 33Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo efficiente e non chirurgico per l'impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario nei topi. La tecnica prevede la dissociazione enzimatica del tumore seguita da un'iniezione diretta nei cuscinetti adiposi mammari, consentendo un impianto ad alto rendimento. La convalida completa garantisce la fedeltà del modello, facilitando studi rigorosi su vari sottotipi di cancro al seno.

Abstract

Gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) forniscono un metodo clinicamente rilevante per ricapitolare i tipi di cellule tumorali coinvolte e il microambiente tumorale, che è essenziale per far progredire le conoscenze sul cancro al seno (BC). Inoltre, i modelli PDX consentono lo studio degli effetti sistemici del BC, cosa che non è possibile utilizzando modelli in vitro. I metodi tradizionali per l'impianto di xenotrapianti di BC prevedono tipicamente l'anestesia e le procedure chirurgiche sterili, che richiedono molto tempo, sono invasive e limitano la scalabilità dei modelli PDX nella ricerca sul BC. Questo protocollo descrive un metodo semplice e scalabile per l'impianto ortotopico di BC PDX nei topi. Il ceppo di topo immunodeficiente NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) è stato utilizzato per l'attecchimento di PDX. I campioni di BC umano ottenuti da pazienti consenzienti all'IRB sono stati dissociati meccanicamente ed enzimaticamente, quindi risospesi in una soluzione di estratto di membrana basale (BME) e RPMI 1640. Gli animali sono stati trattenuti con la collottola e la crema depilatoria è stata applicata per rimuovere i peli dai cuscinetti adiposi al quarto capezzolo inguinale, seguita da un'iniezione. Circa 2 milioni di cellule in una sospensione da 100 μL sono state iniettate bilateralmente ortotopicamente nei cuscinetti adiposi mammari utilizzando un ago da 26 G. In particolare, non è stato richiesto alcun anestetico e il tempo totale della procedura è stato inferiore a 5 minuti, dalla preparazione delle cellule all'iniezione. Dopo un periodo di crescita di diversi mesi, i tumori sono stati asportati e processati per l'autenticazione. La convalida ha incluso la valutazione dello stato del recettore mediante immunoistochimica con anticorpi specifici per i recettori BC tradizionali (ad esempio, ER, PR, HER2). La morfologia del tumore è stata confermata con la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E), che è stata interpretata da un patologo. La somiglianza genetica con il campione del paziente è stata verificata attraverso il sequenziamento di massa dell'RNA e l'analisi della ripetizione breve in tandem (STR). Questo approccio all'attecchimento e alla convalida di PDX supporta lo sviluppo rigoroso di modelli e l'impianto di tumori ad alto rendimento, consentendo studi ben avanzati su vari sottotipi di BC.

Introduzione

Il cancro al seno (BC) viene diagnosticato in oltre 2 milioni di donne in tutto il mondo ogni anno1. Al fine di far progredire la comprensione biologica di base del BC e tradurre con successo nuove terapie in trattamenti approvati, sono necessari modelli animali preclinici che mantengano le caratteristiche distintive dei tumori dei pazienti. È stato dimostrato che gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) ricapitolano l'eterogeneità tumorale con alta fedeltà quando impiantati ortotopicamente, compresa l'istopatologia, l'espressione dei recettori e le aberrazioni genetiche 2,3,4. È importante sottolineare che conservano anche le cellule stromali che contribuiscono al microambiente del tumore, come la vascolarizzazione, le cellule immunitarie e i fibroblasti associati al cancro. Tuttavia, vengono gradualmente sostituite da cellule stromali ospiti murine conpassaggio 5. I PDX consentono anche lo studio delle complicanze sistemiche derivanti dalla crescita tumorale, come l'affaticamento 6,7, cosa che attualmente non è possibile utilizzando modelli in vitro.

Il successo dell'attecchimento di BC PDX, tuttavia, richiede un ceppo di topo immunodeficiente, con il ceppo più comunemente usato che è NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ). I topi NSG sono privi di immunità adattativa e mostrano un'immunità innata altamente difettosa8. L'attecchimento di BC PDX è stato ottenuto in altri ceppi immunodeficienti, come SCID/Beige (CB17.Cg-Prkdcscid Lystbg-J/Crl), con tassi di attecchimento simili4.

I metodi tradizionali di impianto di BC PDX prevedono l'impianto chirurgico di un frammento tumorale nel cuscinetto adiposo mammario9 e questo approccio porta a un attecchimento di successo a tassi favorevoli. Tuttavia, la necessità di procedure chirurgiche sterili e l'uso di anestetici lo rende dispendioso in termini di tempo, limitando così il numero di topi che possono essere impiantati in una certa finestra temporale. Dati i potenziali benefici predittivi delle PDX delle risposte ai farmaci nei tumori e dell'uso nella medicina di precisione10, è fondamentale disporre di un flusso di lavoro semplice e riproducibile per l'impianto omogeneo di PDX tra i topi. Questo articolo dimostra la dissociazione dei tumori mammari umani in una sospensione a singola cellula e la successiva iniezione ortotopica in cuscinetti adiposi mammari di topi immunodeficienti.

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Protocollo

Questo protocollo aderisce alle linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della West Virginia University (WVU). Per le iniezioni di cellule tumorali sono stati utilizzati topi femmina NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG), di età pari o superiore a 8 settimane e del peso di circa 25 g. Il tessuto tumorale del cancro al seno è stato prelevato presso il West Virginia University Cancer Institute (Morgantown, WV) e dalla NCI Cooperative Human Tissue Network secondo il protocollo approvato del WVU Institutional Review Board e il WVU Cancer Institute Protocol Review and Monitoring Committee. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai pazienti. Tutte le procedure sono state condotte in condizioni asettiche all'interno di una cappa di sicurezza biologica di Classe II, seguendo gli opportuni protocolli dei dispositivi di protezione individuale (DPI). I dettagli degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Dissociazione enzimatica ad alto rendimento del tessuto tumorale

  1. Scongelare e combinare gli enzimi H, R e A dal kit di dissociazione del tumore umano in un tubo C sterile. Aggiungere 200 μl di enzima H, 100 μl di enzima R e 25 μl di enzima A. Portare il volume finale a ~5 mL aggiungendo 4,7 mL di terreno sterile RPMI 1640 alla provetta C.
    NOTA: Il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco può essere utilizzato al posto di RPMI 1640.
  2. I frammenti tumorali possono essere tagliati e congelati come descritto nei protocolli esistenti9. Trasferire i frammenti tumorali scongelati e il mezzo di congelamento che li accompagna su una metà di una piastra di coltura sterile da 100 mm. Utilizzando una pinza sterile, trasferire i frammenti tumorali in una microprovetta sterile da 5 mL.
    NOTA: Un ago ipodermico sterile può essere utilizzato in alternativa al forcipe. È possibile utilizzare una piastra da 35 mm al posto di una microprovetta da 5 mL.
  3. Lavare i frammenti tumorali con 1-3 mL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS, 1x). Manipolare i frammenti nella soluzione utilizzando una pinza per garantire una rimozione completa del mezzo di congelamento residuo.
  4. Trasferire i frammenti lavati in una microprovetta da 2 ml utilizzando una pinza. Applicare 1 mL di soluzione di triplo antibiotico (TAB) sui frammenti tumorali e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Questo passaggio può essere saltato se lo si desidera. Il brodo 10x TAB può essere prodotto sciogliendo l'1% di gentamicina, l'1% di clindamicina e lo 0,5% di polimixina B solfato in 1x PBS sterile. Diluire in 1x soluzione TAB in 1x PBS sterile.
  5. Utilizzando una pinza sterile, trasferire i frammenti disinfettati in una nuova microprovetta da 5 mL. Eseguire un secondo lavaggio con 1-3 ml di PBS sterile. Trasferire i frammenti lavati nella metà asciutta della piastra di coltura da 100 mm del passaggio 1.2.
  6. Utilizzando due lame di bisturi sterili n. 10, tritare accuratamente il tessuto tumorale. Trasferire i frammenti tumorali tritati su una lama e depositarli nella provetta C contenente la soluzione enzimatica preparata. Fissare saldamente il coperchio del tubo fino a quando non si avverte uno scatto finale.
  7. Capovolgere più volte il tubo C per garantire una distribuzione uniforme dei frammenti tumorali all'interno della soluzione enzimatica.
  8. Posizionare il tubo C nel dissociatore meccanico. Capovolgere il tubo e assicurarsi che tutto il contenuto sia immerso nel fluido. Il tubo sarà in posizione invertita nella macchina.
    1. Fissare il tubo in una fessura con la parte rientrante rivolta verso l'operatore. Se applicabile, posizionare il riscaldatore attorno al tubo.
  9. Seleziona il programma 37C_h_TDK_3 dall'interfaccia touchscreen. Questo programma funziona per 60 minuti a 37 °C. Per i tumori più morbidi, è possibile utilizzare 37C_h_TDK_1 o 2.
    NOTA: Per la massima efficienza, si raccomanda di preparare i topi per l'iniezione durante questo periodo di dissociazione applicando una crema depilatoria sui siti di iniezione.
  10. Al termine del programma di dissociazione, ispezionare il contenuto del tubo. Non dovrebbero rimanere frammenti tumorali visibili.
    NOTA: Se sono presenti frammenti, potrebbe essere necessario un tempo di dissociazione aggiuntivo. In questi casi, eseguire il programma per altri 20-30 minuti.
  11. Una volta ottenuta un'adeguata dissociazione, centrifugare la provetta C a 200 x g per 5-8 minuti a 4 °C per pellettare le cellule dissociate. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando l'aspirazione a vuoto o una pipetta.
  12. Risospendere il pellet cellulare in 5-10 mL di terreno RPMI fresco. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL per facilitarne la manipolazione. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5-8 minuti a 4 °C. Aspirare con cura il surnatante.
    NOTA: Questo passaggio può essere omesso se il pellet della cella è piccolo. In questi casi, le cellule vengono risospese direttamente nel volume desiderato di terreno e quindi combinate con l'estratto della membrana basale (Matrigel) per ridurre al minimo la perdita cellulare.
  13. Risospendere il pellet di cella in un volume di RPMI 1640, equivalente alla metà del volume di iniezione finale desiderato. RPMI 1640 e Matrigel saranno combinati in un rapporto 1:1 v/v, con un volume di iniezione finale di 100 μl per sito di iniezione.
    NOTA: Per l'iniezione bilaterale in 4 topi, il volume totale richiesto è di 800 μL. Pertanto, risospendere le cellule in almeno 400 μL di RPMI 1640. Per tenere conto della potenziale perdita di volume, è consigliabile aggiungere un ulteriore 20% al volume finale, mantenendo il rapporto v/v di 1:1. In alternativa, è possibile utilizzare DMEM o 1x PBS al posto di RPMI 1640.
  14. Contare le cellule risospese utilizzando un emocitometro o un metodo automatizzato. Diluire secondo necessità per ottenere la concentrazione desiderata per l'iniezione. Si suggerisce un punto di partenza di circa 1-2 milioni di cellule per sito di iniezione.
  15. In una provetta per microcentrifuga a fondo tondo da 2 mL, combinare la quantità desiderata di sospensione cellulare diluita in RPMI con un volume uguale di Matrigel. Miscelare delicatamente la sospensione mediante pipettaggio ripetuto per garantire l'omogeneità.
    NOTA: Dopo il passaggio precedente, aggiungere 400 μl di sospensione cellulare diluita a 400 μl di Matrigel. Considerare il numero di aghi per iniezione da utilizzare e tenere conto delle perdite di volume associate. Tieni Matrigel sempre sul ghiaccio. Non scongelarlo fino a quando le cellule non sono ririsospese, poiché si solidificherà rapidamente. Si consiglia di mantenere piccole aliquote (ad es. 120 μL) per uno scongelamento rapido e la combinazione in provette da 2 mL.
  16. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio fino al momento dell'iniezione.

2. Iniezione ortotopica di cuscinetto adiposo mammario inguinale di PDX dissociato

  1. Determinare la massa di ciascun mouse utilizzando una bilancia calibrata. Applicare uno strato sottile di crema depilatoria sul sito o sui siti di iniezione target. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, massaggiare la crema con movimenti alternati in senso orario e antiorario per facilitare la rapida rimozione del pelo.
    1. Rimuovere il pelo in eccesso e la crema depilatoria utilizzando una spugna di garza sterile imbevuta di soluzione salina. Garantire la depilazione completa nell'area di iniezione.
      NOTA: Non superare i 60 s di esposizione alla crema depilatoria per prevenire irritazioni cutanee. I topi possono essere rasati prima dell'applicazione della crema depilatoria per ridurre ulteriormente il tempo di esposizione. Questo passaggio può essere eseguito durante la dissociazione tumorale per ottimizzare l'efficienza del tempo e ridurre al minimo la durata della conservazione della sospensione cellulare sul ghiaccio.
  2. Condurre un'ispezione visiva approfondita di ciascun topo per valutare l'idoneità all'iniezione. Valutare eventuali segni di dolore, angoscia, malattia o altre controindicazioni.
  3. Utilizzando una siringa da 1 mL senza ago inserito, aspirare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per garantire l'omogeneità. Collegare un ago da 26 G alla siringa da 1 mL e prelevare il volume di iniezione desiderato. Eliminare eventuali bolle d'aria dalla siringa picchiettando o muovendo delicatamente.
    NOTA: Si raccomanda di non superare i 600 μl per siringa per facilitare l'iniezione con una sola mano.
  4. Posizionare la siringa preparata orizzontalmente sopra il contenitore del ghiaccio, con l'ago orientato lontano dall'operatore. Posizionare il contenitore del ghiaccio e l'ago sullo stesso lato della mano dominante dell'operatore o della mano preferita per l'iniezione. Estrarre il mouse dal suo alloggiamento e disinfettare l'area di iniezione utilizzando un tampone detergente imbevuto di alcol.
  5. Trattenere saldamente il topo afferrando saldamente la pelle dorsale sulla nuca e sulla schiena. Garantire un'immobilizzazione sufficiente per esporre chiaramente i cuscinetti adiposi mammari. Il cuscinetto adiposo mammario inguinale si estende dal capezzolo alla parte superiore dell'anca. Può essere osservato come tessuto morbido e rosato nell'area descritta sotto la pelle.
    NOTA: Un assistente operatore può utilizzare una pinza a lato piatto per pizzicare ed elevare la pelle contenente il cuscinetto adiposo. Questa tecnica aiuta a garantire che l'operatore che esegue l'iniezione miri correttamente al cuscinetto adiposo.
  6. Posiziona il mouse in posizione supina. Inserire l'ago (smussato verso l'alto) con un angolo di 45 gradi, puntando verso l'anca a circa 0,5-1 cm caudale rispetto al cuscinetto adiposo, regolando la lunghezza dell'ago.
    1. Far avanzare l'ago nel cuscinetto adiposo. In modo controllato, iniettare il volume desiderato di sospensione cellulare. L'efficiente velocità di iniezione aiuterà a ridurre al minimo l'agitazione degli animali dovuta a una contenzione prolungata.
      NOTA: Per ridurre al minimo il disagio degli animali, la durata massima del sistema di ritenuta manuale continuo non deve superare i 30 s. Se la durata della ritenuta supera i 30 s, l'animale deve essere rilasciato nella gabbia per riprendersi prima di un secondo tentativo.
  7. Dopo l'iniezione, ruotare l'ago di 180 gradi (smussato verso il basso). Mantenere brevemente la posizione dell'ago prima di un lento prelievo per ridurre al minimo la perdita di cellule dal sito di iniezione. In caso di sanguinamento, applicare una garza standard o una garza emostatica, se necessario.
  8. Ripetere i passaggi 2.6 e 2.7 per il cuscinetto adiposo controlaterale se sono necessarie iniezioni bilaterali. Per più animali, ripetere i passaggi 2.2-2.7 secondo necessità.

3. Procedure di follow-up

  1. Smaltire tutti gli oggetti taglienti negli appositi contenitori per oggetti taglienti. Smaltire tutto il resto del contenuto in appositi contenitori per rifiuti.
  2. Se si verifica sanguinamento durante l'iniezione, monitorare i topi per almeno 1 ora dopo per garantire l'emostasi.
  3. Monitorare la massa corporea su base settimanale. Valutare il volume del tumore una volta che la crescita diventa palpabile.

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Risultati

Questo studio delinea un approccio efficiente e non chirurgico per l'impianto ortotopico di xenotrapianti di carcinoma mammario derivati da pazienti nei topi. Il tessuto tumorale della mammella è stato dissociato utilizzando enzimi specifici per l'uomo e agitazione meccanica, risospeso in un rapporto 1:1 v/v di Matrigel: RPMI 1640 e iniettato ortotopicamente nei cuscinetti adiposi mammari inguinali di topi NSG (Figura 1 e Figura 2...

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Discussione

Questo articolo presenta un metodo efficiente e ad alto rendimento per l'impianto ortotopico di BC PDX nei cuscinetti adiposi mammari inguinali di topi immunodeficienti. Questo flusso di lavoro ottimizzato consente al singolo ricercatore di impiantare PDX in dozzine di topi al giorno, supportando studi su larga scala e adeguatamente alimentati. La capacità di dissociare e impiantare simultaneamente più PDX unici consente anche approcci oncologici di precisione. Oltre all'efficienza tempo...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Vorremmo riconoscere i generosi contributi dei pazienti che hanno fornito campioni tumorali per lo sviluppo dei PDX. Emidio Pistilli riconosce i significativi contributi precedenti di Hannah Wilson, MD/PhD. Questa ricerca è stata supportata dalle seguenti organizzazioni: National Institutes of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) con il numero di premio R01AR079445 (Pistilli); la WVU Genomics Core Facility (U54GM104942); la WVU Animal Model and Imaging Facility (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); National Institutes of General Medical Sciences con il numero di premio P20GM121322 (Lockman). La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 mL siringa per tubercolinaBD305945sterile
1x soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4Gibco10010023sterile
2,0 mL provetta per microcentrifuga a fondo tondoEppendorf0030123620
sterile ago da 26 G, ½ in.BD305111
microprovetta sterile da 5,0 mLEppendorf0030119401
sterile NSG di 8+ settimane (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) topiThe Jackson Laboratory#005557
Tamponi per la preparazione dell'alcolFisher Scientific22-363-750sterile
Estratto di membrana basale (Matrigel)Cultrex3632-005-02
Applicatori con punta in cotone, 6 in.Fisher Scientific22-029-553
pinza curva sterile con punte medie non seghettate, microscopia elettronica da 152 mmSciences50-365-845crema
depilatoriaNair
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo dissociatore con riscaldatoriMiltenyi Biotec130-096-427
N. 10 lame per bisturiFisher Scientific12-000-162
spugne di garza sterili in tessuto non tessuto, 4x4 polliciFisher Scientific22-028-558sterile
RPMI 1640 1x + L-GlutamminaGibco11875093sterile
Kit di dissociazione tumorale, umanoMiltenyi Biotec130-095-929
sterile

Riferimenti

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  13. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: Genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 1 (1), 7533(2017).
  14. Amens, J. N., Bahçecioglu, G., Zorlutuna, P. Immune system effects on breast cancer. Cell Mol Bioeng. 14 (4), 279-292 (2021).

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