Dissociazione ad alto rendimento e impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo efficiente e non chirurgico per l'impianto ortotopico di xenotrapianti derivati da pazienti con carcinoma mammario nei topi. La tecnica prevede la dissociazione enzimatica del tumore seguita da un'iniezione diretta nei cuscinetti adiposi mammari, consentendo un impianto ad alto rendimento. La convalida completa garantisce la fedeltà del modello, facilitando studi rigorosi su vari sottotipi di cancro al seno.

Abstract

Gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) forniscono un metodo clinicamente rilevante per ricapitolare i tipi di cellule tumorali coinvolte e il microambiente tumorale, che è essenziale per far progredire le conoscenze sul cancro al seno (BC). Inoltre, i modelli PDX consentono lo studio degli effetti sistemici del BC, cosa che non è possibile utilizzando modelli in vitro. I metodi tradizionali per l'impianto di xenotrapianti di BC prevedono tipicamente l'anestesia e le procedure chirurgiche sterili, che richiedono molto tempo, sono invasive e limitano la scalabilità dei modelli PDX nella ricerca sul BC. Questo protocollo descrive un metodo semplice e scalabile per l'impianto ortotopico di BC PDX nei topi. Il ceppo di topo immunodeficiente NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) è stato utilizzato per l'attecchimento di PDX. I campioni di BC umano ottenuti da pazienti consenzienti all'IRB sono stati dissociati meccanicamente ed enzimaticamente, quindi risospesi in una soluzione di estratto di membrana basale (BME) e RPMI 1640. Gli animali sono stati trattenuti con la collottola e la crema depilatoria è stata applicata per rimuovere i peli dai cuscinetti adiposi al quarto capezzolo inguinale, seguita da un'iniezione. Circa 2 milioni di cellule in una sospensione da 100 μL sono state iniettate bilateralmente ortotopicamente nei cuscinetti adiposi mammari utilizzando un ago da 26 G. In particolare, non è stato richiesto alcun anestetico e il tempo totale della procedura è stato inferiore a 5 minuti, dalla preparazione delle cellule all'iniezione. Dopo un periodo di crescita di diversi mesi, i tumori sono stati asportati e processati per l'autenticazione. La convalida ha incluso la valutazione dello stato del recettore mediante immunoistochimica con anticorpi specifici per i recettori BC tradizionali (ad esempio, ER, PR, HER2). La morfologia del tumore è stata confermata con la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E), che è stata interpretata da un patologo. La somiglianza genetica con il campione del paziente è stata verificata attraverso il sequenziamento di massa dell'RNA e l'analisi della ripetizione breve in tandem (STR). Questo approccio all'attecchimento e alla convalida di PDX supporta lo sviluppo rigoroso di modelli e l'impianto di tumori ad alto rendimento, consentendo studi ben avanzati su vari sottotipi di BC.

Introduzione

Il cancro al seno (BC) viene diagnosticato in oltre 2 milioni di donne in tutto il mondo ogni anno¹. Al fine di far progredire la comprensione biologica di base del BC e tradurre con successo nuove terapie in trattamenti approvati, sono necessari modelli animali preclinici che mantengano le caratteristiche distintive dei tumori dei pazienti. È stato dimostrato che gli xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) ricapitolano l'eterogeneità tumorale con alta fedeltà quando impiantati ortotopicamente, compresa l'istopatologia, l'espressione dei recettori e le aberrazioni genetiche ^2,3,4. È importante sottolineare che conservano anche le cellule stromali che contribuiscono al microambiente del tumore, come la vascolarizzazione, le cellule immunitarie e i fibroblasti associati al cancro. Tuttavia, vengono gradualmente sostituite da cellule stromali ospiti murine con^{passaggio 5}. I PDX consentono anche lo studio delle complicanze sistemiche derivanti dalla crescita tumorale, come l'affaticamento ^6,7, cosa che attualmente non è possibile utilizzando modelli in vitro.

Il successo dell'attecchimento di BC PDX, tuttavia, richiede un ceppo di topo immunodeficiente, con il ceppo più comunemente usato che è NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ). I topi NSG sono privi di immunità adattativa e mostrano un'immunità innata altamente difettosa⁸. L'attecchimento di BC PDX è stato ottenuto in altri ceppi immunodeficienti, come SCID/Beige (CB17.Cg-Prkdc^{scid Lystbg-J}/Crl), con tassi di attecchimento simili⁴.

I metodi tradizionali di impianto di BC PDX prevedono l'impianto chirurgico di un frammento tumorale nel cuscinetto adiposo mammario⁹ e questo approccio porta a un attecchimento di successo a tassi favorevoli. Tuttavia, la necessità di procedure chirurgiche sterili e l'uso di anestetici lo rende dispendioso in termini di tempo, limitando così il numero di topi che possono essere impiantati in una certa finestra temporale. Dati i potenziali benefici predittivi delle PDX delle risposte ai farmaci nei tumori e dell'uso nella medicina di precisione¹⁰, è fondamentale disporre di un flusso di lavoro semplice e riproducibile per l'impianto omogeneo di PDX tra i topi. Questo articolo dimostra la dissociazione dei tumori mammari umani in una sospensione a singola cellula e la successiva iniezione ortotopica in cuscinetti adiposi mammari di topi immunodeficienti.

Protocollo

Questo protocollo aderisce alle linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della West Virginia University (WVU). Per le iniezioni di cellule tumorali sono stati utilizzati topi femmina NOD.Cg-Prkdc^{scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG), di età pari o superiore a 8 settimane e del peso di circa 25 g. Il tessuto tumorale del cancro al seno è stato prelevato presso il West Virginia University Cancer Institute (Morgantown, WV) e dalla NCI Cooperative Human Tissue Network secondo il protocollo approvato del WVU Institutional Review Board e il WVU Cancer Institute Protocol Review and Monitoring Committee. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai pazienti. Tutte le procedure sono state condotte in condizioni asettiche all'interno di una cappa di sicurezza biologica di Classe II, seguendo gli opportuni protocolli dei dispositivi di protezione individuale (DPI). I dettagli degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Dissociazione enzimatica ad alto rendimento del tessuto tumorale

1. Scongelare e combinare gli enzimi H, R e A dal kit di dissociazione del tumore umano in un tubo C sterile. Aggiungere 200 μl di enzima H, 100 μl di enzima R e 25 μl di enzima A. Portare il volume finale a ~5 mL aggiungendo 4,7 mL di terreno sterile RPMI 1640 alla provetta C.
   NOTA: Il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco può essere utilizzato al posto di RPMI 1640.
2. I frammenti tumorali possono essere tagliati e congelati come descritto nei protocolli esistenti⁹. Trasferire i frammenti tumorali scongelati e il mezzo di congelamento che li accompagna su una metà di una piastra di coltura sterile da 100 mm. Utilizzando una pinza sterile, trasferire i frammenti tumorali in una microprovetta sterile da 5 mL.
   NOTA: Un ago ipodermico sterile può essere utilizzato in alternativa al forcipe. È possibile utilizzare una piastra da 35 mm al posto di una microprovetta da 5 mL.
3. Lavare i frammenti tumorali con 1-3 mL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS, 1x). Manipolare i frammenti nella soluzione utilizzando una pinza per garantire una rimozione completa del mezzo di congelamento residuo.
4. Trasferire i frammenti lavati in una microprovetta da 2 ml utilizzando una pinza. Applicare 1 mL di soluzione di triplo antibiotico (TAB) sui frammenti tumorali e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Questo passaggio può essere saltato se lo si desidera. Il brodo 10x TAB può essere prodotto sciogliendo l'1% di gentamicina, l'1% di clindamicina e lo 0,5% di polimixina B solfato in 1x PBS sterile. Diluire in 1x soluzione TAB in 1x PBS sterile.
5. Utilizzando una pinza sterile, trasferire i frammenti disinfettati in una nuova microprovetta da 5 mL. Eseguire un secondo lavaggio con 1-3 ml di PBS sterile. Trasferire i frammenti lavati nella metà asciutta della piastra di coltura da 100 mm del passaggio 1.2.
6. Utilizzando due lame di bisturi sterili n. 10, tritare accuratamente il tessuto tumorale. Trasferire i frammenti tumorali tritati su una lama e depositarli nella provetta C contenente la soluzione enzimatica preparata. Fissare saldamente il coperchio del tubo fino a quando non si avverte uno scatto finale.
7. Capovolgere più volte il tubo C per garantire una distribuzione uniforme dei frammenti tumorali all'interno della soluzione enzimatica.
8. Posizionare il tubo C nel dissociatore meccanico. Capovolgere il tubo e assicurarsi che tutto il contenuto sia immerso nel fluido. Il tubo sarà in posizione invertita nella macchina.
   1. Fissare il tubo in una fessura con la parte rientrante rivolta verso l'operatore. Se applicabile, posizionare il riscaldatore attorno al tubo.
9. Seleziona il programma 37C_h_TDK_3 dall'interfaccia touchscreen. Questo programma funziona per 60 minuti a 37 °C. Per i tumori più morbidi, è possibile utilizzare 37C_h_TDK_1 o 2.
   NOTA: Per la massima efficienza, si raccomanda di preparare i topi per l'iniezione durante questo periodo di dissociazione applicando una crema depilatoria sui siti di iniezione.
10. Al termine del programma di dissociazione, ispezionare il contenuto del tubo. Non dovrebbero rimanere frammenti tumorali visibili.
    NOTA: Se sono presenti frammenti, potrebbe essere necessario un tempo di dissociazione aggiuntivo. In questi casi, eseguire il programma per altri 20-30 minuti.
11. Una volta ottenuta un'adeguata dissociazione, centrifugare la provetta C a 200 x g per 5-8 minuti a 4 °C per pellettare le cellule dissociate. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando l'aspirazione a vuoto o una pipetta.
12. Risospendere il pellet cellulare in 5-10 mL di terreno RPMI fresco. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL per facilitarne la manipolazione. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5-8 minuti a 4 °C. Aspirare con cura il surnatante.
    NOTA: Questo passaggio può essere omesso se il pellet della cella è piccolo. In questi casi, le cellule vengono risospese direttamente nel volume desiderato di terreno e quindi combinate con l'estratto della membrana basale (Matrigel) per ridurre al minimo la perdita cellulare.
13. Risospendere il pellet di cella in un volume di RPMI 1640, equivalente alla metà del volume di iniezione finale desiderato. RPMI 1640 e Matrigel saranno combinati in un rapporto 1:1 v/v, con un volume di iniezione finale di 100 μl per sito di iniezione.
    NOTA: Per l'iniezione bilaterale in 4 topi, il volume totale richiesto è di 800 μL. Pertanto, risospendere le cellule in almeno 400 μL di RPMI 1640. Per tenere conto della potenziale perdita di volume, è consigliabile aggiungere un ulteriore 20% al volume finale, mantenendo il rapporto v/v di 1:1. In alternativa, è possibile utilizzare DMEM o 1x PBS al posto di RPMI 1640.
14. Contare le cellule risospese utilizzando un emocitometro o un metodo automatizzato. Diluire secondo necessità per ottenere la concentrazione desiderata per l'iniezione. Si suggerisce un punto di partenza di circa 1-2 milioni di cellule per sito di iniezione.
15. In una provetta per microcentrifuga a fondo tondo da 2 mL, combinare la quantità desiderata di sospensione cellulare diluita in RPMI con un volume uguale di Matrigel. Miscelare delicatamente la sospensione mediante pipettaggio ripetuto per garantire l'omogeneità.
    NOTA: Dopo il passaggio precedente, aggiungere 400 μl di sospensione cellulare diluita a 400 μl di Matrigel. Considerare il numero di aghi per iniezione da utilizzare e tenere conto delle perdite di volume associate. Tieni Matrigel sempre sul ghiaccio. Non scongelarlo fino a quando le cellule non sono ririsospese, poiché si solidificherà rapidamente. Si consiglia di mantenere piccole aliquote (ad es. 120 μL) per uno scongelamento rapido e la combinazione in provette da 2 mL.
16. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio fino al momento dell'iniezione.

2. Iniezione ortotopica di cuscinetto adiposo mammario inguinale di PDX dissociato

1. Determinare la massa di ciascun mouse utilizzando una bilancia calibrata. Applicare uno strato sottile di crema depilatoria sul sito o sui siti di iniezione target. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, massaggiare la crema con movimenti alternati in senso orario e antiorario per facilitare la rapida rimozione del pelo.
   1. Rimuovere il pelo in eccesso e la crema depilatoria utilizzando una spugna di garza sterile imbevuta di soluzione salina. Garantire la depilazione completa nell'area di iniezione.
      NOTA: Non superare i 60 s di esposizione alla crema depilatoria per prevenire irritazioni cutanee. I topi possono essere rasati prima dell'applicazione della crema depilatoria per ridurre ulteriormente il tempo di esposizione. Questo passaggio può essere eseguito durante la dissociazione tumorale per ottimizzare l'efficienza del tempo e ridurre al minimo la durata della conservazione della sospensione cellulare sul ghiaccio.
2. Condurre un'ispezione visiva approfondita di ciascun topo per valutare l'idoneità all'iniezione. Valutare eventuali segni di dolore, angoscia, malattia o altre controindicazioni.
3. Utilizzando una siringa da 1 mL senza ago inserito, aspirare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per garantire l'omogeneità. Collegare un ago da 26 G alla siringa da 1 mL e prelevare il volume di iniezione desiderato. Eliminare eventuali bolle d'aria dalla siringa picchiettando o muovendo delicatamente.
   NOTA: Si raccomanda di non superare i 600 μl per siringa per facilitare l'iniezione con una sola mano.
4. Posizionare la siringa preparata orizzontalmente sopra il contenitore del ghiaccio, con l'ago orientato lontano dall'operatore. Posizionare il contenitore del ghiaccio e l'ago sullo stesso lato della mano dominante dell'operatore o della mano preferita per l'iniezione. Estrarre il mouse dal suo alloggiamento e disinfettare l'area di iniezione utilizzando un tampone detergente imbevuto di alcol.
5. Trattenere saldamente il topo afferrando saldamente la pelle dorsale sulla nuca e sulla schiena. Garantire un'immobilizzazione sufficiente per esporre chiaramente i cuscinetti adiposi mammari. Il cuscinetto adiposo mammario inguinale si estende dal capezzolo alla parte superiore dell'anca. Può essere osservato come tessuto morbido e rosato nell'area descritta sotto la pelle.
   NOTA: Un assistente operatore può utilizzare una pinza a lato piatto per pizzicare ed elevare la pelle contenente il cuscinetto adiposo. Questa tecnica aiuta a garantire che l'operatore che esegue l'iniezione miri correttamente al cuscinetto adiposo.
6. Posiziona il mouse in posizione supina. Inserire l'ago (smussato verso l'alto) con un angolo di 45 gradi, puntando verso l'anca a circa 0,5-1 cm caudale rispetto al cuscinetto adiposo, regolando la lunghezza dell'ago.
   1. Far avanzare l'ago nel cuscinetto adiposo. In modo controllato, iniettare il volume desiderato di sospensione cellulare. L'efficiente velocità di iniezione aiuterà a ridurre al minimo l'agitazione degli animali dovuta a una contenzione prolungata.
      NOTA: Per ridurre al minimo il disagio degli animali, la durata massima del sistema di ritenuta manuale continuo non deve superare i 30 s. Se la durata della ritenuta supera i 30 s, l'animale deve essere rilasciato nella gabbia per riprendersi prima di un secondo tentativo.
7. Dopo l'iniezione, ruotare l'ago di 180 gradi (smussato verso il basso). Mantenere brevemente la posizione dell'ago prima di un lento prelievo per ridurre al minimo la perdita di cellule dal sito di iniezione. In caso di sanguinamento, applicare una garza standard o una garza emostatica, se necessario.
8. Ripetere i passaggi 2.6 e 2.7 per il cuscinetto adiposo controlaterale se sono necessarie iniezioni bilaterali. Per più animali, ripetere i passaggi 2.2-2.7 secondo necessità.

3. Procedure di follow-up

1. Smaltire tutti gli oggetti taglienti negli appositi contenitori per oggetti taglienti. Smaltire tutto il resto del contenuto in appositi contenitori per rifiuti.
2. Se si verifica sanguinamento durante l'iniezione, monitorare i topi per almeno 1 ora dopo per garantire l'emostasi.
3. Monitorare la massa corporea su base settimanale. Valutare il volume del tumore una volta che la crescita diventa palpabile.

Risultati

Questo studio delinea un approccio efficiente e non chirurgico per l'impianto ortotopico di xenotrapianti di carcinoma mammario derivati da pazienti nei topi. Il tessuto tumorale della mammella è stato dissociato utilizzando enzimi specifici per l'uomo e agitazione meccanica, risospeso in un rapporto 1:1 v/v di Matrigel: RPMI 1640 e iniettato ortotopicamente nei cuscinetti adiposi mammari inguinali di topi NSG (Figura 1 e Figura 2). Per garantire la fedeltà dei modelli PDX, la concordanza del campione tumorale originale del paziente con i tumori passati è stata validata con tecniche istopatologiche e genomiche consolidate. L'espressione del recettore è stata profilata utilizzando la colorazione immunoistochimica (IHC) dei recettori standard del cancro al seno, tra cui il recettore degli estrogeni (ER), il recettore del progesterone (PR) e il recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2) (Figura 3). La morfologia cellulare è stata valutata utilizzando la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) delle sezioni tumorali sezionate e l'interpretazione esperta del patologo delle sezioni colorate. La conservazione del paesaggio genetico e la conservazione delle cellule umane sono state convalidate utilizzando il sequenziamento di massa dell'RNA e l'autenticazione a ripetizione tandem corta (STR) (Figura 4 e Tabella 1). Inoltre, i test patogeni non hanno identificato alcuna contaminazione del paziente o campioni tumorali passati, che è una fase di verifica essenziale dato l'uso di topi immunodeficienti.

Figura 1: Panoramica del protocollo. Rappresentazione della dissociazione tumorale e del flusso di lavoro dell'iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I topi NSG sono stati preparati per l'iniezione utilizzando una crema depilatoria applicata con movimenti alternati in senso orario e antiorario per rimuovere completamente il pelo dall'area del cuscinetto adiposo mammario inguinale (Figura 2A). La crema depilatoria in eccesso è stata rimossa dalla pelle addominale esposta utilizzando una garza sterile e l'area è stata disinfettata con un tampone imbevuto di alcol (Figura 2B). Un ago sterile caricato con cellule tumorali dissociate è stato posizionato con un angolo di circa 45 gradi di 0,5-1 mm caudale rispetto ai cuscinetti adiposi mammari del quarto capezzolo inguinale (Figura 2C). Le cellule tumorali sono state iniettate in modo controllato nei cuscinetti adiposi mammari del quarto capezzolo inguinale (Figura 2D). La crescita del tumore è stata inizialmente rilevata dalla palpazione digitale dei cuscinetti adiposi. Successivamente, la progressione del volume tumorale è stata monitorata quantitativamente utilizzando la risonanza magnetica (MRI) (Figura 2E). Sia il peso corporeo (Figura 2F) che i volumi tumorali (Figura 2G) sono stati misurati settimanalmente per monitorare le fluttuazioni di peso e la progressione dei volumi tumorali. I tumori sono stati ispezionati visivamente per monitorare la presenza di ferite come l'ulcerazione che avrebbero richiesto un'interruzione prematura. Il successo dell'attecchimento bilaterale della PDX nei cuscinetti adiposi mammari inguinali è mostrato nella Figura 2H, mentre i cuscinetti adiposi dopo l'escissione dei tumori sono mostrati nella Figura 2I.

Figura 2: Preparazione dei topi, iniezione di PDX e monitoraggio della progressione del tumore. (A) I cuscinetti adiposi mammari sono stati accuratamente depilati. (B) Presentazione del sito di iniezione con chiara visibilità delle aree di iniezione target. (C) Posizione della siringa sul cuscinetto adiposo, in genere 0,5-1 mm da caudale a cuscinetto adiposo a seconda della lunghezza dell'ago. La freccia bianca indica l'area di destinazione per l'ago durante l'inserimento. (D) Rappresentazione dell'iniezione di cellule dissociate nel cuscinetto adiposo mammario del quarto capezzolo inguinale sinistro. L'ago deve essere tenuto con un angolo di circa 45 gradi, come mostrato per l'iniezione. (E) Immagine RM rappresentativa di tumori trapiantati bilateralmente nel sito di iniezione. I tumori sono evidenziati in verde. (F) Progressione rappresentativa del peso corporeo in grammi dopo l'iniezione di cellule tumorali (n = 5). La linea blu scuro rappresenta la regressione lineare semplice, che è significativamente diversa da zero (p < 0,0001); I topi hanno guadagnato, in media, 22 mg^.giorno-1. L'ombreggiatura blu scuro è un intervallo di confidenza del 95%, l'ombreggiatura blu chiaro è un intervallo di previsione del 95% e le linee arancioni sono misure longitudinali del peso corporeo. (G) Progressione rappresentativa dei volumi tumorali individuali in mm³ dopo l'iniezione di cellule tumorali (n = 10). La linea blu scuro rappresenta la regressione esponenziale; Il tempo di raddoppio del volume tumorale è stato di 19,08 giorni. L'ombreggiatura blu scuro è un intervallo di confidenza del 95%, l'ombreggiatura blu chiaro è un intervallo di previsione del 95% e le linee arancioni sono i volumi tumorali longitudinali. (H) Attecchimento bilaterale riuscito di cellule PDX nei cuscinetti adiposi mammari inguinali. Si noti che la vascolarizzazione può essere vista rifornire ogni tumore. Le frecce bianche identificano i tumori. (I) L'area del cuscinetto adiposo mammario inguinale dopo l'escissione dei tumori. (H,I) Le unità sul righello sono in cm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il PDX rappresentativo (PEN_056) ha avuto origine da una donna caucasica di 31 anni con carcinoma mammario invasivo in stadio 3A. Il tumore primario, prelevato dalla mammella destra, aveva uno stato recettoriale di ER e PR negativo, HER2 positivo (ER-PR-HER2+). La colorazione IHC per i recettori ER, PR e HER2 ha mostrato concordanza tra il paziente e i tumori PDX (Figura 3). Tuttavia, la PDX mostra una maggiore espressione di HER2, che può essere dovuta a una crescita selettiva delle cellule HER2+. La valutazione patologica delle sezioni colorate con H&E ha confermato un carcinoma scarsamente differenziato con morfologia e citologia coerenti sia nel paziente che nei campioni PDX (Figura 3).

Figura 3: Recettore IHC e colorazione H&E. (Colonna di sinistra) Colorazione IHC dei recettori ER, PR e HER2 e colorazione H&E nel tumore del paziente. Le colorazioni ER e PR non mostrano evidenti colorazioni positive, come previsto. Le colorazioni HER2 mostrano positività per HER2 (marrone). (Colonna di destra) Colorazione IHC dei recettori ER, PR e HER2 e colorazione H&E nel campione PDX passato. La colorazione del recettore assomiglia molto a quella osservata nel campione del paziente, sebbene HER2 mostri una maggiore espressione dopo il passaggio. Barra di scala: 50 μm; ingrandimento: 20x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La genotipizzazione con ripetizione tandem corta (STR) ha confermato una somiglianza dell'>80% tra i 13 loci autosomici definiti dalle linee guida di consenso ASN-0002-2022 dell'American Type Cell Culture Collection (ATCC) più 3 loci aggiuntivi (Tabella 1). Il sequenziamento di massa dell'RNA (RNA-seq) del campione tumorale del paziente e la PDX hanno confermato livelli equivalenti di allineamento all'ultimo genoma umano di riferimento (T2T CHM13v2.0), con l'82,3% e il 79,1% delle reads allineate, rispettivamente. Inoltre, il tumore del paziente e la PDX hanno mostrato una forte correlazione positiva con un valore di Pearson r di 0,9559 (Figura 4A). L'analisi dell'arricchimento del set genico che ha confrontato PDX con il tumore del paziente ha rivelato che i primi 10 percorsi significativamente arricchiti dai processi biologici dell'ontologia genica erano prevalentemente set di geni immunologici, suggerendo che la maggior parte della varianza trascrizionale tra PDX e tumore del paziente deriva dalla mancanza di cellule immunitarie nel campione di PDX (Figura 4B).

	D5S818	D13S317	D7S820	VWA	TH01	SONO	Acciaio TPOX	CSF1PO	D3S1358	D21S11	D18S51	Penta_E	Penta_D	D8S1179	FGA
Tumore del paziente	12 13	8 8	8 9	17 17	9 9.3	X X	8 10		15 16	29 31.2	16 19	12 13	14 14	10 14	21 25
Tumore PDX	13 14	8 8	8 9	17 17	9 9.3	X X	10 10		15 15	29 29	16 19	12 13	14 14	10 14	21 25

Tabella 1: Autenticazione a ripetizione tandem breve (STR).

Figura 4: Correlazione tra sequenziamento dell'RNA e arricchimento del set genico. (A) Grafico a dispersione che visualizza i conteggi normalizzati log2 per milione (CPM) per tutti i geni del tumore del paziente (asse x) e PDX (asse y). È stata trovata una forte correlazione positiva, con un valore di Pearson r di 0,9559. (B) Grafici di cresta per i primi 10 set di geni del processo biologico dell'ontologia genica arricchita quando si confrontano PDX vs. tumore del paziente. Le curve rappresentano la distribuzione del punteggio di arricchimento per ciascun set di geni; il colore rappresenta il valore q FDR per ogni set di geni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo articolo presenta un metodo efficiente e ad alto rendimento per l'impianto ortotopico di BC PDX nei cuscinetti adiposi mammari inguinali di topi immunodeficienti. Questo flusso di lavoro ottimizzato consente al singolo ricercatore di impiantare PDX in dozzine di topi al giorno, supportando studi su larga scala e adeguatamente alimentati. La capacità di dissociare e impiantare simultaneamente più PDX unici consente anche approcci oncologici di precisione. Oltre all'efficienza temporale, la dissociazione dei tumori crea una sospensione omogenea di tipi di cellule che viene distribuita uniformemente tra i topi. Nella nostra esperienza, questa omogeneità contribuisce a costanti tassi di attecchimento e di crescita del tumore.

Sebbene generalmente efficace, questo protocollo può richiedere modifiche in determinati scenari. Ad esempio, il tempo di esecuzione standard di 1 ora sul dissociatore meccanico si rivela occasionalmente insufficiente per la dissociazione completa del tessuto tumorale. Mentre afferri saldamente il tubo C, sbattilo più volte verso il basso per accumulare il tessuto vagante sul fondo. Se rimangono frammenti di tessuto visibili, continuare la dissociazione e ispezionare nuovamente a intervalli di 15 minuti. È importante notare che alcuni tessuti, in particolare il tessuto fibroso o adiposo, possono resistere alla dissociazione e richiedere la rimozione manuale per prevenire l'intasamento dell'ago durante l'iniezione.

Si consiglia di utilizzare l'ago di calibro più piccolo possibile (27 G o 26 G) per ridurre al minimo il disagio dell'animale e ridurre il rischio di riflusso cellulare dal sito di iniezione, che potrebbe influire sul successo dell'attecchimento e sui tassi di crescita del tumore. Tuttavia, se rimangono frammenti di tessuto o adiposi non dissociati, può essere necessario un ago di calibro maggiore (16 G o 18 G), anche se con un aumento del rischio di sanguinamento o perdita cellulare. Indipendentemente dal calibro dell'ago selezionato, la competenza nella manipolazione degli animali è la componente più importante per eseguire le iniezioni in modo efficace. In questo protocollo non viene utilizzata alcuna anestesia e, sebbene ciò consenta di risparmiare tempo, consente anche all'animale di avere un certo grado di mobilità durante l'esecuzione delle iniezioni. Se non si ottiene un'adeguata moderazione durante la collottola, movimenti bruschi degli arti possono causare la puntura dei vasi, la creazione di una ferita di uscita che impedisce la ritenzione cellulare o la perforazione della parete addominale. Si raccomanda vivamente di fare pratica con l'iniezione prima di iniettare cellule preziose.

La tecnica di dissociazione descritta è altamente trasferibile e può essere impiegata nell'impianto di numerosi altri tipi di tumore sia per modelli ortotopici che sottocutanei. Tuttavia, almeno nel contesto della BC, l'impianto sottocutaneo dovrebbe essere evitato. L'iniezione ortotopica di BC PDX determina una vascolarizzazione superiore dell'ospite del tumore trapiantato rispetto a quella sottocutanea, mentre l'impianto di cuscinetti adiposi inguinali porta a tassi di attecchimento maggiori rispetto al cuscinetto adiposo toracico¹¹. Inoltre, i PDX impiantati ortotopicamente hanno un tempo di attecchimento più breve e un tasso di crescita più rapido rispetto alle iniezioni sottocutanee¹². Va inoltre notato che mentre la dissociazione facilita la rapida iniezione di cellule tumorali, provoca intrinsecamente la perdita del contesto da cellula a cellula; Pertanto, potrebbe non essere un approccio appropriato in tutti i casi. Per i casi che richiedono un'autentica interazione cellulare (ad esempio, la trascrittomica spaziale dei tumori), può essere preferibile l'iniezione di pezzi di tumore tritati o l'impianto di frammenti.

Sebbene sia essenziale per gli studi PDX, l'uso di topi immunodeficienti introduce alcune limitazioni. Da un punto di vista logistico, è necessario un ambiente completamente sterile, che includa alloggio, cibo e acqua. Ciò richiede inoltre aree di stabulazione dedicate per gli animali immunodeficienti per ridurre il rischio di infezione, aumentando potenzialmente i costi di stabulazione. Questa maggiore suscettibilità alle infezioni è il motivo per cui viene suggerita una fase di incubazione antibiotica per i frammenti tumorali prima della dissociazione. Tuttavia, alcuni studi hanno dimostrato che l'uso di antibiotici in coltura cellulare porta ad alterazioni dei profili di espressione genica¹³. Detto questo, i ricercatori dovrebbero valutare l'uso di antibiotici per ogni studio. Se da un lato l'effettiva assenza di un sistema immunitario consente l'attecchimento dei PDX, dall'altro preclude lo studio dei numerosi effetti del sistema immunitario sulla progressione del BC¹⁴.

Questo metodo dimostra un'elevata fedeltà ai campioni tumorali del paziente. L'autenticazione istopatologica ha confermato la concordanza della PDX passata rispetto al campione tumorale del paziente, come previsto. L'elevato allineamento delle reads al genoma umano suggerisce fortemente che il PDX mantiene un'alta percentuale di cellule umane dopo il passaggio. Ciò è ulteriormente supportato dalla somiglianza dell'>80% nei profili STR e dalla forte correlazione positiva nei dati RNA-seq tra il tumore del paziente e la PDX. Gli adattamenti molecolari nei tessuti periferici dei topi PDX in seguito alla crescita del tumore al seno sono anche coerenti con gli adattamenti molecolari nei pazienti umani con BC. Le analisi di massa dell'RNA-seq e proteomiche dei muscoli scheletrici di topi BC PDX sono sorprendentemente concordanti con i cambiamenti molecolari nelle biopsie muscolari ottenute da pazienti con diagnosi di BC ^6,7 in stadio iniziale. Nel complesso, la somiglianza del profilo STR e dell'RNA-seq, unita ad adattamenti coerenti nei tessuti periferici, fornisce dati convincenti per l'uso di topi BC PDX negli studi preclinici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 mL siringa per tubercolina	BD	305945	sterile
1x soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4	Gibco	10010023	sterile
2,0 mL provetta per microcentrifuga a fondo tondo	Eppendorf	0030123620
sterile ago da 26 G, ½ in.	BD	305111
microprovetta sterile da 5,0 mL	Eppendorf	0030119401
sterile NSG di 8+ settimane (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) topi	The Jackson Laboratory	#005557
Tamponi per la preparazione dell'alcol	Fisher Scientific	22-363-750	sterile
Estratto di membrana basale (Matrigel)	Cultrex	3632-005-02
Applicatori con punta in cotone, 6 in.	Fisher Scientific	22-029-553
pinza curva sterile con punte medie non seghettate, microscopia elettronica da 152 mm	Sciences	50-365-845	crema
depilatoria	Nair
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo dissociatore con riscaldatori	Miltenyi Biotec	130-096-427
N. 10 lame per bisturi	Fisher Scientific	12-000-162
spugne di garza sterili in tessuto non tessuto, 4x4 pollici	Fisher Scientific	22-028-558	sterile
RPMI 1640 1x + L-Glutammina	Gibco	11875093	sterile
Kit di dissociazione tumorale, umano	Miltenyi Biotec	130-095-929

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