Articolo metodologico

Riprogrammazione del modello di macrofagi derivati da monociti umani per saggi in vitro

DOI:

10.3791/67651

⸱

18 aprile 2025

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I monociti e i macrofagi sono cellule immunitarie molto plastiche e riprogrammabili, cruciali per la salute e la malattia. Percepiscono e rispondono a un'ampia gamma di stimoli adottando specifici programmi di differenziazione e fenotipi. Abbiamo standardizzato un modello in vitro per studiare la polarizzazione e la riprogrammazione dei macrofagi, fornendo uno strumento prezioso per la ricerca.

Abstract

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Le cellule del lignaggio monociti-macrofagi sono multifunzionali e si trovano in quasi tutti i tessuti del corpo. Coordinano le fasi di inizio e risoluzione dell'immunità innata e adattativa, influenzando in modo significativo l'immunità protettiva e il danno patologico immuno-mediato. Mentre i macrofagi residenti nei tessuti sono attori chiave nel mantenimento dell'omeostasi in uno stato stazionario, grandi quantità di monociti vengono reclutate dal sangue periferico nel tessuto a seguito di danni o insulti infiammatori. I macrofagi derivati dai monociti (M-DM) possono differenziarsi in molti sottotipi dinamici e i loro fenotipi e funzioni dipendono dall'ambiente tissutale locale.

Per confrontare diversi stimoli o condizioni ambientali durante la differenziazione e la polarizzazione M-DM, abbiamo standardizzato un modello in vitro di M-DM umano non polarizzato M0 e alcuni macrofagi cardinali polarizzati con citochine, M1 derivato da IFNγ/LPS, M2a derivato da IL-4 e M2c derivato da IL-10 o desametasone, per analizzare la riprogrammazione distorta di M-DM mediante citometria a flusso e PCR in tempo reale. Abbiamo scoperto che CD64, CD206, CD163, CD14 e MERTK possono discriminare chiaramente M0 non polarizzato e M1, M2a e M2c polarizzati mediante citometria a flusso. Inoltre, abbiamo definito IRF1 e CXCL10 come geni specifici per i classici trascritti M1-, IRF4-, CCL22 e TGM2-specifici derivati da IFNγ/LPS per M2a derivati da IL-4 e il gene MERTK per M2c derivato da desametasone. Per riassumere, il nostro protocollo M-DM standardizzato potrebbe fornire la mappa cardinale in vitro per analizzare la differenziazione e la polarizzazione della M-DM umana sotto diversi stimoli.

Introduzione

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I macrofagi, identificati per la prima volta da Metchnikoff per la loro capacità fagocitica, sono cellule antiche fondamentali per la vita dei Metazoi. Presenti ovunque nei mammiferi adulti, mostrano una notevole diversità anatomica e funzionale. Come parte del sistema fagocitario mononucleato, insieme alle cellule dendritiche e ai monociti, i macrofagi svolgono ruoli cruciali in vari processi biologici, dallo sviluppo e omeostasi alle risposte immunitarie contro i patogeni1,2. I macrofagi residenti, specializzati per i loro microambienti tissutali, agiscono come sentinelle, monitorando la salute dei tessuti e rispondendo ai cambiamenti fisiologici e alle minacce esterne. Si ritiene che la loro limitata plasticità sia un adattamento evolutivo per mantenere l'omeostasi dei tessuti. Al contrario, i monociti reclutati sono più flessibili e possono differenziarsi in diversi fenotipi di macrofagi durante l'infiammazione. Questa doppia influenza dell'infiammazione e della nicchia tissutale modella la diversità funzionale dei macrofagi3. Pertanto, a seconda dell'ambiente tissutale locale, i macrofagi derivati dai monociti (M-DM) possono differenziarsi in molti sottotipi. I metaboliti locali, i fattori di crescita, le citochine e l'interazione cellula-cellula4,5,6 delineano i loro fenotipi e funzioni. Inoltre, i macrofagi sono produttori chiave di fattori che smorzano l'infiammazione e guidano la rivascolarizzazione e la riparazione dei tessuti7,8.

Dato che almeno tre bracci principali controllano la polarizzazione (condizioni estrinseche, intrinseche e tissutali), la polarizzazione dei macrofagi dovrebbe essere vista come multidimensionale2. I principali ostacoli e insidie nella descrizione della differenziazione e della polarizzazione dei macrofagi sono le condizioni sperimentali eterogenee in tutta la letteratura e la mancanza di consenso sulla definizione dei termini dei macrofagi negli esperimenti in vitro e in vivo9. Ciononostante, è stata avviata una certa unificazione degli standard sperimentali per diversi scenari sperimentali.

Per comprendere meglio il campo dei macrofagi umani, abbiamo bisogno di modelli in vitro standardizzati e ben definiti di M-DM per collegare, differenziare, polarizzare, fenotipo e riprogrammare, nonché funzioni specifiche. Il nostro obiettivo era quello di impostare un modello standardizzato in vitro di M-DM M0 umano non polarizzato e macrofagi polarizzati con citochine per studiare la riprogrammazione distorcente di M-DM mediante citometria a flusso e PCR in tempo reale. Sebbene la polarizzazione dei macrofagi sia un processo dinamico a causa della loro elevata plasticità e capacità di integrare più segnali dal loro ambiente, abbiamo qui caratterizzato gli stati di polarizzazione non polarizzati M-DM (M0) e alcuni stati di polarizzazione in vitro, come il classico pro-infiammatorio, comunemente riconosciuto anche come M1, indotto con IFNγ e LPS. Allo stesso modo, i macrofagi M2 regolatori e di riparazione tissutale possono essere definiti come M2a quando indotti con IL-4 e M2c quando stimolati con desametasone o IL-10. Questi stati polarizzanti catturano un'istantanea dell'ampio spettro dell'ambiente M-DM nel tempo e nello spazio, ma ci forniscono alcuni punti cardinali per impostare la mappa analitica dove localizzare le condizioni di test.

Nonostante la complessa e dinamica combinazione di marcatori di superficie e programmi trascrizionali, durante l'analisi di M-DM in vitro, abbiamo impostato che CD64, CD206, CD163, CD14 e MERTK possono separare la condizione M0 non polarizzata, da M1 indotta da IFNγ/LPS, M2a indotta da IL-4 e IL-10 o desametasone indotta dalla citometria a flusso. Inoltre, l'espressione dei geni IRF1 e CXCL10 è stata definita come specifica per l'M1 indotto da IFNγ/LPS; Trascritti specifici per IRF4, CCL22 e TGM2 per M2a derivato da IL-4; e il gene MERTK per M2c derivato dal desametasone, stabilendo ulteriori punti cardinali per confrontare la riprogrammazione distorta di M-DM sfidato con stimoli diversi o addirittura co-coltivato con altri tipi di cellule.

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Protocollo

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Tutti i donatori di sangue volontari sani hanno fornito il consenso informato scritto e lo studio è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell'Accademia Nazionale di Medicina (IMEX-CONICET-ANM) Argentina. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

NOTA: Le PBMC sono isolate da 40 ml di sangue periferico anticoagulato con citrato di sodio al 3,8% e utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità Ficoll-Hypaque (1077). Questo protocollo viene eseguito in condizioni sterili in una cabina di biosicurezza BSL2.

  1. Trasferire il campione di sangue periferico anticoagulato ricevuto in provette da 15 mL o 50 mL appropriate per la centrifugazione.
  2. Centrifugare campioni di sangue a 200 × g per 15 minuti (accelerazione: 4 decelerazione: 2, quando il massimo è 5) a temperatura ambiente per ottenere plasma ricco di piastrine (PRP) sulla parte superiore e frazione cellulare, compresi i globuli rossi e bianchi sottostanti. Vedi Figura 1.
  3. Trasferire la frazione superiore (PRP) in provette da 15 mL (se si desidera conservare il plasma) e centrifugare a 600 × g per 10 minuti (accelerazione e decelerazione massime) per ottenere la frazione plasmatica finale senza piastrine. Conservare il plasma a -20 °C.
  4. Diluire la frazione cellulare ottenuta dalla prima centrifugazione, da 2x (minimo) a 3x (massimo) utilizzando 1x Soluzione salina tamponata con fosfato sterile (1x PBS) preriscaldata a temperatura ambiente. Omogeneizzarlo delicatamente e utilizzare questa frazione diluita per la centrifugazione in gradiente di densità Ficoll-Hypaque.
  5. Trasferire 15 mL di Ficoll-Hypaque in una provetta sterile da 50 mL. Quindi, aggiungere con attenzione e lentamente 30 mL di sangue diluito sopra il Ficoll, evitando di mescolare le fasi. Se si lavora con 10 mL o meno di sangue diluito, trasferire 4 mL di Ficoll-Hypaque in una provetta da 15 mL e quindi aggiungere i 10 mL di campione di sangue diluito.
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale per ottenere la frazione mononucleare.
  6. Centrifugare la provetta contenente il Ficoll più sangue diluito a 600 × g per 25 min (accelerazione: 1; Decelerazione: 0) a temperatura ambiente.
  7. Rimuovere parte dello strato superiore giallo con una pipetta Pasteur sterile da 3 ml. Quindi, raccogliere con cura l'interfaccia (frazione mononucleata "anello") formata tra lo strato superiore giallo e lo strato di Ficoll con una pipetta Pasteur sterile. Questo "anello" contiene le cellule mononucleate (PBMC) di interesse.
    NOTA: Parte della fase plasmatica rimanente può essere raccolta, ma assicurati di evitare la fase di Ficoll, poiché potrebbe essere tossica per le PBMC.
  8. Trasferire le PBMC raccolte in una nuova provetta da 15 mL contenente almeno 3 mL di 1x PBS sterile. Quindi, rabboccare con il volume corrispondente di 1x PBS sterile a 12-15 mL. Centrifugare i PBMC a 600 × g (accelerazione e decelerazione massime) per 10 minuti.
  9. Scartare il surnatante e lavare nuovamente i PBMC. Risospendere il pellet cellulare aggiungendo 1 mL di 1x PBS sterile, quindi rabboccare fino a 12-14 mL con ulteriore 1x PBS sterile. Centrifugare le provette a 600 × g (accelerazione e decelerazione massime) per 10 minuti.
  10. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet di PBMC in 1x PBS sterile contenente il 2% di siero fetale bovino inattivato (1x PBS-2% FBS) e portare il volume fino a 10 mL. Utilizzare un contacellule automatico o contare le cellule, preparando una sospensione cellulare 1:5 diluita in freddo sterile 1x PBS e poi (1:2) in Blu di Tripano per ottenere una diluizione finale di 1:10. Utilizzare un microscopio ottico per il conteggio.
  11. Centrifugare la sospensione di PBMC a 300 × g per 5 minuti a 8-10 °C. Risospendere le cellule in un volume desiderato di 1x PBS-2% FBS sterile e freddo per ottenere una concentrazione finale di 10-8 cellule/mL. Lasciare queste celle a 4 °C fino al passaggio successivo.
    NOTA: Se le PBMC raccolte non verranno utilizzate lo stesso giorno, si consiglia di congelare in una fiala criogenica a 10-8 cellule/mL in un terreno di congelamento appropriato (90% di FBS contenente il 10% di dimetilsolfossido, DMSO). Conservare a -80 °C in un contenitore di polietilenglicole per una notte per consentire alle cellule di congelarsi lentamente, riducendo così al minimo i danni cellulari. Il giorno successivo, trasferire le celle in una scatola di conservazione e lasciarle a -80 °C per un paio di giorni o trasferirle in un serbatoio di azoto liquido per un lungo periodo di conservazione.

2. Selezione dei monociti CD14+ utilizzando perle magnetiche

NOTA: La quantità di monociti CD14 trovati nelle PBMC di donatori sani è variabile a seconda dell'età e del sesso. Quando disponibile, utilizzare un contatore di cellule per ottenere la % di monociti in ciascun campione e quindi calcolare il numero di PBMC necessari per selezionare i monociti CD14 richiesti. Se non è disponibile alcun contatore di cellule, il 10% dei monociti per campione PBMC potrebbe essere considerato un approccio ampio4,6,7,10,11,12,13.

I monociti CD14+ vengono isolati utilizzando un kit di selezione CD14 positivo umano5. Abbiamo standardizzato il protocollo di isolamento utilizzando da 1 a 2 × 107 PBMC in 100 μL di reazione; Usa questo rapporto per numeri più alti. Il volume minimo di reazione suggerito è di 100 μL, anche con un numero di cellule inferiore a 1 × 107 PBMC.

  1. Preparare la sospensione cellulare PBMC a una concentrazione di 1-2 × 108 cellule/mL in 1x PBS-2% FBS contenente 1 mM di tampone acido etilendiamminotetraacetico (1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA) e trasferire la quantità desiderata di PBMC in una provetta da 5 mL di polistirene a fondo tondo.
  2. Aggiungere 10 μl di cocktail a selezione positiva per ogni 100 μl di sospensione cellulare, mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
  3. Aggiungere 10 μL di nanoparticelle magnetiche per 100 μL di sospensione cellulare, pipettare energicamente su e giù più di 5 volte per sospendere uniformemente le nanoparticelle magnetiche e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    NOTA: Il vortex non è consigliato.
  4. Aggiungere 1 tampone PBS-2% FBS-1 mM EDTA per aumentare il volume totale della sospensione cellulare a 2,5 mL. Pipettare delicatamente le cellule nella provetta su e giù 2-3 volte. Inserire il tubo nel selezionatore di magneti e metterlo da parte per 5 minuti.
  5. Prendi il magnete e capovolgilo insieme al tubo con un movimento continuo, scartando la frazione surnatante. Le celle marcate magneticamente rimarranno all'interno del tubo. Lasciare il magnete e il tubo capovolti per 2-3 secondi, quindi ruotarli verticalmente in posizione verticale.
    NOTA: Lasciare eventuali gocce pendenti dalla bocca del tubo; Non scuoterli o asciugarli.
  6. Rimuovere la provetta dal magnete e aggiungere nuovamente 2,5 mL di 1x tampone PBS-2% FBS-1 mM EDTA nella provetta. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù 2-3 volte per mescolarla. Reinserire il tubo nel magnete e metterlo da parte per 5 minuti.
  7. Con un movimento continuo, invertire sia il magnete che il tubo, scartando la frazione surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospendere le celle in una quantità adeguata di 1x tampone PBS-2% FBS (senza EDTA). Le celle selezionate positivamente sono ora pronte per l'uso.
    NOTA: Sono necessarie un totale di due separazioni di 5 minuti nel magnete.
  8. Lavare le cellule CD14 selezionate utilizzando 1 tampone PBS-2% FBS, portando la sospensione cellulare a 12-14 mL per diluire l'EDTA rimanente, quindi centrifugare a 600 × g (accelerazione e decelerazione massime) per 10 minuti.
  9. Scartare il surnatante e ripetere il lavaggio rimettendo in sospensione il pellet cellulare con 1 mL di 1x tampone PBS-2% FBS e poi rabboccando il volume a 12-14 mL. Centrifugare le provette a 600 × g (accelerazione e decelerazione massime) per 10 minuti.
  10. Scartare il surnatante e risospendere i monociti CD14 selezionati positivi in 2 mL di tampone FBS 1x PBS-2%. Utilizzare il contatore automatico di cellule o contare le cellule diluendo la sospensione cellulare (1:5) in freddo sterile 1x PBS e poi (1:2) in Trypan Blue utilizzando un microscopio ottico. Lasciare le cellule sul ghiaccio fino alla preparazione della coltura.
    NOTA: La purezza cellulare può essere testata mediante citometria a flusso, prelevando 50 μl della sospensione cellulare e colorandola per le cellule CD14+ (clone HCD14). Si consiglia una purezza superiore al 90%.
  11. Per la coltura, centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 5 minuti a 8-10 °C. Risospendere il pellet a una concentrazione di 106 cellule/mL utilizzando RPMI 1640 addizionato con il 10% di FBS inattivato e l'1% di penicillina-streptomicina (RPMI-10% FBS-1% P/S).
    NOTA: È fondamentale utilizzare un FBS di alta qualità, a basso contenuto di endotossine e inattivato termicamente. Mantenere sempre sul ghiaccio per evitare l'adesione dei monociti alla parete di plastica prima della placcatura.

3. Differenziazione e polarizzazione dei macrofagi derivati da monociti (M-DM)

NOTA: La coltura M-DM viene eseguita mediante piastratura di 2,5 × 105 monociti CD14+ in piastre a 48 pozzetti contenenti 500 μL di RPMI-10% FBS-1% P/S e coltivate in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 (5%) per 7 giorni. Scegliere le piastre trattate per migliorare l'aderenza dei monociti alla piastra.

  1. Definire tutte le condizioni sperimentali da eseguire, inclusi i pozzetti per la M-DM basale (M0), l'M1 infiammatorio, la riparazione tissutale M2a, l'M2c regolatoria e le condizioni di test desiderate.
  2. Pipettare 250 μl della sospensione cellulare preparata al punto 2.11 per seminare 2,5 × 105 monociti CD14+ in ciascun pozzetto.
  3. Aggiungere 250 μL di RPMI-10% FBS-1% P/S più 50 ng/mL di M-CSF a ciascun pozzetto per completare i 500 μL di volume totale.
  4. Incubare la piastra di coltura cellulare in un incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5% per 4 giorni per consentire la prima fase di differenziazione dei macrofagi.
    NOTA: Controllare periodicamente la differenziazione della coltura cellulare per vedere se i cambiamenti morfologici si sono verificati come previsto o se esistono cellule non attaccate indesiderate.
  5. Sostituire metà del terreno di coltura (250 μl di RPMI-10% FBS-1% P/S) il giorno 4 della coltura M-DM. Aggiungere citochine o reagenti per le condizioni polarizzanti e coltivarli per 3 giorni (l'endpoint è il giorno 7): LPS (1 ng/mL) più IFNγ (50 ng/mL) per M1, IL-4 (40 ng/mL) per M2a, IL-10 (50 ng/mL) o desametasone (0,1 μM) per M2c.
  6. Raccogliere M-DM il giorno 7 per eseguire la caratterizzazione fenotipica, raccoglierle per l'espressione dell'mRNA come indicato nelle due fasi successive o eseguire un test funzionale.

4. Caratterizzazione del fenotipo di superficie in M-DM polarizzato mediante citometria a flusso

  1. Scartare il volume totale del terreno di coltura (500 μl di una piastra a 48 pozzetti) e aggiungere 200 μl di tampone EDTA 1x PBS-2% FBS-1 mM per la raccolta delle cellule. Incubare per 20 minuti con ghiaccio e quindi aggiungere 200 μl di 1x PBS-2% FBS per diluire il tampone EDTA. Raccogliere l'M-DM pipettandolo su e giù in microprovette da 1,5 mL. Lavare queste cellule raccolte una volta con 1x PBS-2% FBS e centrifugare a 800 × g per 3 minuti.
  2. Risospendere il pellet M-DM con 200 μl di 1x PBS-5% FBS e trasferirlo in una micropiastra a fondo tondo a 96 pozzetti per il blocco a temperatura ambiente per 15 minuti. Centrifugare le celle a 800 × g per 3 minuti.
  3. Preparare la combinazione appropriata di anticorpi coniugati direttamente in 1x PBS- 2% FBS. Colorare ogni pozzetto o condizione (1x) con 50 μL del pannello anticorpale e incubare a 4 °C per 30 minuti al buio.
    NOTA: Qui, il pannello anticorpale era composto da CD11b-APC/Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP/Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 e MERTK-biotina più streptavidina-PE. La concentrazione di anticorpi pretitolati è riportata nella Tabella 1.
  4. Lavare l'M-DM colorato aggiungendo 150 μL di 1x PBS e centrifugare a 800 × g per 3 min.
  5. Per misurare la vitalità cellulare, aggiungere 100 μl del colorante di vitalità fissabile Zombie Violet (1:1.000 in 1x PBS) e incubare a 4 °C per 30 minuti al buio.
  6. Lavare le cellule colorate aggiungendo 100 μl di 1x PBS e centrifugare a 800 × g per 3 minuti. Ripetere la procedura di lavaggio utilizzando 200 μl di 1x PBS.
  7. Fissare rimettendo in sospensione il pellet M-DM con 100 μL di reagente fissativo (dal kit fissativo/permeabilizzazione) e incubandoli per 20 minuti su ghiaccio e al buio.
    NOTA: Per ottenere un fissaggio appropriato, è essenziale omogeneizzare correttamente il pellet cellulare.
  8. Lavare l'M-DM aggiungendo 100 μl di 1x PBS-2% FBS e centrifugare a 800 × g per 3 minuti. Ripetere la procedura di lavaggio utilizzando 200 μl di 1x PBS-2% FBS.
  9. Risospendere il pellet M-DM in 200 μL di 1x PBS ed eseguire le cellule colorate nel citometro a flusso.

5. Profilo del programma genico per discriminare la polarizzazione M-DM mediante qPCR

NOTA: Il giorno 7 della coltura, 2,5 × 105 M-DM possono essere raccolti utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA per l'isolamento di RNA totale di alta qualità. L'isolamento dell'RNA può essere eseguito anche utilizzando metodi alternativi, come l'estrazione dell'RNA su colonna e un kit di eluizione.

  1. Scartare il volume totale del terreno di coltura e il M-DM lisato aggiungendo direttamente 350 μl del reagente di estrazione. Omogeneizzare e trasferire questa sospensione cellulare in una microprovetta da 1,5 mL priva di RNasi/DNasi e continuare con l'isolamento dell'RNA.
    NOTA: Se l'isolamento dell'RNA non viene eseguito lo stesso giorno, il campione della fase 5.1 può essere conservato a 4 °C durante la notte o a -20 °C per un massimo di un anno.
  2. Per consentire la completa dissociazione del complesso nucleoproteico, incubare i campioni omogeneizzati dalla fase 5.1 per 5 minuti a 25 °C
  3. Aggiungere 70 μl di cloroformio a ciascun campione. Tappare saldamente ogni provetta per evitare perdite e mescolare accuratamente il contenuto agitando la provetta. Incubare i campioni per 2-3 minuti e poi centrifugare i campioni a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Questo passaggio separerà completamente le fasi in una fase inferiore di fenolo-cloroformio, un'interfase e una fase acquosa superiore incolore><. NOTA: Il volume del cloroformio si basa su un rapporto di 0,2 mL di cloroformio per 1 mL di reagente di estrazione utilizzato durante la fase di lisi.
  4. Trasferire la fase acquosa contenente l'RNA in una nuova microprovetta da 1,5 mL priva di RNasi/DNasi.
    NOTA: Lasciare un piccolo volume durante l'assunzione della fase acquosa per evitare di trasferire l'interfase o gli strati organici.
  5. Aggiungere 175 μl di isopropanolo a ciascun campione per precipitare l'RNA. Incubare per 10 minuti a 4 °C o in alternativa per una notte a -20 °C.
    NOTA: Il volume dell'isopropanolo si basa su un rapporto di 0,5 mL di isopropanolo per mL di reagente di estrazione iniziale.
  6. Centrifugare i campioni a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Un pellet bianco gelatinoso di RNA totale precipiterà sul fondo del tubo. Rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante utilizzando una micropipetta.
  7. Lavare l'RNA risospendendo il pellet bianco gelatinoso in 350 μL di etanolo al 75% (1 mL per 1 mL di reagente di estrazione (v/v) utilizzato per la lisi).
    NOTA: L'RNA può essere conservato in etanolo al 75% per un massimo di 1 anno a -20 °C o fino a 1 settimana a 4 °C.
  8. Agitare brevemente il pellet risospeso e centrifugare a 7.500 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere ed eliminare il surnatante utilizzando una micropipetta. Asciugare all'aria o sottovuoto il pellet di RNA per 5-10 min.
    NOTA: Per solubilizzare l'RNA, evitare l'essiccazione eccessiva del pellet di RNA.
  9. Risospendere il pellet in 20-30 μL di acqua priva di RNasi pipettandolo su e giù. Incubare a bagnomaria o blocco termico impostato a 55-60 °C per 10-15 min. Procedere con la misurazione della concentrazione di RNA e conservare l'RNA a -70 °C.
  10. Eseguire la trascrizione inversa (copia del cDNA) utilizzando 100-500 ng di RNA (minimo e massimo, rispettivamente) in 20 μL di volume di reazione utilizzando un kit di sintesi del cDNA.
  11. Eseguire le reazioni di PCR in tempo reale utilizzando 1 μL di cDNA (5-25 ng).
    1. Preparare la miscela di reazione per ciascuna provetta (1x) utilizzando 5 μl di miscela verde SYBR (2x), 0,2 μl di ciascun primer (avanti e indietro) e 3,6 μl di acqua priva di nucleasi. Scalare tutti i componenti in base al numero di campione. Mescolare accuratamente la miscela di reazione e dosare 9 μl in ciascuna provetta qPCR e infine 1 μl di cDNA per raggiungere il volume totale finale di 10 μl.
    2. Programmare il protocollo dei cicli termici su uno strumento PCR in tempo reale come segue: 2-3 min a 98 °C (1x); 5-15 s a 98 °C più 15-30 s a 60 °C (35-40x); infine includere l'analisi della curva di fusione (65-95 °C) con incrementi di 0,5 °C a 2-5 s/step o utilizzare l'impostazione predefinita dello strumento.
      NOTA: Questa reazione è stata standardizzata utilizzando la miscela universale SYBR Green. I primer raccomandati per l'analisi della polarizzazione M-DM sono elencati nella Tabella 2.
  12. Normalizzare i risultati utilizzando come gene di riferimento il fattore di allungamento della traduzione eucariotica 1 alfa 1 (EEF1A1), e verificare la specificità dei prodotti amplificati attraverso l'analisi delle curve di dissociazione.
    NOTA: L'analisi della curva di dissociazione consente di confermare la presenza di un solo prodotto di amplificazione qPCR nella reazione.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sulla base del nostro lavoro di caratterizzazione dei macrofagi per diversi anni, abbiamo impostato una combinazione accurata di marcatori che distingue chiaramente i diversi sottogruppi di M-DM in vitro. I marcatori fenotipici sono stati selezionati in base alla letteratura e a un ampio screening precedente che avevamo precedentemente eseguito9,14,15,16,17...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La differenziazione, l'attivazione e la polarizzazione dei macrofagi sono diventate un obiettivo centrale nell'immunologia, nell'omeostasi tissutale, nella patogenesi della malattia e nella risoluzione dell'infiammazione. Inoltre, il quadro emergente secondo cui i macrofagi tissutali possono derivare da monociti circolanti in condizioni di omeostasi interrotta sottolinea la necessità di modelli precisi di M-DM caratterizzati da fenotipi, programmi trascrizionali e vie di attivazione definiti.

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia Nazionale per la Promozione della Scienza e della Tecnologia (ANPCyT-FONCYT) attraverso le sovvenzioni PICT 2018-3070 e 2021-I-A-00807 a E.A.C.S. e PICT 2021-I-A-00716 a A.E.E, e dal Consiglio Nazionale per la Ricerca Scientifica e Tecnica (CONICET) attraverso la sovvenzione PIP 2022-0763 e dall'Università di Buenos Aires attraverso Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 a A.E.E., E.A.C.S. e A.E.E. sono ricercatori di carriera presso il CONICET.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
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Alexa Fluor 488 mouse anti-umano  CD206 Clone di anticorpi 15-2BioLegend, San Diego, CA, USA.Gatto# 321113; RRID:AB_571874
Clone di anticorpo CD64 anti-umano di topo APC 10.1BioLegend, San Diego, CA, USA.Gatto# 305013; RRID:AB_1595539
APC/Cy7 ratto anti-topo/umano CD11b Anticorpo clone M1/70BioLegend, San Diego, CA, USA.Gatto# 101226; RRID:AB_830642
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, USAfissativo/permeabilizzazioneCat# 554714
Biotina anti-MERTK umano Clone di anticorpo 590H11G1E3BioLegend, San Diego, CA, USA.Gatto# 367616; RRID:AB_2721500 
Apparecchiature CFX-Connect Bio-Rad, Hercules, CA, USA
Kit di selezione positiva per CD14 umano EasySep; Cocktail EasySep Selezione Positiva; EasySep Nanoparticelle magnetiche; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Vancouver, CanadaCat# 18058
FACS Canto citometro Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, Stati Uniti.
Siero fetale bovino, qualificato, Nuova ZelandaGibco&commercio;   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA USA 		Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Life Sciences, USACat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
Prisma GraphPad   Software GraphPad Inc.RRID:SCR_002798
kit di sintesi del cDNA iScript, include 5 miscele di reazioni di trascrizione inversa, trascrittasi inversa iScript, acqua priva di nucleasiBio-Rad, Hercules, CA, USACat# 1708891
citometro spaziale Partec CyFlow Sysmex Partec, Germania
PE StreptavidinBioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 405203
PE/Cy7 topo anti-umano CD14 Anticorpo clone HCD14BioLegend, San Diego, CA, USA.Gatto# 325618; RRID:AB_830691
PerCP/Cy5.5 topo anti-umano CD163 Anticorpo clone GHI/61BioLegend, San Diego, CA, USA.Gatto# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 MediumGibco™   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA USA 		Cat# 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, contiene Sso7d fusi hot-start mediato da anticorpi. n polimerasi, dNTP, MgCl2, colorante SYBR Green I, potenziatori, stabilizzanti e una miscela di coloranti di riferimento passivi (inclusi ROX e fluoresceina).Bio-Rad, Hercules, CA, USACat# 1725271
Reagente TriZolThermo Fisher Scientific
Life Sciences Solutions
Carlsbad, CA, USA 		Cat#  15596026Reagente per l'estrazione dell'RNA
Zombie Violet Kit di vitalità riparabileBioLegend, San Diego, CA, USA.Gatto# 423113
Kit

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Monocyte Derived MacrophagesMacrophage PolarizationIn Vitro ModelFlow CytometryReal Time PCRCytokine PolarizationPBMC IsolationCD14 MonocytesMacrophage DifferentiationPhenotypic Characterization

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