Flusso di lavoro di imaging e analisi ad alto rendimento per la valutazione dei fenotipi delle cellule cutanee e degli stati di proliferazione nei campioni di tessuto

Summary

La combinazione di IBEX (iterative bleaching-extends-multiplexity) e di un saggio commerciale di marcatura dei nucleotidi (Click-iT EdU) consente il rilevamento e la categorizzazione dei tipi di cellule in divisione in processi altamente dinamici in sezioni fisse di tessuto murino congelato. Inoltre, una nuova pipeline di elaborazione delle immagini open source fornisce l'acquisizione e l'analisi delle immagini ad alto rendimento.

Abstract

Le lesioni cutanee avviano una complessa cascata rigenerativa che coinvolge vari tipi di cellule. Tra queste, le cellule gliali periferiche svolgono un ruolo fondamentale nel garantire il successo del processo di riparazione. Tuttavia, la nostra comprensione di questi processi rimane incompleta a causa delle limitazioni delle tecnologie attuali. Pertanto, il metodo IBEX (iterative bleaching-extends-multiplexity) è stato impiegato per caratterizzare i cambiamenti nella composizione cellulare della pelle utilizzando anticorpi diretti contro le proteine espresse da tipi di cellule chiave e strutture coinvolte nella rigenerazione tissutale. È importante sottolineare che gli anticorpi diretti contro i marcatori di proliferazione cellulare spesso sottostimano il numero di cellule in divisione nella pelle. Per superare questa limitazione, la chimica Click-iT EdU è stata combinata con il metodo IBEX, consentendo una caratterizzazione dettagliata dei tipi di cellule proliferanti. Utilizzando un microscopio confocale a disco rotante completamente automatizzato, è stato sviluppato un flusso di lavoro ad alta produttività per l'imaging iterativo di campioni sezionati in piastre a 24 pozzetti. Oltre a estendere il metodo IBEX per valutare gli stati cellulari in situ con Click-iT EdU, è stata introdotta anche una nuova pipeline di elaborazione delle immagini open source per eseguire la correzione, lo stitching e la registrazione delle immagini e può essere utilizzata dai ricercatori senza una vasta esperienza di programmazione. Inoltre, viene fornita anche una documentazione dettagliata sull'elaborazione e la visualizzazione di dati di imaging altamente multiplexati (utilizzando software di analisi delle immagini convenzionali, tra cui Fiji e QuPath). In sintesi, questo protocollo evidenzia la versatilità del protocollo IBEX e dimostra il suo adattamento a una piattaforma di imaging convenzionale consolidata. In particolare, la combinazione di IBEX con l'etichettatura Click-iT EdU consente il rilevamento e la categorizzazione di tipi di cellule in divisione attiva in tessuti intatti e durante processi altamente dinamici a risoluzione spaziale.

Introduction

La pelle è l'organo più esteso del corpo umano e la barriera primordiale per proteggere il corpo dall'ambiente esterno¹. Di conseguenza, è esposto a una pletora di sfide esterne che ne compromettono la funzione di barriera. Pertanto, la pelle ha sviluppato meccanismi complessi per ripristinare l'integrità e la funzionalità dei tessuti a seguito di danni. La guarigione delle ferite cutanee avviene in tre fasi sovrapposte: infiammazione, proliferazione e maturazione/rimodellamento. Queste tre fasi coinvolgono diversi tipi di cellule, come i fibroblasti dermici e le cellule immunitarie, che agiscono insieme per ripristinare le proprietà biologiche iniziali del tessuto cutaneo danneggiato ^1,2,3.

La pelle è un organo densamente innervato ed è noto che l'innervazione nervosa è fondamentale per il successo del processo di riparazione ^4,5,6. Oltre alla segnalazione assonale ^4,7,8, la glia periferica, che normalmente avvolge gli assoni, partecipa con successo alla rigenerazione tissutale ^9,10,11. Tuttavia, il ruolo dei tipi cellulari sottorappresentati, come le cellule gliali periferiche, rimane poco compreso nei processi dinamici come la rigenerazione del tessuto cutaneo. Per determinare meglio la funzione di queste cellule, è fondamentale analizzare il microambiente cellulare e i tipi di cellule limitrofe con cui possono interagire durante il processo rigenerativo. Inoltre, poiché la proliferazione cellulare è una fase chiave per la rigenerazione dei tessuti, è importante rilevare e classificare accuratamente i tipi di cellule proliferanti durante il processo di riparazione.

Sono stati sviluppati metodi di imaging ottico multiplexato ad alto contenuto, come IBEX¹², per caratterizzare la composizione cellulare, visualizzare e quantificare le interazioni cellula-cellula e sezionare i modelli microambientali all'interno di tessuti complessi a risoluzione spaziale. Mentre altri metodi di multiplexing richiedono strumenti specializzati e reagenti proprietari, un vantaggio particolare dell'IBEX è che può essere stabilito a costi relativamente bassi utilizzando anticorpi, reagenti e microscopi disponibili in commercio accessibili in un ambiente di ricerca standard. Mentre gli anticorpi anti-Ki-67, spesso utilizzati nei pannelli IBEX, marcano in modo affidabile i tipi di cellule proliferanti in molti tessuti^13,14, il numero di cellule Ki-67-positive (Ki-67+) è risultato essere sottostimato rispetto ad altre metodologie in sezioni fisse di tessuto congelato di ferite cutanee murine acute. Pertanto, abbiamo combinato la chimica Click-iT EdU con IBEX e abbiamo scoperto che il numero di cellule EdU⁺ rappresenta più accuratamente il numero totale di cellule proliferanti ottenute con altre metodologie.

Inoltre, utilizzando un microscopio confocale a disco rotante completamente automatizzato, è stato stabilito un flusso di lavoro ad alta produttività per l'imaging iterativo di sezioni di tessuto inserite in una piastra a 24 pozzetti. Le immagini risultanti vengono quindi elaborate combinando più strumenti Python open source in una nuova pipeline di elaborazione delle immagini che corregge le immagini per un'illuminazione non uniforme, esegue l'unione delle singole tessere e, infine, la registrazione delle immagini. In dettaglio, la libreria BaSiCPy¹⁵ è stata utilizzata per la correzione dell'illuminazione, la libreria m2stitch per lo stitching delle immagini e la correlazione incrociata di fase per la registrazione del ciclo. Le immagini registrate vengono salvate come OME-TIFF e possono quindi essere caricate in software di analisi delle immagini convenzionali, come Fiji¹⁷ e QuPath¹⁸, dove le immagini vengono ulteriormente elaborate e possono essere eseguite la categorizzazione del tipo di cella e altre misurazioni, come i calcoli di intensità e distanza. Nel complesso, il presente protocollo ci ha permesso di eseguire una caratterizzazione dettagliata e altamente efficiente dei principali tipi cellulari della pelle rigenerante, con particolare attenzione al microambiente cellulare che circonda la popolazione di cellule gliali periferiche.

Protocol

Tutti gli allevamenti, la stabulazione e la sperimentazione degli animali sono stati condotti secondo le linee guida dell'ufficio veterinario del Cantone di Zurigo, in Svizzera.

1. Ferite cutanee a tutto spessore (Giorno 0)

1. Indurre topi di 8-10 settimane con isoflurano al 5% in O₂ al 70% e mantenerlo con isoflurano al 2,5%.
2. Radere la pelle della schiena e pulirla accuratamente.
3. Disinfettare prima dell'intervento con sapone antibatterico e soluzione di EtOH al 70%.
4. Applicare l'analgesia preoperatoria utilizzando un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (30 μg∙mg∙^kg-1).
5. Generare quattro ferite escisionali circolari a tutto spessore di 5 mm di diametro sulla parte bassa della pelle della schiena di ciascun animale, due su ciascun lato, a 1 cm dalla linea mediana dell'animale e a circa 2 cm di distanza l'una dall'altra¹⁹.
6. Eseguire l'analgesia postoperatoria con un trattamento di 3 giorni di buprenorfina attraverso acqua potabile (9 μg/mL con saccarosio al 2%).
7. Lascia che le ferite guariscano senza medicare.
8. Raccogliere le ferite in punti temporali definiti per l'esame istologico e l'analisi della citometria a flusso.
9. Per il protocollo IBEX, sezionare e fissare i tessuti cutanei con una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C per una notte. Utilizzare una capsula per biopsia disponibile in commercio per evitare l'arricciamento dei campioni durante la fissazione. Crioproteggere i tessuti fissati al 4% con PFA e saccarosio al 30% in PBS per una notte a 4 °C. Trasferire i tessuti in una miscela 1:1 di saccarosio al 30% con composto O.C.T per 2 ore a RT e infine incorporarli in O.C.T prima del congelamento rapido in isopentano.

2. Preparazione del campione (giorno 1)

1. Rivestire la piastra a 24 pozzetti con 200 μl di gelatina di allume di cromo per 15 minuti su un agitatore a bilanciere. Quindi, rimuovere completamente la gelatina e asciugare i pozzetti ricoperti per 60 minuti in forno a 40 °C. Rivestire il doppio dei pozzetti necessari come backup. Aggiungere 2 mL di PBS per pozzetto.
   NOTA: Assicurarsi che il rivestimento sia completamente asciutto prima di posizionare il fazzoletto. I pozzetti possono anche essere rivestiti un giorno prima e asciugati durante la notte a RT. Una volta rivestito, non conservare i pozzetti rivestiti in frigorifero o nel congelatore e, per ottenere i migliori risultati, utilizzare la piastra rivestita a 24 pozzetti entro 1-2 giorni.
2. Tagliare il tessuto incluso in O.C.T a uno spessore di 15-30 μm al criostato e trasferirlo rapidamente in un pozzetto rivestito contenente 2 mL di PBS.
   NOTA: Il tessuto può essere trasferito utilizzando una spatola metallica o una pinza.
3. Rimuovere con cautela il PBS utilizzando una pipetta da 1 mL, con l'obiettivo di mantenere la sezione di tessuto centrata nel pozzetto. Per farlo in modo efficace, aspirare lentamente il PBS dai bordi del pozzetto, regolando la posizione della pipetta secondo necessità per evitare che il tessuto si sposti.
   NOTA: Il posizionamento preciso del tessuto è essenziale per il successo del protocollo. Una volta che il tessuto aderisce alla superficie rivestita, non può essere riposizionato.
4. Asciugare le sezioni di tessuto per 1 ora in un forno a 37 °C.

3. Blocco tissutale, reazione EdU Click-iT e immunomarcatura anticorpale, ciclo IBEX 1 (Giorno 1)

1. Reidratare con 1 ml di PBS per 5 minuti.
2. Permeabilizzare il tessuto con 500 μl di Triton allo 0,5% in PBS per 30 minuti a RT.
3. Lavare brevemente il fazzoletto 2 volte con PBS.
4. Eseguire la reazione Click-iT, secondo le istruzioni del produttore, per 30 minuti a RT.
   NOTA: Conservare i campioni al riparo dalla luce.
5. Lavare brevemente il fazzoletto 2 volte con PBS.
6. Bloccare il tessuto per 1 ora a temperatura ambiente (RT) utilizzando un tampone bloccante.
   NOTA: Qui, per questo esperimento è stato utilizzato il 10% di siero d'asina in PBS, ma questo può essere regolato secondo necessità; È adatto qualsiasi tampone bloccante compatibile con i protocolli standard di immunomarcatura.
7. Applicare gli anticorpi primari (diluiti in tampone bloccante; vedere la Tabella dei materiali) per il 1° ciclo durante la notte a 4 °C.
   NOTA: Il blocco e l'immunomarcatura possono essere eseguiti anche per ~1 ora utilizzando un forno a microonde non riscaldante, come descritto in Radtke et ^al.12. Tuttavia, per le ferite cutanee, il miglior rapporto segnale/rumore si ottiene quando gli anticorpi primari vengono incubati durante la notte. Le sezioni di tessuto immunomarcate possono essere conservate in PBS per diversi giorni prima dell'imaging. L'imaging è consigliato il giorno successivo per una qualità ottimale del segnale.

4. Immunomarcatura degli anticorpi secondari e controcolorazione nucleare (Giorno 2)

1. Lavare i pozzetti con 3 x 1 mL di PBS.
2. Incubare la sezione di tessuto con la colorazione anticorpale secondaria anti-coniglio (1:300) in soluzione bloccante, insieme alla controcolorazione nucleare Hoechst 1:1.000, per 1 ora a RT al buio.
3. Lavare 3 x 5 minuti con 1 mL di PBS a RT.
4. Lasciare ~500 μL di PBS in ogni pozzetto e portare la piastra al microscopio.
   NOTA: Questo può essere un punto di pausa: i campioni sono stabili per diversi giorni a 4 °C, ma il rapporto segnale/rumore è il migliore se sottoposti a imaging entro 24 ore dall'immunomarcatura.

5. Messa a punto del microscopio e imaging del primo ciclo IBEX (Giorno 2)

1. Accedi al microscopio e carica il software, quindi accedi al profilo utente.
2. Entra nella configurazione di acquisizione (aperta tramite Screening | Acquisition Setup) per la configurazione del protocollo e l'acquisizione delle immagini.
3. Utilizzare il pulsante di espulsione per caricare la lastra nel microscopio.
4. Pulire il fondo della piastra a 24 pozzetti con etanolo al 70% appena prima di posizionare la piastra nel microscopio. Fare clic sul pulsante Carica piastra per caricare la piastra nel microscopio.
5. Selezionare l'ingrandimento e la modalità di acquisizione desiderati in Obiettivo e fotocamera. Come modalità di acquisizione , selezionare la modalità a fessura confocale da 51 μm .
   NOTA: In questo caso, per l'esperimento è stato utilizzato un obiettivo a immersione in acqua 20x con un'apertura numerica di 0,95 e un disco rotante con fori di spillo da 50 μm, distanziati a 250 μm.
6. Nella scheda Piastra (Plate ), selezionate il modello di piastra utilizzato.
7. Vai alla scheda Targa/Siti da visitare. In Opzioni sito, fai clic su Numero fisso di siti. Scegli il numero di colonne e righe in modo tale che sia coperto all'incirca l'intero pozzo. Fai clic su Sovrapponi siti 10%.
   NOTA: Questo pulsante deve essere attivato per garantire la cucitura delle singole piastrelle.
8. Selezionare solo il primo pozzo riempito per l'acquisizione facendo clic con il pulsante destro del mouse sul pozzo corrispondente sulla mappa del pozzo. I pozzetti selezionati sono verdi e i pozzetti deselezionati sono grigi.
9. Sposta il tavolino in una posizione in cui dovrebbe trovarsi il tessuto facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sul primo pozzetto riempito nella mappa della piastra e su un sito vicino al centro nella mappa del sito. Cerca un colore più scuro del pozzo e del sito che indichi la posizione attuale.
10. Vai alla scheda Acquisizione . Selezionare le opzioni Abilita messa a fuoco laser e Acquisisci Serie Z.
11. Vai alla scheda Acquisizione/Messa a fuoco automatica . Per Messa a fuoco automatica da pozzo a pozzetto, selezionare l'opzione Messa a fuoco sulla lastra e sul fondo del pozzetto , e per Messa a fuoco automatica sito, selezionare l'opzione Tutti i siti .
12. Vai alla scheda Lunghezze d'onda e scegli il numero di coloranti da visualizzare nel ciclo corrente. Cerca il numero corrispondente di nuove schede che si aprono sotto la scheda Lunghezze d'onda .
13. Vai alla prima scheda della lunghezza d'onda. In Illuminazione, selezionare le impostazioni del filtro più adatte per il fluoroforo di interesse (ad esempio, scegliere DAPI se è stato utilizzato Hoechst).
14. Scegliere Laser con offset z per il posizionamento z e fare clic sul pulsante Calcola offset per impostare l'altezza di imaging corretta. Una serie di immagini verrà acquisita in diverse posizioni z. Scegli quello in cui il campione è meglio messo a fuoco.
    NOTA: Assicurarsi che la posizione del tavolino sia impostata su una posizione con fazzoletto. Se in questa posizione non è visibile alcun tessuto, selezionare un sito diverso e riprovare (vedere il passaggio 4.9).
15. Premere il pulsante di messa a fuoco e attendere che venga visualizzata un'immagine a fuoco del tessuto.
16. Per Potenza di illuminazione, scegli 50%. Immettere 2000 per Intensità massima target e premere Esposizione automatica per regolare automaticamente il tempo di esposizione.
    NOTA: Per accelerare l'acquisizione, è possibile aumentare la potenza del laser, il che dovrebbe ridurre il tempo di esposizione. Tuttavia, questo potrebbe portare a un maggiore sbiancamento delle foto, che porterà ad artefatti dell'immagine in cui le singole tessere si sovrappongono.
17. Per Serie Z, scegliere Serie Z e Immagine proiezione 2D, mentre per Correzione ombreggiatura, scegliere Solo ombreggiatura FL.
18. Ripeti i passaggi 5.13-5.17 per le altre lunghezze d'onda, ma invece di Laser con offset z, scegli Offset Z da W1 e scegli 0.
19. Vai alla scheda Serie Z . Inserire la dimensione del passo desiderata (per l'obiettivo 20x, utilizzare una dimensione del passo di 0,5 μm).
    NOTA: La velocità di acquisizione può essere aumentata utilizzando una dimensione del passo che sia 2-3 volte il valore consigliato.
20. Fare clic sul pulsante Messa a fuoco e attendere che appaia una freccia con l'etichetta posizione corrente .
21. Fare clic su Avvia Live e attendere che appaia una nuova finestra con le immagini live. Trascinare la freccia della posizione corrente fino a raggiungere la parte inferiore del tessuto e fare clic sul pulsante Imposta B . Trascinare la freccia della posizione corrente fino a raggiungere la parte superiore del tessuto e fare clic sul pulsante Imposta T . Fare clic su F2: Stop.
    NOTA: È possibile scegliere la lunghezza d'onda utilizzata per l'imaging dal vivo in Lunghezza d'onda attiva.
22. Seleziona i siti da acquisire; Innanzitutto, assicurati che la fase si trovi al primo pozzo facendo clic con il pulsante sinistro del mouse su di essa e premi nuovamente Avvia Live . Vai in diverse posizioni all'interno del pozzo facendo clic con il pulsante sinistro del mouse su diversi siti nella mappa del sito. Trova il bordo del tessuto e contrassegna tutti i siti contenenti tessuto per l'acquisizione facendo clic con il pulsante destro del mouse. I siti selezionati saranno verdi e quelli deselezionati grigi.
    NOTA: Per ora, eseguire questa operazione solo per il primo pozzetto e assicurarsi che solo il primo pozzetto sia selezionato per l'acquisizione.
23. Vai alla scheda Esegui . Per il nome della targa, chiamalo "Cycle{i}_Well{w}_{description}"; Sostituisci {i}, {w} e {description} con i valori/description corrispondenti.
24. Fare clic su Salva protocollo e salvarlo, includendo nuovamente "Cycle{i}_Well{w}" nel nome.
25. Impostare le regioni di acquisizione per tutti gli altri pozzi. Per questo, ripetere i passaggi 5.22-5.24.
    NOTA: Per l'acquisizione di ogni pozzetto, è necessario salvare un singolo file di protocollo. Assicurarsi che sia attivato il pozzetto corretto prima di disegnare il nuovo ROI. Il risultato dovrebbe essere un protocollo salvato per pozzo da acquisire. Questo è necessario poiché i tessuti hanno forme diverse da bene a bene. Nel caso in cui il ROI e lo z-stack siano identici tra i pozzetti, la ripetizione dei passaggi 5.22-5.24 può essere saltata e anche i passaggi 5.26-5.29 possono essere saltati. In tal caso, è sufficiente selezionare tutti i pozzetti da riassumere (vedere il passaggio 5.22), andare alla scheda Esegui e premere Acquisisci piastra.
26. Fare clic su Controllo | Giornale | Avvia la registrazione e poi controlla immediatamente | Giornale | Interrompi la registrazione. Salvare il diario creato e riaprirlo tramite Control | Giornale | Modifica diario.
27. Nel pannello di sinistra, trova e fai doppio clic su Acquisizione piastra - Carica protocollo da file e su Acquisizione piastra per aggiungere questi passaggi al journal; Cercali nel pannello di destra. Fare doppio clic sull'opzione Acquisizione piastra - Carica protocollo da file e scegliere il protocollo salvato per il primo pozzetto (vedere il passaggio 5.24).
28. Ripetere il passaggio 5.27 per ogni pozzo da acquisire, caricando sempre il rispettivo protocollo.
29. Cliccare su Salva e infine su Esegui Diario per avviare l'acquisizione (richiede circa 3 ore per acquisire 180 tessere con uno z-stack di 15 μm).

6. Sbiancamento con fluorofori (giorno 2)

1. Circa 30 minuti prima della fine del diario, preparare il reagente sbiancante. Sciogliere 10 mg di Boroidruro di Litio in 10 mL di ddH₂O e passare attraverso un filtro da 0,22 μm. Lasciare agire per 10 minuti, aspettando che si formino delle bolle. Per garantire uno sbiancamento efficiente, utilizzare il reagente sbiancante entro 4 ore dalla preparazione.
   ATTENZIONE: Lavorare sotto una cappa chimica quando si maneggia il boroidruro di litio, poiché può reagire con l'aria e può produrre idrogeno gassoso infiammabile.
2. Sbiancare i fluorofori con 1 mL di 1 mg/mL di boroidruro di litio per 15 minuti mentre esposti a un'illuminazione ambientale standard. Cerca piccole bolle sul tessuto durante la procedura di sbiancamento.
   NOTA: Quando si lavora sotto una cappa chimica, assicurarsi che l'illuminazione non si spenga automaticamente durante la procedura di sbiancamento.
3. Ripetere lo sbiancamento con un altro 1 mL di 1 mg/mL di Boroidruro di litio (preparato dalla stessa soluzione) per 15 minuti.
4. Lavare il pozzetto per 3 x 5 minuti con 1 mL di PBS.
   NOTA: Non ridurre i tempi di lavaggio, poiché la rimozione incompleta del reagente sbiancante potrebbe danneggiare il pannello di anticorpi successivo.

7. Cicli IBEX (Giorno 2)

1. Applicare gli anticorpi primari per il successivo ciclo di immunomarcatura (fase 3.7) e incubare a 4 °C per una notte. Ripetere i passaggi 4.4-5.4.
   NOTA: I passaggi 4.2-4.3 non vengono ripetuti poiché un anticorpo di coniglio non accoppiato viene utilizzato solo nel primo ciclo IBEX. Tuttavia, gli anticorpi non accoppiati allevati in specie meno comuni come il pollo o il porcellino d'India possono essere utilizzati anche nei cicli successivi, poiché il loro anticorpo secondario non reagisce in modo incrociato con gli anticorpi primari accoppiati. I dettagli esatti degli anticorpi utilizzati in ogni ciclo sono disponibili nella Tabella dei materiali.
2. Sul microscopio, caricare le impostazioni del protocollo del precedente ciclo IBEX per il pozzetto corrispondente facendo clic su carica protocollo, salvato sul PC locale come Ciclo{i}_Well{w} (passaggio 5.24). Le impostazioni del protocollo avranno il ROI (piastrelle selezionate da acquisire), l'ingrandimento, le impostazioni di messa a fuoco automatica e qualsiasi impostazione di acquisizione aggiuntiva salvata dal precedente ciclo IBEX (passaggi 5.5-5.25).
3. Seleziona le schede della lunghezza d'onda e regola l'esposizione e la potenza di illuminazione per il nuovo pannello di anticorpi (passaggi 5.12-5.18). Assicurati di visualizzare un marcatore (di solito DAPI o Hoechst) durante tutti i cicli per allineare i cicli successivi.
   NOTA: Come riportato in Radtke et ^al.18, le proteine fluorescenti comunemente usate, come GFP e tdTomato, non sono sensibili allo sbiancamento del boroidruro di litio. Quando si lavora con tessuti che contengono proteine fluorescenti endogene come tdTomato, la lunghezza d'onda corrispondente può essere omessa dall'acquisizione dopo il ciclo 1, se non è necessaria per la registrazione dell'immagine: questo accelererà l'imaging. Le lunghezze d'onda possono essere rimosse nella scheda Lunghezza d'onda complessiva riducendo il numero di canali di acquisizione. Inoltre, non è stato osservato un aumento consistente dell'autofluorescenza tissutale durante i cicli di imaging; Tuttavia, è probabile che questo vari a seconda del tipo di tessuto¹⁸.
4. Controlla se le impostazioni di z-Stack sono ancora ragionevoli e regola di conseguenza (passaggi 5.19-5.21).
   NOTA: Assicurarsi che la dimensione del passo dello z-stack sia la stessa per tutti i cicli.
5. Aggiornare il nome della piastra nella scheda Esegui e salvare nuovamente il protocollo.
6. Ripeti i passaggi 7.2-7.5 per tutti i pozzi da acquisire.
   NOTA: Si consiglia di annotare l'impostazione Esposizione per tutte le lunghezze d'onda utilizzate nel primo pozzetto e di utilizzare la stessa impostazione in tutti i pozzetti successivi.
7. Modificare il journal, selezionare i nuovi file di protocollo e salvare il journal per questo ciclo.
8. Eseguire il journal.
9. Ripetere i passaggi 6.1-6.4 per sbiancare i fluorofori.
10. Ripetere i passaggi 7.1-7.9 fino a raggiungere la quantità desiderata di immunomarcatura.

8. Elaborazione delle immagini (giorno 2)

1. Dopo aver completato l'acquisizione delle immagini dei cicli IBEX, esportare i dati delle immagini:
   1. Seleziona Screening | Utilità per i dati delle lastre | Esporta immagini.
   2. Fare clic su Seleziona piastre e scegliere tutte le piastre acquisite per ogni ciclo e pozzo.
   3. Scegliere Tutti i piani Z, selezionare una directory di output e premere OK per esportare i dati.
      NOTA: I dati verranno esportati come singoli file tiff per ogni piastrella e piano. Per combinare tutte le tessere e i cicli, sono state eseguite le seguenti fasi di lavorazione.
2. Disporre i dati esportati in cartelle secondo il seguente schema: assicurarsi che ogni ciclo sia una cartella, ognuna contenente a volte una cartella per ogni pozzetto. Nomina come segue: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", dove {i} e {well} sono il corrispondente ciclo e well, e * è qualsiasi carattere. Ad esempio: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   NOTA: Per le fasi di elaborazione successive è necessaria una denominazione e una struttura di cartelle corrette.
3. Installa i pacchetti python necessari: usa Miniforge per gestire l'ambiente Python. Vedere https://github.com/conda-forge/miniforge per le istruzioni di installazione.
   NOTA: il codice per le fasi di elaborazione viene fornito sotto forma di Jupyter Notebook. Possono essere trovati in https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove o come file supplementari (File supplementare 1, File supplementare 2, File supplementare 3, File supplementare 4 e File supplementare 5).
4. Quando scarichi il codice da Github, scarica tutti i file facendo clic su Codice | Scarica ZIP e segui le istruzioni di installazione nel file README.md.
5. Avviare Jupyter-Lab (file supplementare 2):
   1. Attivare l'ambiente conda installato inserendo conda activate zmb-ibex-jove in un terminale.
   2. Nel terminale, passare alla directory scaricata inserendo, ad esempio, cd C:\path\to\zmb-ibex-jove.
   3. Avvia Jupyter-Lab inserendo jupyter-lab nel terminale. Si aprirà una finestra del browser con jupyter-lab.
6. Calcola la correzione dell'illuminazione:
   1. Nella scheda a sinistra, vai al taccuino " examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" e aprilo facendo doppio clic su di esso. Questo notebook calcolerà le immagini di correzione dell'illuminazione, utilizzando la libreria BaSiCPy (Supplemental File 3).
   2. Modificare "base_dir" e "save_dir" nei percorsi corretti, dove si trovano i dati e dove devono essere salvate le immagini di correzione dell'illuminazione.
   3. Per eseguire il codice all'interno del notebook, selezionare ogni cella e premere MAIUSC+INVIO per eseguirla. Eseguire il notebook dall'alto verso il basso.
7. Eseguire la cucitura per ogni singolo ciclo (File Supplementare 4):
   1. Nella scheda a sinistra, vai al taccuino successivo e aprilo : "02_stitching_MD.ipynb". In questo taccuino, per ogni ciclo, le singole tessere vengono caricate, l'illuminazione corretta e cucite insieme, ottenendo un file immagine per pozzetto e ciclo. Usa la libreria m2stitch (https://github.com/yfukai/m2stitch) per cucire.
   2. Modificare gli input nella prima cella con i percorsi di file corretti. Eseguire nuovamente il notebook dall'alto verso il basso.
8. Eseguire la registrazione dell'immagine tra i cicli (File supplementare 5):
   1. Nella scheda a sinistra, vai al taccuino successivo e aprilo : "03_registration_pcc.ipynb". In questo quaderno, i singoli cicli sono allineati tra loro utilizzando solo le trasformazioni traslazionali, che vengono calcolate con l'algoritmo di correlazione incrociata di fase dalla libreria di immagini scikit ad accesso aperto (https://scikit-image.org/).
   2. Modificare gli input nella prima cella con i percorsi di file corretti. Scegliere un ciclo di riferimento e un canale di riferimento da utilizzare (in genere DAPI). Eseguire nuovamente il notebook dall'alto verso il basso.
      NOTA: È necessario eseguire solo uno dei capitoli "Opzione 1: Caricare e salvare tutti i canali insieme" e "Opzione 2: Caricare e salvare i canali come singoli file". Il primo capitolo creerà un file di grandi dimensioni, contenente tutti i canali di tutti i cicli. Il secondo capitolo creerà un file individuale per ogni canale. La seconda opzione richiederà meno memoria per l'elaborazione.

9. Analisi delle immagini (giorno 2)

1. Scarica e apri Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   NOTA: Le immagini risultanti saranno immagini multipiano e multicanale, che potrebbero essere analizzate come immagini 3D. Di seguito, viene mostrato un esempio di flusso di lavoro di analisi solo per i dati 2D, per i quali viene prima calcolata una proiezione dell'intensità massima.
2. Apri il file nelle Figi trascinando il file nella finestra delle Figi.
3. Calcola l'intensità massima di proiezione selezionando Immagine | Pile | Z Project..., scegliere Intensità massima e premere ok. Salvare nuovamente l'immagine tramite File | Salva con nome | OME-TIFF".
4. Per analizzare le cellule, utilizzare il software open-source QuPath; Scaricalo e installalo da https://qupath.github.io/.
5. Apri QuPath e crea un nuovo progetto trascinando una cartella vuota sulla finestra.
6. Importa tutti i file nel progetto trascinandoli nella finestra di QuPath e premendo Importa con le impostazioni standard.
7. Fare doppio clic su un'immagine nel pannello di sinistra per aprirla. Specificalo come Fluorescenza quando richiesto.
8. Aprire la finestra Luminosità/Contrasto premendo Maiusc+C.
   NOTA: Qui è possibile selezionare quali canali mostrare e regolare la luminosità e il contrasto. È inoltre possibile modificare i nomi e i colori dei canali facendo doppio clic sui nomi.
9. Seleziona l'icona Strumenti | Poligono e annota la regione del tessuto. Cerca una nuova annotazione nella scheda Annotazioni . Impostalo su una classe specifica selezionando l'annotazione, selezionando una classe (ad esempio, Altro) e premendo Imposta classe.
10. Rileva celle: vai su Analizza | Rilevamento cellulare | Rilevamento cellulare.
    1. Scegli un canale nucleare.
    2. Lascia la maggior parte delle impostazioni così come sono, ma regola la soglia passando il mouse su un nucleo e annotando l'intensità visualizzata nell'angolo in basso a destra. Passa il mouse su una regione di sfondo e nota di nuovo l'intensità. Scegli un valore a metà strada tra lo sfondo e il primo piano come soglia.
    3. Fare clic su Esegui.
11. Ispezione di celle e misurazioni:
12. Facendo doppio clic su una cella o selezionandola nella scheda Gerarchia, controlla le sue misure nel pannello in basso a sinistra. Diverse misure di forma e intensità dovrebbero essere aggiunte per la cellula, il nucleo e il citoplasma.
13. Classificare le cellule:
    1. Per classificare le celle rilevate in base all'intensità in un canale, vai su Classifica | Classificazione degli oggetti | Creare un singolo classificatore di misura.
    2. Selezionare il canale desiderato in Filtro canale e una misurazione appropriata in Misurazione (ad esempio, Cella: Media canale).
    3. Regola la soglia passando nuovamente il mouse su una cella positiva e su una cella negativa e scegliendo un valore tra i due.
    4. Selezionare, ad esempio, Positivo per Sopra soglia e Negativo per Sopra soglia. Controlla il risultato controllando l'anteprima dal vivo.
    5. Premere Applica per classificare le celle.
14. Misurare la distanza da oggetti annotati (ad esempio, fasci nervosi):
    1. Seleziona l'icona Strumenti | Strumento pennello .
    2. Disegna le regioni di interesse (ad esempio, fasci nervosi).
    3. Vai alla scheda Annotazioni . Seleziona tutte le nuove annotazioni, seleziona una classe corrispondente e premi Imposta classe.
       NOTA: È possibile creare una nuova classe facendo clic con il pulsante destro del mouse nella finestra della classe e selezionando Aggiungi/Rimuovi | Aggiungi classe.
    4. Vai a Analizza analisi spaziale | Distanza con segno dalle annotazioni 2D e premere Sì quando richiesto.
    5. Aggiungi una nuova misura a ogni cella, indicando la distanza dall'annotazione più vicina di una determinata classe.
15. Esportazione delle misure:
    1. Vai a Misura | Mostra le misurazioni di rilevamento e attendi che venga visualizzato un elenco di tutte le misurazioni di tutti i rilevamenti.
    2. Esporta la tabella come .txt tramite il pulsante Salva .
    3. Importa i dati nel software di elaborazione dati di tua scelta per essere ulteriormente analizzati.

Results

Questo metodo consente un'adeguata rilevazione dei tipi di cellule proliferanti combinando la chimica EdU Click-iT con IBEX in sezioni fisse di pelle murina congelata. Il rilevamento dei tipi di cellule proliferanti è stato confrontato utilizzando diverse metodologie, in particolare, la marcatura dei tipi di cellule proliferanti con l'anticorpo Ki-67 e il rilevamento della proliferazione cellulare utilizzando l'approccio chimico EdU Click-iT (Figura 1). Abbia...

Discussion

La proliferazione cellulare è una delle quattro fasi principali della riparazione della pelle e la transizione tra la fase infiammatoria e la fase proliferativa è fondamentale per il successo del processo di riparazione²⁰. Una risposta immunitaria ben regolata è essenziale, poiché un'infiammazione prolungata può portare a ferite croniche, un problema di salute globale significativo ^1,21. La proliferazione ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpi e reagenti	FONTE	IDENTIFICATORE	Commenti
Anticorpi
CD31 Alexa Fluor 647 (Ciclo 2)	BioLegend	Cat#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488 (Ciclo 2)	BioLegend	Cat#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (Ciclo 1)	BioLegend	Cat#151212	1:50
AB_2814055
Pollo Ki-67 (CK)	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
Ki-67 rat (rt)	BioLegend	Cat#652402	1:100
AB_11204254
Neurofilamenti H& M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (Ciclo 3)	BioLegend	Cat#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (Ciclo 1)	Tecnologia di segnalazione cellulare	Cat#8238                                            AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488 (Ciclo 3)	BioLegend	Cat#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 asino anti-coniglio	Jackson ImmunoResearch	Gatto #711-605-152
Reagenti
Piastra inferiore in vetro Cellvis a 24 pozzi	Cellvis	P24-1.5H-N
Gelatina di allume cromata	Offerta di nuovi arrivati	Cat#1033A
Click-iT EdU kit	Thermo Fisher Scientific	C10637
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	Cat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, Boridrido di litio, 95%	Thermo Fisher Scientific	Cat#10438443
Composto Tissue-Tek O.C.T Sakura	Biosistemi Svizzera	Cat#7109-4583
PBS	Thermo Fisher Scientific	Cat#10010-015
Vetrina Superfrost Plus Adhesion Microscope & nbsp;	Epredia	Cat#J1800AMNZ
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat#T8787
Equipaggiamento
Spazzola per capelli	Faust AG	Cat#9172051 e 9172050
Lame microtome	Biosistemi Svizzera	Cat#207500011
Microscopio	Dispositivi molecolari, ImageXpress Confocal HT.ai
Forno	Thermo Fisher Scientific	Cat#HBMCR4220
Shaker a rocker	Edmund Bü hler GmbH	Cat#32310015