Il protocollo impiega un campionamento non invasivo delle feci combinato con una reazione a catena quantitativa della polimerasi per offrire un metodo diagnostico conveniente e rapido per l'infezione da Helicobacter pylori e la sua resistenza alla claritromicina e ai chinoloni.
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Articolo metodologico
Rilevamento dell'infezione da Helicobacter pylori e della resistenza agli antibiotici tramite l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi delle feci
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'Helicobacter pylori (H. pylori) è ampiamente diffuso in tutto il mondo, con circa il 50% della popolazione mondiale che ha una storia di infezione da H. pylori. In Cina, il tasso di infezione varia dal 40% al 70%. L'H. pylori è principalmente associato a malattie gastrointestinali come la gastrite cronica, le ulcere gastriche e le ulcere duodenali. Attualmente, il trattamento clinico per l'infezione da H. pylori prevede una tripla o quadrupla terapia. Tuttavia, l'uso estensivo di antibiotici ha portato allo sviluppo di resistenza agli antibiotici in H. pylori. Pertanto, rilevare sia l'H. pylori che la sua resistenza agli antibiotici è fondamentale per guidare il trattamento clinico.
I metodi diagnostici per H. pylori includono il test del respiro dell'urea (UBT), il test dell'antigene, il test sierologico degli anticorpi, l'endoscopia, il test rapido dell'ureasi (RUT) e la coltura batterica. Sebbene i primi tre metodi non siano invasivi, non consentono il recupero batterico e, quindi, non possono essere utilizzati per i test di resistenza. Gli ultimi tre metodi sono invasivi, costosi, richiedono un'elevata competenza tecnica e possono causare danni ai pazienti.
Pertanto, un metodo rapido e non invasivo per il rilevamento simultaneo dell'infezione da H. pylori e della resistenza agli antibiotici è della massima importanza clinica per l'eradicazione efficace di H. pylori. Questo articolo mira a introdurre un protocollo specifico che combina la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) con la tecnologia della sonda fluorescente TaqMan per rilevare rapidamente l'infezione da H. pylori e la resistenza agli antibiotici. Questo metodo fornisce un modo comodo, rapido e non invasivo per diagnosticare l'infezione e la resistenza da H. pylori , a differenza della coltura batterica tradizionale e di altre tecniche. La qPCR viene utilizzata per identificare l'infezione e rilevare mutazioni nei geni 23S rRNA e gyrA , che sono legati alla resistenza rispettivamente alla claritromicina e ai chinoloni. Rispetto alle tecniche di coltura convenzionali, questo approccio offre un metodo non invasivo, economico ed efficiente in termini di tempo per rilevare l'infezione da Helicobacter pylori e determinarne la resistenza agli antibiotici.
Introduzione
L'Helicobacter pylori è un batterio gram-negativo, a forma di spirale, che può infettare in modo persistente l'epitelio gastrico umano1. Nel 1994, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha classificato H. pylori come cancerogeno di gruppo 1 per il cancro gastrico, con ~3% degli individui infetti che alla fine hanno sviluppato la malattia2. Una revisione sistematica pubblicata di recente ha indicato che nell'ultimo decennio è stata osservata una tendenza generale all'aumento del tasso di resistenza agli antibiotici di H. pylori , che ha raggiunto livelli allarmanti in tutto il mondo, in particolare la resistenza alla claritromicina3. In Cina, gli ultimi dati dell'indagine hanno mostrato che la prevalenza aggregata di H. pylori tra i cinesi urbani è del 27,08%; i tassi di resistenza per claritromicina e levofloxacina sono stati del 50,83% e del 47,17%4, che sono superiori a quelli degli Stati Uniti (levofloxacina 37,6%, claritromicina 31,5%)5e dell'Europa (levofloxacina 15,8% e claritromicina 21,4%)6. Di conseguenza, la diagnosi e il trattamento precoci e accurati sono fondamentali. Tuttavia, la crescente resistenza agli antibiotici di H. pylori riduce considerevolmente l'efficacia del trattamento, evidenziando l'urgente necessità di una ricerca continua sulla sua diagnosi e trattamento.
I metodi diagnostici di H. pylori sono classificati in tecniche invasive e non invasive7. I metodi invasivi includono l'esame istopatologico, il test rapido dell'ureasi (RUT) e la coltura batterica8. L'esame istopatologico si basa sull'elaborazione e l'osservazione microscopica di campioni bioptici, con un'accuratezza limitata dalla preparazione istologica e dall'esperienza patologica9. RUT rileva H. pylori attraverso l'attività dell'ureasi, che idrolizza l'urea per produrre ammoniaca, determinando uno spostamento alcalino nel reagente, indicando così la presenza del batterio9. È semplice ed economico. La coltura batterica, considerata il "gold standard", ha spesso un tasso di successo inferiore al 50% a causa delle caratteristiche fisiologiche uniche di H. pylori10.
I metodi non invasivi includono il test del respiro dell'urea 13C/14C (UBT), la diagnosi sierologica e il test dell'antigene fecale (SAT)11. Il test del respiro funziona secondo un principio simile a quello del RUT, rilevando la CO2 marcata isotopicamente nell'aria espirata per confermare l'infezione12. La diagnosi sierologica rileva gli anticorpi, che possono persistere dopo l'eradicazione batterica, rendendo difficile valutare l'efficacia del trattamento13. Il test dell'antigene fecale rileva gli antigeni specifici di H. pylori nei campioni fecali, fornendo un metodo affidabile e non invasivo con un tasso inferiore di falsi positivi e una buona precisione per la diagnosi di infezioni attive14.
Ogni metodo diagnostico ha i suoi vantaggi e limiti15. Oltre alla coltura batterica, altri metodi faticano a rilevare la resistenza agli antibiotici, mentre la coltura è ostacolata da bassi tassi di successo16. Recentemente, i metodi diagnostici molecolari come la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) sono stati ampiamente applicati alla rilevazione microbica17. La qPCR è in grado di rilevare con precisione l'H. pylori e di analizzare le mutazioni dei geni di resistenza, offrendo una visione più completa dell'infezione18.
Le sonde fluorescenti sono progettate per legarsi in modo specifico a una sequenza target nel DNA durante il processo di qPCR. Queste sonde sono tipicamente marcate con un colorante fluorescente, che emette un segnale quando la sonda si lega al suo bersaglio e viene scissa dalla polimerasi durante l'amplificazione. Ciò fornisce una misurazione in tempo reale del processo PCR. Le sonde fluorescenti sono note per la loro elevata specificità grazie al design unico della sonda, che garantisce che venga rilevata solo la sequenza di DNA bersaglio, riducendo le possibilità di legame aspecifico e migliorando la specificità del saggio. Ciò rende la tecnologia delle sonde fluorescenti particolarmente utile per rilevare bersagli a bassa abbondanza, come il DNA di Helicobacter pylori , in campioni di feci. Sebbene SYBR Green sia un colorante legante il DNA comunemente usato nella PCR, può legarsi a qualsiasi DNA a doppio filamento, il che può causare un'amplificazione non specifica e falsi positivi.
La coltura di Helicobacter pylori da campioni clinici non fornisce direttamente dati sulla resistenza agli antibiotici. Al contrario, la qPCR basata su sonda fluorescente è più veloce, più conveniente e può essere adattata per il rilevamento simultaneo di marcatori di H. pylori e resistenza agli antibiotici. Questo metodo non solo fornisce risultati più rapidi rispetto ai metodi di coltura tradizionali, ma consente anche il rilevamento simultaneo dei geni di resistenza agli antibiotici, migliorando notevolmente l'efficienza e la convenienza del rilevamento. Questo metodo fornisce un modo comodo, rapido e non invasivo per diagnosticare l'infezione e la resistenza da H. pylori , a differenza della coltura batterica tradizionale e di altre tecniche.
Ci sono due questioni cruciali che devono essere considerate per l'antibiotico-resistenza all'H. pylori : i) la consistenza del genotipo e del fenotipo, ii) la multifarmaco-resistenza. Uno studio multicentrico su larga scala in Cina ha rilevato che i modelli di doppia resistenza per claritromicina/levofloxacina erano del 26,1%. I fenotipi e i genotipi dell'H pylori resistenti alla claritromicina e alla levofloxacina hanno mostrato un accordo soddisfacente (coefficiente kappa = 0,810 e 0,782, rispettivamente)19. Pertanto, è possibile utilizzare il metodo qPCR per rilevare l'infezione da H. pylori e la resistenza ai farmaci. I metodi del test dell'antigene delle feci (SAT) e qPCR sono sempre più utilizzati a causa della comodità del campionamento. La sensibilità, la specificità e l'accuratezza dei metodi per la rilevazione di H. pylori sono le seguenti: qPCR > UBT > SAT > RUT> CagA IgG > coltura20. Tutti i metodi non invasivi sono adatti per lo screening primario. Poiché la qPCR può inoltre rilevare i geni di resistenza ai farmaci, la qPCR e la coltura saranno più adatte per guidare il trattamento.
Altri approcci innovativi, come gli algoritmi di intelligenza artificiale (AI) combinati con immagini endoscopiche21, la microfluidica digitale22 e RPA-CRISPR/Cas12a23, mostrano teoricamente una buona efficienza diagnostica e prospettive applicative promettenti. Tuttavia, la qPCR è attualmente la tecnica di biologia molecolare più sofisticata con il potenziale per fornire una soluzione superiore per la diagnosi e il trattamento delle infezioni da H. pylori .
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Protocollo
Questo studio aderisce alle linee guida etiche stabilite dal Comitato etico dell'Ospedale del popolo provinciale del Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou, Cina (Approvazione n.: KY2024-445-01). Informazioni dettagliate sui materiali utilizzati in questa ricerca (reagenti, sostanze chimiche, attrezzature e software) sono disponibili nella Tabella dei materiali.
1. Selezione dei partecipanti
- Scegli i partecipanti nella fascia di età compresa tra i 18 e i 60 anni.
- Scegli i partecipanti che possono sottoporsi a screening per l'infezione da Helicobacter pylori , come i pazienti che presentano sintomi come gastrite, ulcere peptiche o dispepsia, nonché gli individui asintomatici.
- Escludere dallo studio i pazienti che hanno utilizzato antibiotici, agenti contenenti bismuto (come capsule di citrato di bismuto di potassio, capsule di pectina di bismuto colloidale o compresse composte di bismuto e alluminio) o farmaci cinesi antimicrobici nell'ultimo mese, o coloro che hanno utilizzato inibitori della pompa protonica o antagonisti del recettore H2 (come omeprazolo, pantoprazolo, rabeprazolo, cimetidina o nizatidina) nelle ultime 2 settimane. Escludere anche le donne durante il periodo mestruale dallo studio.
2. Raccolta di campioni fecali
NOTA: Fornire la sezione 2 come istruzioni ai partecipanti.
- Verificare che l'imballaggio esterno del kit di campionamento sia integro ed entro la data di scadenza. Rimuovere i materiali dal kit.
- Metti una carta bianca per la raccolta delle feci nella tazza del water e defeca (per evitare la contaminazione con l'urina).
- Usando una spatola, raccogliere una porzione di feci delle dimensioni di una fava (~5 g) e trasferirla nel contenitore del campione.
- Posizionare la spatola di campionamento, insieme al campione fecale, nella provetta di raccolta, assicurandosi che il livello del liquido salga vicino alla linea di campionamento indicata sulla provetta.
- Serrare saldamente il tappo del tubo. Capovolgere la provetta più volte per garantire una miscelazione completa del campione con la soluzione conservante.
- Conservare il campione in refrigerazione fino alla consegna al laboratorio clinico per la successiva identificazione di H. pylori e la valutazione dei profili di resistenza agli antibiotici tramite qPCR.
3. Estrazione dell'acido nucleico
NOTA: Completare tutte le procedure all'interno di una cabina di biosicurezza per evitare la contaminazione.
- Capovolgere la provetta di conservazione dei campioni e mescolare accuratamente. Trasferire 1,0 mL della soluzione del campione fecale in una provetta per microcentrifuga.
- Dopo aver mescolato le provette da centrifuga, metterle in un bagno metallico a 80 °C per 10 minuti, con miscelazione intermittente per 30 s al quinto minuto. Una volta che le provette si sono raffreddate a temperatura ambiente, centrifugare a 10.000 × g per 5 minuti e raccogliere il surnatante per l'ulteriore lavorazione.
- Capovolgere più volte la piastra a 96 pozzetti per risospendere le microsfere magnetiche. Rimuovere con cautela la guarnizione in foglio di alluminio, facendo attenzione a non scuotere per evitare fuoriuscite.
- Aggiungere 200 μl del campione preparato (dal passaggio 3.2) a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti contenente il tampone di lisi, assicurandosi che ogni pozzetto corrisponda a un singolo campione. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nell'apposito scomparto del campione dello strumento di estrazione dell'acido nucleico per l'estrazione automatizzata.
- Conservare i campioni rimanenti e i campioni di acido nucleico estratti a -20 °C per la conservazione a lungo termine e l'uso futuro.
4. qPCR Rilevazione degli acidi nucleici Helicobacter pylori e mutazioni di resistenza alla claritromicina e ai chinoloni
- Prelevare i reagenti dall'area di stoccaggio dei reagenti e scongelarli a temperatura ambiente.
NOTA: Questo kit è stato utilizzato per la rilevazione qualitativa dell'acido nucleico di H. pylori , comprese le mutazioni nel gene 23S rRNA (A2143G, A2143C, A2144G) e nel gene gyrA (261A, 261G, 260T, 271A, 271T, 272G). I primer, le sonde, l'enzima Taq, l'enzima UNG e i dNTP erano disponibili nel kit. I geni bersaglio di H. pylori e della β-actina umana sono stati inclusi nel controllo di qualità positivo. Il geneumano della β-actina è stato scelto come controllo di qualità interno. - In base al numero di campioni da testare, utilizzare N + 2 copie del reagente liofilizzato, dove N rappresenta il numero di campioni da testare e 2 rappresenta i QC negativi e positivi.
- Centrifugare brevemente per assicurarsi che la polvere liofilizzata si depositi sul fondo delle provette. Aprire il coperchio del reagente liofilizzato (facendo attenzione ad evitare qualsiasi fuoriuscita della polvere) e aggiungere 25 μL per pozzetto degli acidi nucleici estratti dai campioni da testare, nonché i controlli positivi e negativi. Chiudere bene i tubi.
- Agitare i reagenti PCR per 8-10 s, quindi centrifugare brevemente per 3-5 s per evitare la formazione di bolle.
- Posizionare la piastra qPCR a 96 pozzetti sulla macchina qPCR. Impostare il programma ciclico come segue: in primo luogo, incubare la miscela di reazione (contenente primer, sonde, Taq polimerasi, enzima UNG, dNTP, ecc.) a 42 °C e 95 °C (entrambe le fasi in un ciclo) per 2 minuti; quindi, ciclo 10x con 10 s a 95 °C e 45 s a 65 °C; infine, ciclo 35x con 10 s a 95 °C e 45 s a 58 °C per la denaturazione, la ricottura e l'estensione.
- Impostare i parametri di rilevamento del segnale di fluorescenza come segue: marcatura fluorescente ROX di geni conservati da H. pylori ; marcatura fluorescente FAM dei geni di resistenza alla claritromicina di H. pylori ; marcatura fluorescente HEX di geni di resistenza ai chinoloni di H. pylori ; e la marcatura fluorescente CY5 del gene della β-actina umana sono stati utilizzati come controllo interno del kit. Raccogli dati a 58 °C. Al termine della reazione, assicurarsi che i dati vengano salvati per analisi future.
- Analizza i dati utilizzando un software specifico per qPCR, poiché lo strumento seleziona automaticamente la soglia di base. Impostare tutti i criteri diagnostici, inclusa la presenza di infezione o resistenza da Helicobacter pylori , su un valore CT ≤30; confermare che presentano una caratteristica curva a forma di S.
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Risultati
Applicazione della qPCR per il rilevamento dell'infezione da Helicobacter pylori e della resistenza agli antibiotici in campioni fecali
Abbiamo progettato primer e sonde basati su mutazioni puntiformi nei geni conservati di Helicobacter pylori, così come nel gene 23S rRNA e nel gene gyrA . Questi primer e sonde sono stati marcati con diversi coloranti fluorescenti e quindi utilizzati per il rilevamento qPCR. ...
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Discussione
Negli ultimi anni, i metodi di rilevamento molecolare sono stati ampiamente applicati nel campo della microbiologia, alterando significativamente la gestione clinica di diverse malattie infettive. Questi metodi operano a livello genetico, consentendo non solo la conferma della presenza batterica, ma anche la tipizzazione genetica e i test di resistenza agli antibiotici. La PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale (qPCR) è sempre più apprezzata grazie al suo breve tempo di elaborazi...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato dalla Research Foundation for Advanced Talents del Guangdong Provincial People's Hospital [Grant No. KY012023293]. Questo lavoro è stato supportato da Jiangsu Mole Bioscience Co. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA | Armadio di biosicurezza |
| Tubo monouso per la raccolta e la conservazione delle feci | Mole | Raccogli campioni fecali | |
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuga il liquido residuo dalla parete della provetta | |
| Helicobacter pylori kit per il rilevamento delle mutazioni dell'acido nucleico, della claritromicina e della resistenza ai chinoloni | Mole | Rilevamento dell'infezione da Helicobacter pylori e della resistenza agli antibiotici; reagente liofilizzato di H. pylori (contenente primer, sonde, Taq polimerasi, enzima UNG, dNTP, ecc.), un controllo positivo per H. pylori (contenente Helicobacter pylori e geni bersaglio della β-actina umana) e un controllo negativo per H. pylori (contenente geni bersaglio della β-actina umana) | |
| Mole 96M estrattore automatico di acidi nucleici | Mole | Per l'estrazione | |
| del DNAPer | estrarre l'acido nucleico, contiene tampone di lisi (sale di guanidina, tris idrossimetilamnomethane, Tween-20, cloruro di sodio), Wash Buffer 1 (cloruro di sodio), Wash Buffer 2 (tris idrossimetil aminomethane, Tween-20), Wash Buffer 3 (microsfere magnetiche, Tween-20), Wash Buffer 4 (acqua priva di nucleasi) e Elution Buffer (tris idrossimetil aminomethane), insieme a un rack magnetico | ||
| SLAN Sistema di analisi PCR medico completamente automatico | HONGSHI | Analisi dei dati | |
| SLAN-96S Macchina per PCR in tempo reale | HONGSHI | Amplificazione PCR quantitativa fluorescente Congelatori | |
| bassissima temperatura (DW-YL450) | MELING | SEDA | 20172220091-20 ° C per la conservazione dei reagenti |
| Vortex-5 | Kylin-bell | Per la miscelazione dei reagenti |
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