È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Raccolta di esosomi rilasciati naturalmente dal tessuto tumorale

595 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/67739

⸱

10 giugno 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra un nuovo metodo per estrarre gli esosomi dai tessuti tumorali rilasciandoli naturalmente e raccogliendoli ripetutamente per fornire una base sperimentale per lo studio della funzione degli esosomi nello sviluppo del tumore.

Abstract

Come vescicole secrete dalle cellule, gli esosomi racchiudono e trasferiscono vari acidi nucleici, proteine e lipidi e partecipano alla comunicazione tra le diverse cellule. Gli esosomi nel microambiente tumorale svolgono un ruolo importante nelle caratteristiche biologiche delle cellule tumorali e possono influenzare fortemente gli stati di altre cellule. Pertanto, per studiare ulteriormente le funzioni specifiche degli esosomi nello sviluppo dei tumori, è senza dubbio necessario estrarre e isolare gli esosomi dai tessuti tumorali. L'estrazione diretta di esosomi dal tessuto tumorale riduce la necessità di colture cellulari in vitro e gli esosomi dal tessuto tumorale possono essere più simili a quelli allo stato naturale. Pertanto, il mantenimento dello stato naturale degli esosomi nel tessuto tumorale è la chiave del processo di estrazione. La digestione enzimatica è spesso combinata con l'ultracentrifugazione per estrarre gli esosomi dai tessuti tumorali. Qui, forniamo un nuovo metodo per estrarre gli esosomi dal tessuto tumorale. Abbiamo utilizzato un terreno privo di siero per incubare piccoli pezzi di tessuto tumorale su una tavola vibrante, raccolto ed estratto ripetutamente gli esosomi rilasciati naturalmente dal tessuto tumorale e identificato la struttura, la concentrazione e le caratteristiche degli esosomi estratti, fornendo un nuovo metodo per i ricercatori che studiano la funzione degli esosomi nello sviluppo del tumore.

Introduzione

Gli esosomi sono un sottotipo di vescicole extracellulari secrete dalle cellule, tipicamente di dimensioni comprese tra 30 nm e 200 nm 1,2. Partecipano alla comunicazione intercellulare e forniscono varie molecole di segnalazione, tra cui acidi nucleici (ad esempio, acido desossiribonucleico (DNA), RNA messaggero (mRNA), acido micro ribonucleico (miRNA), RNA lungo non codificante (lncRNA), RNA circolare (circRNA)), proteine e lipidi 1,3,4,5, alle cellule riceventi per influenzare le loro funzioni fisiologiche 6,7. Inizialmente identificati nei reticolociti8 delle pecore, gli esosomi sono stati successivamente identificati in vari fluidi corporei, tra cui sangue, saliva, urina, liquido cerebrospinale, ascite, liquido amniotico e latte materno 9,10,11,12,13,14,15,16 . Inoltre, gli esosomi possono essere secreti da molti tipi di cellule, tra cui linfociti, macrofagi, mastociti, cellule adipose e cellule tumorali17. Con la loro ampia distribuzione, gli esosomi svolgono un ruolo critico in vari processi patologici, in particolare il cancro, e in vari processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la riparazione e la rigenerazione dei tessuti e la regolazione immunitaria 18,19,20.

Negli ultimi anni, è stato dimostrato che gli esosomi promuovono l'insorgenza del tumore, l'invasione, le metastasi, la resistenza alla chemioterapia e l'immunità anti- o pro-tumorale 20,21,22. Gli esosomi derivati dal cancro possono attivare l'espressione genica nei recettori o nelle cellule tumorali vicine per modificare i loro fenotipi biologici e le cellule tumorali possono interagire con le cellule stromali nel microambiente tumorale per promuovere la proliferazione, l'invasione e l'angiogenesi delle cellule tumorali 23,24,25. Gli esosomi rilasciati dalle cellule tumorali possono aiutarle a espellere farmaci tossici e gli esosomi derivati dalle cellule stromali possono promuovere la formazione di cellule tumorali20. Gli esosomi derivati dal cancro sono coinvolti in varie fasi delle metastasi delle cellule tumorali, tra cui l'invasione dei tessuti vicini, il trasferimento attraverso il sistema circolatorio e la diffusione in organi distanti20. Infine, gli esosomi svolgono sia funzioni di immunoattivazione che di immunosoppressione nel cancro, a seconda dei ligandi, delle proteine e dei miRNA che trasportano20. A causa delle importanti funzioni degli esosomi derivati dal tessuto tumorale, mostrano un potenziale valore applicativo nella diagnosi precoce, nel trattamento accurato e nel monitoraggio prognostico dei tumori21,22.

Data l'importanza degli esosomi derivati dal tessuto tumorale, molti ricercatori hanno tentato di estrarli per studiarne ulteriormente le proprietà e le funzioni. L'estrazione diretta degli esosomi dai tessuti tumorali non solo riduce la necessità di colture cellulari in vitro, ma assomiglia anche più da vicino allo stato naturale degli esosomi. Pertanto, il mantenimento dello stato naturale degli esosomi nel tessuto tumorale è la chiave del processo di estrazione. Le proprietà fisiche degli esosomi sono alla base dei comuni metodi di estrazione e raramente vengono considerati i cambiamenti nei componenti degli esosomi causati dalla stimolazione durante il processo di estrazione. Infatti, la qualità degli esosomi è fortemente influenzata dalle diverse procedure di estrazione degli esosomi26,27. Attualmente, i tessuti tumorali vengono digeriti da enzimi e sottoposti a metodi come la centrifugazione con gradiente di densità, l'ultracentrifugazione, l'ultrafiltrazione, la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), la precipitazione polimerica, la cromatografia di immunoaffinità e i metodi microfluidici, prima della separazione 2,21,28,29 . Qui, forniamo un metodo per estrarre gli esosomi dal tessuto tumorale. Abbiamo utilizzato un terreno privo di siero per coltivare piccoli blocchi di tessuto tumorale in uno shaker, quindi abbiamo raccolto ed estratto gli esosomi rilasciati naturalmente dal tessuto tumorale e identificato la concentrazione e le caratteristiche degli esosomi estratti, fornendo materiali di base e prove sperimentali per studiare la funzione degli esosomi nello sviluppo del tumore.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutti gli esperimenti relativi agli esosomi del tessuto tumorale sono stati condotti secondo le linee guida e le normative pertinenti. Questo studio è stato approvato e condotto dalle linee guida del Comitato Etico del West China Hospital, Sichuan University (20220301101). Quattro settimane dopo l'inoculazione con cellule SGC-7901, un topo nudo (BALB/c, maschio, 8 settimane, 26 g) è stato soppresso tramite lussazione cervicale.

1. Acquisizione del tessuto tumorale

  1. Immergere in alcool al 75% per 5 min.
  2. Spostarsi su un tavolo operatorio sterile, utilizzare forbici chirurgiche sterili per aprire la pelle esterna del tumore ectopico.
  3. Staccare il tessuto tumorale ectopico, quindi tagliare e pesare per ottenere due pezzi di uguale peso.
    NOTA: Un pezzo di tessuto tumorale viene utilizzato per l'estrazione dell'esosoma nell'ambito di questo protocollo e un altro pezzo di tessuto tumorale di uguale peso viene utilizzato per l'estrazione dell'esosoma mediante digestione enzimatica30.

2. Precondizionamento del tessuto tumorale

NOTA: Eseguire questi passaggi su ghiaccio e in un ambiente sterile.

  1. Pipettare 10 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) preraffreddato (0,01 M) per lavare il tessuto tumorale e rimuovere il sangue e il grasso superficiali.
  2. Tagliare il tessuto tumorale (~400 mm3) in pezzi di 1-2 mm utilizzando le forbici oftalmiche in 20 mL di PBS con 2 mM di acido etilendiammino tetraacetico (EDTA) in una piastra di Petri sterile da 10 cm. Trasferire la miscela di cui sopra in una provetta conica da 50 mL.

3. Rilascio di esosomi

  1. Centrifugare la provetta dal punto 1.2 a 200 × g per 5 minuti a 4 °C.
  2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 20 mL di terreno α α-MEM (Minimum Essential Medium). Incubare a 37 °C a 100 giri/min per 1 ora in agitatore a temperatura costante.
  3. Centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C.
  4. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con 10 mL di terreno α-MEM. Incubare a 37 °C a 100 giri/min per 6 ore in agitatore a temperatura costante.
    NOTA: Sii gentile con tutti i passaggi. Una breve incubazione e un lavaggio con terreno α-MEM sono sufficienti per rimuovere i componenti intracellulari che fuoriescono a causa del taglio, comprese le vescicole intracellulari e gli organelli.
  5. Centrifugare a 200 × g per 5 min, 4 °C e raccogliere il surnatante in una nuova provetta.
  6. Risospendere il tessuto tumorale con 10 mL di terreno α-MEM.
  7. Ripetere l'incubazione dal passaggio 2.4 seguito dal passaggio 2.5.
  8. Mescolare i surnatanti medi raccolti nei passaggi 2.5 e 2.7.
    NOTA: Sii gentile con tutti i passaggi. Due incubazioni di 6 ore hanno indotto il rilascio naturale di esosomi dai pezzi di tessuto tumorale.

4. Ultracentrifugazione

  1. Filtrare il surnatante attraverso un filtro microporoso da 0,45 μm.
  2. Centrifugare il surnatante a 12.000 × g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere le vescicole più grandi.
  3. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 120.000 × g per 90 minuti a 4 °C per raccogliere gli esosomi.
  4. Lavare il precipitato dell'esosoma con PBS (0,01 M) e centrifugare nuovamente a 140.000 × g per 60 minuti a 4 °C.
  5. Sospendere gli esosomi precipitati in PBS (0,01 M) per l'uso immediato o la conservazione a -80 °C.
    NOTA: Sii gentile con tutti i passaggi. Eseguire ogni passaggio con la forza centrifuga più piccola possibile e il tempo centrifugo più breve.

5. Presentazione dei risultati dell'identificazione degli esosomi

  1. Identificare la morfologia degli esosomi dal tessuto tumorale tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM)30.
  2. Determinare le dimensioni e la concentrazione degli esosomi dal tessuto tumorale tramite l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)30.
  3. Identificare i marcatori proteici esosomiali CD9 e CD63 tramite western blot (WB)30.
    NOTA: Linee guida recenti per la ricerca sugli esosomi, incluso l'uso di CD63, CD9, come criteri per i marcatori esosomi31.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La TEM ha rivelato che gli esosomi derivati dal tessuto tumorale con questo metodo avevano strutture tipiche a forma di coppa (Figura 1A) e non c'era alcuna differenza significativa tra la forma degli esosomi estratti con questo metodo e la digestione enzimatica (Figura 1B). I risultati dell'NTA hanno rivelato che il diametro medio dell'esosoma era di 172,8 nm, che era compreso tra 30 e 200 nm ed era coerente con le dimensioni degli esosomi; la concentrazione di...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

In questo metodo, gli esosomi derivati dal tessuto tumorale sono stati estratti dai tessuti del cancro gastrico ectopico di topi nudi e i passaggi chiave sono stati il rilascio, l'essudazione, la separazione e la purificazione degli esosomi. Vari metodi di separazione degli esosomi sono stati progettati e verificati in base alle proprietà fisiche e alla composizione degli esosomi 2,21,28,29, ciascuno con vantaggi e svantaggi, ma lo scopo è quello di ri...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di supporto scientifico e tecnologico della provincia del Sichuan (2024NSFSC0592, 2023YFS0064).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
α-MEMHyCloneSH30265.01B
Anticorpo anti-CD63Biossbsm-43117M
Anticorpo anti-CD9Biossbs-2489R
Provetta da centrifugaThermo339650
Agitatore a temperatura costanteThermoMAXQ4450
Pipetta sterile monouso - 10 mLJET
EDTABiosharpBS107
Pipetta elettricaThermo9501
Centrifuga orizzontale a temperatura controllataThermoSorvall ST1R plus
Analizzatore di tracciamento di nanoparticelleMalvinNanoSight Pro
Forbice oftalmicaJinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
Acido fosfotungstico   Sigma455970-10G
Forbice chirurgicaJinzhongJ21010
Anticorpo secondarioBiossBs-0295GCapra Anti-coniglio IgG H& Microscopio elettronico a trasmissione L/FITC
NikonPlan Apo WF
Tubo ultracentrifugoBeckman355618
GSP01001

Riferimenti

  1. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduct Target Ther. 5, 144(2020).
  3. Rani, S., O'Brien, K., Kelleher, F., Corcoran, C., Germano, S., Radomski, M., et al. Isolation of exosomes for subsequent mRNA, MicroRNA, and protein profiling. Methods Mol Biol. 784, 181-195 (2011).
  4. Zhou, L., et al. The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancer. Cancer Lett. 407, 84-92 (2017).
  5. D'Agostino, E., et al. Exosomal microRNAs: Comprehensive methods from exosome isolation to miRNA extraction and purity Analysis. MicroRNA Profiling. 2595, 75-92 (2022).
  6. Whiteside, T. Tumor-derived exosomes and their role in cancer progression. Adv Clin Chem. 74, 103-141 (2016).
  7. Ludwig, N., Whiteside, T., Reichert, T. Challenges in exosome isolation and analysis in health and disease. Int J Mol Sci. 20 (19), 4684(2019).
  8. Johnstone, R., Adam, M., Hammond, J., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  9. Li, B., Cao, Y., Sun, M., Feng, H. Expression, regulation, and of exosome-derived miRNAs in cancer progression and therapy. FASEB J. 35 (10), e21916(2021).
  10. Caby, M., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17, 879-887 (2015).
  11. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  12. Street, J., et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med. 10, 5(2012).
  13. Palanisamy, V., et al. Nanostructural and transcriptomic analyses of human saliva derived exosomes. PLoS ONE. 5, e8577(2010).
  14. Runz, S., et al. Malignant ascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24 and EpCAM. Gynecol Oncol. 107, 563-571 (2007).
  15. Keller, S., et al. CD24 is a marker of exosomes secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int. 72, 1095-1102 (2007).
  16. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  17. Simpson, R., Lim, J., Moritz, R., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  18. Sung, B. H., Parent, C. A. Extracellular vesicles: Critical players during cell migration. Dev Cell. 56, 1861-1874 (2021).
  19. Xie, Q., et al. Exosome-mediated immunosuppression in tumor microenvironments. Cells. 11 (12), 1946(1946).
  20. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  21. Jiang, Z., Wang, H., Mou, Y., Li, L., Jin, W. Functions and clinical applications of exosomes in pancreatic cancer. Mol Biol Rep. 49 (11), 11037-11048 (2022).
  22. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annu Rev Biochem. 88 (1), 487-514 (2019).
  23. Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFR VIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10, 619-624 (2008).
  24. Nazarenko, I., et al. Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 70, 1668-1678 (2010).
  25. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
  26. Macias, M., et al. Liquid biopsy: from basic research to clinical practice. Adv Clin Chem. 83, 73-119 (2018).
  27. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10, 1039(2020).
  28. Hu, J., et al. Application exosomes as nanocarriers in cancer therapy. J Mater Chem B. 11 (44), 10595-10612 (2023).
  29. Wang, C., et al. A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1006374(2022).
  30. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  31. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  32. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  33. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. J Extracell Vesicles. 5, 32945(2016).
  34. Li, W., et al. Comparison of the yield and purity of plasma exosomes extracted by ultracentrifugation, precipitation, and membrane-based approaches. Open Chem. 20, 182-191 (2022).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Esosomi tumoraliisolamento degli esosomiestrazione degli esosomimicroambiente tumoraleultracentrifugazionedigestione enzimaticacomunicazione cellularecaratterizzazione degli esosomiterreno privo di siero

Questo articolo è stato pubblicato

Video in arrivo

Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.