Articolo metodologico

Istituzione e convalida di un modello di ratto di ipertensione arteriosa polmonare associata a fibrosi polmonare

DOI:

10.3791/67747

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23 maggio 2025

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1State Key Laboratory of Respiratory Diseases, National Center for Respiratory Medicine, Guangdong Key Laboratory of Vascular Diseases, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Guangzhou Institute of Respiratory Health, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 3GMU-GIBH Joint School of Life Sciences, Guangzhou Medical University, 4Guangzhou laboratory, Guangzhou International Bio Island

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, viene introdotto il metodo di induzione dell'ipertensione arteriosa polmonare associata alla fibrosi polmonare (PF-PH) modello di ratto iniettando bleomicina nelle vie aeree. Forniamo anche un approccio graduale per convalidare questo modello animale.

Abstract

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I pazienti con fibrosi polmonare sono a maggior rischio di sviluppare ipertensione polmonare, una complicanza con prognosi infausta. Allo stato attuale, il meccanismo di questo collegamento è ancora poco compreso. Uno dei principali ostacoli al progresso in questo settore è la mancanza di un modello animale affidabile per replicare la PF-PH. Questo studio mirava a stabilire un modello stabile di ratto PF-PH. I ratti sono stati digiunati durante la notte prima dell'intervento. In anestesia con pentobarbital di sodio (45 mg/kg), la trachea è stata intubata con un tubo PE50 inserito a una profondità di 3 cm (la distanza tra la glottide e il tubo). La bleomicina (BLM) è stata somministrata per via intratracheale in dose singola (5 mg/kg, disciolta in 0,2 ml di NaCl allo 0,9%). Dopo l'iniezione, i ratti sono stati immediatamente ruotati per garantire una distribuzione uniforme del BLM. A 35 giorni dall'iniezione di BLM, i ratti hanno mostrato una progressiva compromissione della funzione polmonare e un aumento della pressione sistolica ventricolare destra e dell'ipertrofia ventricolare destra, rivelando le caratteristiche patologiche dell'ipertensione polmonare. Forniamo un metodo generale e affidabile per stabilire un modello di PF-PH su ratto.

Introduzione

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L'ipertensione polmonare (PH) dovuta a malattia polmonare interstiziale (ILD) è comune clinicamente, con una prevalenza stimata dal 10% all'80% nei pazienti con fibrosi polmonare idiopatica (IPF), ed è anche frequentemente osservata in altre ILD fibrotiche 1,2. Numerosi studi hanno dimostrato che lo sviluppo dell'PH è legato a una morbilità sostanziale e a una ridotta sopravvivenza 3,4,5. Rispetto all'ipertensione arteriosa polmonare (PAH) di gruppo 1, la patogenesi dell'ipertensione arteriosa polmonare associata alla fibrosi polmonare (PF-PH) rimane poco conosciuta6. Lo scopo di stabilire un modello animale di PF-PH nei ratti è quello di fornire un quadro affidabile per la ricerca scientifica sulla fibrosi polmonare associata all'ipertensione polmonare e di esplorare potenziali strade per applicazioni terapeutiche cliniche.

La bleomicina è un classico induttore della fibrosi polmonare ampiamente utilizzato nei modelli animali7. Ulteriori ricerche di Blackburn et al.8 e del nostro laboratorio9 hanno rivelato che la bleomicina può anche innescare caratteristiche patologiche tipiche dell'ipertensione polmonare, come l'aumento della pressione sistolica del ventricolo destro (RVSP) e l'ipertrofia ventricolare destra. Meccanicisticamente, la bleomicina induce fibrosi parenchimale polmonare, vasocostrizione ipossica e una riduzione della densità del letto vascolare polmonare, portando così allo sviluppo di ipertensione polmonare6. Inoltre, abbiamo osservato una significativa perdita di cellule endoteliali vascolari polmonari a partire dal giorno 7 di trattamento con bleomicina, con questa perdita che peggiora progressivamente nel corso dell'esperimento9. Questo fenomeno suggerisce che la disfunzione endoteliale vascolare polmonare indotta da bleomicina può svolgere un ruolo potenziale nell'inizio e nella progressione dell'ipertensione polmonare.

A causa della fibrosi interstiziale polmonare, i pazienti con IPF sono in uno stato di ipossia per lungo tempo e si verificano cambiamenti compensatori nei vasi cardiopolmonari, che portano all'ipertensione polmonare6. L'uso di modelli animali può aiutarci a comprendere ulteriormente i meccanismi alla base della fibrosi polmonare idiopatica umana associata all'ipertensione polmonare. Sebbene questo modello non possa simulare completamente le caratteristiche patologiche della malattia umana, questo modello può comunque fornire informazioni preziose. Esistono molti modelli sperimentali che simulano la fibrosi polmonare, come l'infusione di bleomicina in una singola dose per le vie aeree, la somministrazione di vettori virali di fattori di crescita trasformanti e l'esposizione alla silice 8,10. Allo stato attuale, il modello BLM è il modello più utilizzato e caratterizzato perché può essere facilmente indotto in breve tempo e ha un'elevata riproducibilità. Inoltre, i cambiamenti temporali nella fibrosi polmonare sono stati valutati in un modello murino di bleomicina, dove è stato osservato un aumento dell'espressione di marcatori di fibrosi e geni associati alla patologia della malattia, come Col1A1 e Col1A2, dai giorni 15-218. Alterazioni cardiovascolari, come l'ipertrofia ventricolare destra e un aumento significativo della RVSP, sono state rilevate a partire dal giorno 3311. Allo stesso tempo, il nostro laboratorio ha precedentemente valutato le variazioni dei parametri di PH e PF di modelli di ratto indotte dalla bleomicina9. Abbiamo scoperto che, oltre alle caratteristiche della fibrosi polmonare (PF) come la progressiva compromissione della funzione polmonare e la deposizione di collagene nei ratti, le caratteristiche tipiche dell'ipertensione polmonare (PH) sono emerse gradualmente entro 7-35 giorni dopo una singola instillazione di bleomicina nelle vie aeree. L'indice RVSP e l'indice di Fulton hanno mostrato un aumento della dipendenza dal tempo. Attualmente, in letteratura sono stati riportati vari animali con fibrosi polmonare. Alcuni esperti hanno suggerito che i modelli di ratto hanno mostrato una risposta fibrotica più pronunciata rispetto ai modelli murini12. Pertanto, al fine di studiare meglio la progressione della fibrosi polmonare combinata con l'ipertensione polmonare, un modello di ratto indotto da bleomicina è la chiave.

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Protocollo

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Gli esperimenti sugli animali descritti in questo studio sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del primo ospedale affiliato dell'Università di medicina di Guangzhou (numero di approvazione etica: 2018-456).

1. Approvvigionamento di ratti da esperimento

  1. Dividi i ratti in due gruppi: il gruppo di controllo normale e il gruppo modello, con 7 ratti in ogni gruppo. Utilizzare ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) di 10 settimane del peso di 200 ± 20 g per lo studio

2. Induzione del modello di ratto PF-PH

  1. Al fine di prevenire aspirazioni rigurgitante durante la procedura, digiunare i ratti durante la notte prima della modellazione.
  2. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (45 mg/kg) per garantire l'accuratezza e la sicurezza delle procedure e ridurre al minimo il dolore e lo stress degli animali. Confermare i livelli di anestesia chirurgica in base alla mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi. Allo stesso tempo, applica un unguento sugli occhi dei ratti per prevenire la secchezza.
  3. Intubare la trachea del ratto con un tubo PE50 inserito a una profondità di 3 cm (la distanza dalla glottide al tubo).
  4. Utilizzando una siringa da 1 ml (26 G), aspirare 0,2 ml di bleomicina (5 mg/kg, disciolta in 0,2 ml di NaCl allo 0,9%). Iniettare la siringa contenente BLM nelle vie aeree attraverso una cannula in un'unica dose. Per i ratti nel gruppo di controllo, eseguire la somministrazione intratracheale di soluzione fisiologica normale sterile (0,2 ml). Durante questo processo, i ratti non hanno bisogno di sollievo dal dolore.
  5. Per garantire una distribuzione uniforme della bleomicina, posizionare il ratto in posizione supina, tenerlo delicatamente e ruotarlo lentamente. L'angolo di rotazione consigliato è di 30°-45°, alternato tra i lati. Ogni rotazione deve essere mantenuta per 10-15 s, ripetuta 3x-4x.
  6. Posiziona i ratti su cuscinetti riscaldanti per aiutare a mantenere la temperatura corporea e monitorare attentamente il loro stato. Osserva quando i ratti iniziano a muoversi da soli e trasferisci gli animali dal termoforo a una gabbia separata per il recupero.
  7. Dopo 5 settimane di iniezione di BLM, valutare i ratti per determinare se il modello PF-PH può essere stabilito con successo utilizzando metodi come il monitoraggio ecocardiografico, le misurazioni emodinamiche e l'analisi istologica.

3. Monitoraggio ecocardiografico

  1. Anestetizzare i ratti utilizzando isoflurano al 4%. Rimuovi il pelo del topo con una crema depilatoria e applica il gel ad ultrasuoni sul petto.
  2. Valutare i parametri funzionali e strutturali del cuore destro nei ratti con una sonda ultrasonica da 250 MHz. Per ottenere la migliore visuale dell'asse lungo del ventricolo, posizionare la sonda sul lato sinistro della linea mediana del torace dell'animale.
  3. In base all'anatomia individuale, ruotare la sonda di 15° in senso antiorario rispetto alla linea parasternale sinistra, con l'incisivo rivolto verso la spalla destra, e regolare gli assi x e y in modalità B in modo che l'intero cuore si trovi al centro del campo visivo.
  4. Selezionare Colore per visualizzare il colore del flusso sanguigno per distinguere l'arteria polmonare (il segnale del flusso sanguigno dell'arteria polmonare in questa posizione è blu).
  5. Selezionare la modalità PW (PW Doppler), posizionare la linea di campionamento sotto la valvola polmonare e ruotare la manopola dell'angolo PW per regolare la direzione della linea di campionamento in modo che la direzione di campionamento sia parallela alla direzione del flusso sanguigno dell'arteria polmonare (circa 25°). Premere nuovamente il tasto PW e ottenere il tempo di accelerazione/eiezione del flusso sanguigno dell'arteria polmonare (PAT/PET). Misurare almeno cinque cicli cardiaci e fare la media. Usa Cine per salvare l'immagine.
  6. Regolare l'animale su una testa bassa e un piede alto, posizionare la sonda a ultrasuoni all'apice del cuore dell'animale e guidare l'ecografia lungo l'apice del cuore per ottenere la superficie incisale a quattro camere. Regolare gli assi x e y in modalità B per assicurarsi che le quattro camere cardiache siano visibili.
  7. Visualizzare la linea di misurazione 2 volte tenendo premuta la modalità M e posizionarla all'incrocio tra l'anello della valvola tricuspide e la parete libera del ventricolo destro. Misurare la distanza di spostamento della valvola tricuspide (TAPSE) entro almeno tre cicli cardiaci e conservarla in Cine.
  8. Posizionare la sonda sulla linea mediana della clavicola destra del torace dell'animale e regolare l'angolo tra la sonda e la tacca del torace dell'animale a circa 45°. Regolare l'immagine in modalità B in modo che il ventricolo ventricolare destro e il setto interventricolare siano visibili.
  9. Selezionare M-Mode per visualizzare la linea di misurazione 2x e posizionare la linea di misurazione al centro del setto interventricolare. La linea di campionamento era perpendicolare alla parete libera del ventricolo destro. Salvare l'immagine per ottenere lo spessore della parete libera del ventricolo destro.

4. Stima della funzione polmonare

  1. Aprire il software PFT e verificare che il dispositivo venga riconosciuto. Calibrare secondo le istruzioni dell'apparecchiatura per garantire l'accuratezza dei sensori di flusso e di pressione. Impostare i parametri del test nel software PFT, come la frequenza respiratoria, il volume corrente, la durata del test, ecc.
  2. La modalità di rilevamento degli animali è la modalità per gli studi sui ratti. Accendere l'interruttore dello strumento di controllo principale e assicurarsi che l'interruttore di ciascun amplificatore di segnale sia in posizione off.
  3. Impostare il flusso d'aria in base al peso corporeo dell'animale. Accendere il dado di regolazione del flusso d'aria di aspirazione e impostare l'inspirazione su 5. Accendere il dado di regolazione del flusso d'aria espiratorio e impostare l'espirazione lenta su -4. Impostare il valore della pressione a 60 cm H2O e quindi calibrare lo strumento secondo l'ordine di flusso FRC, flusso, flusso alto e pressione polmonare con un errore inferiore allo 0,5%.
  4. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale con pentobarbital sodico (45 mg/kg) come al punto 2.2. Taglia la pelle lungo il centro del collo e rimuovi il muscolo strato per strato.
  5. Nella parte superiore esposta della trachea cervicale, praticare un'incisione orizzontale tra gli anelli della cartilagine tracheale. Inserire rapidamente la cannula metallica nell'incisione tracheale, assicurandosi che la cannula sia posizionata correttamente e sicura. Utilizzare suture di filo di seta 4-0 per fissare la cannula alla trachea, impedendole di scivolare o spostarsi. Posizionare il ratto nello scomparto per animali PFT e collegare la cannula tracheale all'interfaccia del canale del flusso d'aria all'esterno dello strumento.
  6. Fare clic sul pulsante Avvia ed esaminare la capacità vitale forzata (FVC) e la compliance polmonare dinamica. Per garantire la coerenza dei dati, registrare ogni indicatore almeno 3 volte.
  7. Al termine del test, i dati vengono salvati ed esportati nel software di analisi. Utilizzare un software statistico per analizzare i dati e confrontare i parametri della funzione polmonare di diversi gruppi.

5. Misure emodinamiche e istologiche

  1. Rilevamento della pressione sistolica ventricolare destra (RVSP)
    1. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale con pentobarbital sodico (45 mg/kg) come al punto 2.2. Confermare che il ratto sia stato adeguatamente anestetizzato pizzicando l'alluce per assicurarsi che il ratto non risponda. Fissare l'addome del ratto verso l'alto sul banco sperimentale e applicare una crema per gli occhi sugli occhi del ratto per prevenire la secchezza.
    2. Praticare un'incisione (circa 4 cm) sul lato destro del collo con le forbici chirurgiche e separare la vena giugulare esterna con una pinza microchirurgica. Separare delicatamente le vene con una lunghezza di circa 1 cm con micro-pinze e inserire due linee chirurgiche alle estremità distale e prossimale.
    3. Prima dell'intubazione, immergere la provetta PE50 in soluzione fisiologica contenente eparina sodica all'1% o EDTA per almeno 30 minuti. Regolare il registratore fisiologico per riportare la pressione sulla linea 0 e regolare l'intervallo di pressione su 0-150 mmHg.
    4. Legare l'estremità distale della vena giugulare esterna con filo di seta 4-0, sollevare delicatamente la linea chirurgica prossimale e posizionarla sulla parete della vena distale. Usa delle piccole forbici per fare una piccola incisione (circa 0,3 mm). Dopo aver inserito il tubo PE50 nella vena giugulare esterna, utilizzare un filo di seta 4-0 per legare il catetere insieme alla vena giugulare esterna per evitare perdite di sangue.
    5. Osservare la forma d'onda della pressione venosa sul registratore. Spingendo lentamente il catetere nell'atrio destro, la forma d'onda dell'atrio destro è visibile, con un'ampiezza di circa 0-5 mmHg. Dopo che il catetere continua ad avanzare dall'atrio destro al ventricolo destro, è possibile osservare la forma d'onda della pressione del ventricolo destro. Quando la pressione è stabile, registrare RVP per 5 minuti e i dati vengono salvati e analizzati con un software di analisi.
  2. Rilevamento dell'indice di Fulton
    1. Dopo il rilevamento di RVSP, dopo l'anestesia con isoflurano (5%, 2 L/min O2), sopprimere i ratti attraverso il dissanguamento.
    2. Dopo la toracotomia, rimuovere il cuore intatto del ratto con una pinzetta. Taglia il padiglione auricolare e il tessuto connettivo vicino al cuore con le forbici.
    3. Tagliare la parete libera del ventricolo destro lungo l'arteria polmonare. Questo tessuto è il ventricolo destro (RV). I tessuti rimanenti sono il ventricolo sinistro più il setto interventricolare (LV+S). Dopo la separazione, drenare la superficie del ventricolo destro (RV) e del ventricolo sinistro più il setto interventricolare (LV+S) con carta da filtro e pesare separatamente utilizzando una bilancia analitica. Dopo aver registrato il peso del ventricolo destro (RV) e del ventricolo sinistro più il setto ventricolare (LV+S), calcolare il rapporto di peso tra il ventricolo destro e il ventricolo sinistro più il setto ventricolare (RV/(LV+S)).
  3. Colorazione istologica
    1. Dopo aver aperto la cavità toracica, utilizzare una siringa da 10 ml per prelevare 3 ml di soluzione fisiologica. Inserire la siringa nell'arteria polmonare e iniettare lentamente la soluzione salina per lavare i polmoni, rimuovendo sangue e altri residui.
    2. Usa le forbici per sezionare il lobo accessorio destro e il lobo anteriore destro del polmone. Posizionare questi due lobi polmonari in formalina al 4% per la fissazione e preservare la morfologia e la struttura del tessuto. Posizionare rapidamente i tre lobi rimanenti del polmone (come il polmone sinistro, il lobo medio destro e il lobo posteriore destro) nell'azoto liquido per la conservazione congelata, pronti per gli esperimenti successivi.
    3. Rimuovere il grasso in eccesso e il tessuto connettivo dalla superficie del tessuto polmonare per garantire che i blocchi di tessuto siano puliti e ordinati. Tagliare i lobi polmonari in piccoli blocchi di 5 mm x 5 mm x 3 mm. Posizionare i blocchi di tessuto rifilati nell'essiccatore e disidratarli gradualmente utilizzando una serie di gradienti di alcol (60%, 70%, 80%, 90%, 100%).
    4. Immergere il tessuto polmonare nello xilene per 2 ore per ottenere la trasparenza. Dopo la rimozione, immergerlo in paraffina fusa a 56-58 °C per 2 ore per garantire la completa infiltrazione. Quindi, posizionare il fazzoletto in uno stampo, posizionandolo con la superficie di taglio rivolta verso il basso per il successivo sezionamento.
    5. Affettare il blocco di cera sul microtomo con uno spessore di 4-8 μm13 e conservarlo a temperatura ambiente per la colorazione patologica.
    6. Eseguire la colorazione tricromica di Eosin e Masson14.

6. Rilevazione dell'idrossiprolina (HYP)

  1. Pesare 30-100 mg di tessuto polmonare in una provetta di vetro. Aggiungere 2 mL di soluzione di acido cloridrico (6 mol/L) e digerire a 110 °C in forno per 2-6 ore fino a quando non sono visibili grumi di grandi dimensioni.
  2. Dopo il raffreddamento, regolare il valore del pH nell'intervallo 6-8 utilizzando 1 mL di soluzione di NaOH (10 mol/L), quindi condensare l'acqua distillata in 4 mL di soluzione. Infine, centrifugare a 28,620 x g a 25 °C per 20 min e assumere il surnatante.
  3. Preriscaldare il lettore di micropiastre per 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda a 560 nm e azzerare lo strumento utilizzando acqua distillata.
  4. Diluire la soluzione standard con acqua distillata per preparare soluzioni standard con concentrazioni di 30, 15, 7,5, 3,75, 1,875, 0,938, 0,469 e 0,234 μg/mL.
  5. Prelevare 60 μl di surnatante del campione e mescolarlo con 60 μl di reagente A, quindi lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 20 minuti.
  6. Aggiungere 60 μl di reagente B e 120 μl di acqua distillata. Mettere la soluzione miscelata a bagnomaria a 60 °C per 20 minuti. Seguire gli stessi passaggi per ogni concentrazione delle soluzioni standard (ad esempio, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,875, 0,938, 0,469, 0,234 μg/mL) ed eseguire le operazioni di conseguenza.
  7. Dopo essere rimasti a temperatura ambiente per 15 minuti, prelevare 200 μl della soluzione nella piastra a 96 pozzetti per rilevare il valore di assorbimento della luce a 560 nm. Tracciare la curva standard con la concentrazione delle soluzioni standard come asse x e i valori misurati come asse y, ottenendo l'equazione y=kx+b. Sostituire il valore misurato del campione nell'equazione per determinare la concentrazione del campione.

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Risultati

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Fibrosi polmonare indotta da bleomicina nei ratti
La bleomicina è stata segnalata come un classico induttore della fibrosi polmonare in modelli animali7. Qui, gli indici di fibrosi polmonare sono stati valutati dopo la stimolazione BLM. In primo luogo, dopo 35 giorni di trattamento con BLM, abbiamo condotto test di funzionalità polmonare e abbiamo scoperto che sia la FVC (Figura 1E) che la compliance polmonare dinamica (Figura ...

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Discussione

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La fibrosi polmonare idiopatica è una malattia progressiva e fatale con una sopravvivenza mediana di 2-3 anni dalla diagnosi, suggerendo una prognosi infausta9. L'ipertensione polmonare è una comorbilità comune dell'IPF, che peggiora rapidamente l'IPF con una prognosi peggiore15. Inoltre, c'erano opzioni terapeutiche limitate per IPF-PH7. Pertanto, è essenziale acquisire una comprensione più profonda dei meccanismi m...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dispongono di informazioni finanziarie rilevanti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82370063, 82170069, 82120108001, 82241012), del programma di ricerca e sviluppo del Guangzhou National Laboratory (GZNl2023A02013), del National Key R&D Program of China (2022YFE0131500), del Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Guangdong (2024A1515011208, 2022A1515012052, 2024A1515013104, 202102020019, 202201020538, 202201010069, 2023A03J0334), il progetto indipendente del laboratorio chiave statale di malattie respiratorie (SKlRD-Z-202513), la Guangdong Medical Research Foundation (A2023379) dell'Università di medicina di Guangzhou e il piano per migliorare la ricerca scientifica in GMU e i fondi di ricerca aperti del sesto ospedale affiliato dell'Università di medicina di Guangzhou (Qingyuan People's Hospital) (202201-101).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BleomicinaMedChemExpressHY-17565A
Agente di accoppiamentoHYNAUTBX-CSRH
Fissativo in formalinaBiosharp)BL401B
Crema depilatoriaLUSENLS-B-TMG-50
Kit di colorazione ematossilina eosina (HE)BeyotimeC0189S
IsofluranoRWD Life Science ( Cina)R510-22-10
Kit di tintura tricolore MassonBeyotimeC0189S
Soluzione salina normaleKERONGSLYS-001
siringaBeyotimeFS701-50 pezzi

Riferimenti

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