Profilazione degli O-glicani di mucina permetilata mediante spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il rilascio di O-glicani dalle mucine e la successiva desalinizzazione, permetilazione e analisi mediante spettrometria di massa MALDI-TOF.

Abstract

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) è un potente strumento per la profilazione dei glicani della mucina che offre un'elevata sensibilità e produttività. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'analisi dei glicani legati all'O dalle mucine utilizzando MALDI-TOF MS, che comprende il rilascio di glicani, la desalinizzazione, la permetilazione e l'acquisizione e l'analisi dei dati. Questo studio dimostra che la desalinizzazione basata sulla cromatografia a scambio ionico porta a un migliore recupero di glicani più grandi e a una migliore qualità degli spettri prodotti rispetto all'estrazione in fase solida utilizzando carbonio grafitato poroso (PGC). Inoltre, questo lavoro suggerisce che un tempo di reazione di permetilazione più lungo di quello attualmente impiegato potrebbe essere necessario per una modifica efficiente delle strutture sialilate. Dimostriamo anche l'importanza e la necessità dei dati di frammentazione e della conoscenza preliminare delle vie biosintetiche degli O-glicani per l'identificazione accurata della composizione e della struttura dei glicani e discutiamo i benefici e i limiti intrinseci che MALDI-TOF presenta nell'analisi degli O-glicani della mucina.

Introduzione

Le mucine sono grandi glicoproteine che costituiscono la maggior parte dei componenti strutturali del muco. Sono prodotti da cellule epiteliali specializzate chiamate cellule caliciformi e subiscono un'estesa O-glicosilazione prima di essere secrete sulla superficie della mucosa. La glicosilazione delle mucine avviene nell'apparato di Golgi, dove una famiglia di glicosiltransferasi specializzate, polipeptidi-N-acetilgalattosamina transferasi (ppGalNAc-T) avvia il processo legando un residuo di GalNAc a una serina (Ser) o a una treonina (Thr)¹. Quindi, un arsenale di glicosiltransferasi estende le strutture dei glicani aggiungendo residui di galattosio (Gal), N-acetilglucosamina (GlcNAc), GalNAc, acido N-acetilneuraminico (Neu5Ac) e fucosio (Fuc), mentre altri enzimi che modificano i carboidrati possono effettuare reazioni come la solfatazione dei glicani¹. I glicani che rivestono la spina dorsale delle proteine della mucina si trovano principalmente in cluster nelle regioni proteiche ricche di residui di Ser e Thr, poiché i gruppi ossidrilici sulla catena laterale di questi residui fungono da siti di O-glicosilazione. Questa densa glicosilazione conferisce alle mucine l'aspetto di uno "spazzolino" ed è responsabile delle loro proprietà fisiche, come la capacità di trattenere grandi quantità di acqua, la loro capacità di gelificare e l'elevata viscoelasticità ^2,3. Grazie a queste proprietà, le mucine forniscono lubrificazione, proteggono l'epitelio dalla disidratazione e dalle lesioni fisiche e formano una barriera fisica tra l'epitelio e il suo microambiente ^4,5. I glicani della mucina possono anche fungere da siti di legame e fonte di carbonio per batteri commensali o patogeni ^6,7,8. L'organizzazione e la composizione del muco sono fondamentali per proteggere l'epitelio mantenendo i microbi vicini ma lontani dalla superficie dell'epitelio. I glicani della mucina partecipano anche alla comunicazione e all'adesione cellula-cellula⁹.

I glicani della mucina svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi della mucosa e i profili aberranti di glicosilazione della mucina sono associati a una compromissione della funzione barriera, un'alterata composizione del microbiota, un aumento delle metastasi tumorali, una malattia infiammatoria intestinale (IBD) e altre malattie 10,11,12. Pertanto, lo studio della glicosilazione della mucina è importante per comprendere il ruolo del muco e delle mucine nella salute umana e può portare a nuovi approcci alla gestione o al trattamento delle malattie.

Le tecniche basate sulla spettrometria di massa sono tra le opzioni più popolari per lo studio dei glicani della mucina. MALDI-TOF MS è una tecnica di ionizzazione morbida che consente l'analisi di biomolecole non volatili di grandi dimensioni come glicani e glicoproteine¹³. Questo approccio offre un'elevata sensibilità e un'ampia gamma di massa, consentendo il rilevamento e l'identificazione di miscele di glicani poco abbondanti e diversificate. Inoltre, i modelli di frammentazione ottenuti da esperimenti di spettrometria di massa tandem (MS/MS) possono fornire preziose informazioni strutturali sulla composizione e la sequenza dei glicani¹³.

Tipicamente, l'analisi dei glicani legati all'O dalle mucine mediante MALDI-TOF MS comporta un flusso di lavoro in più fasi, in cui gli O-glicani vengono prima rilasciati chimicamente dalla spina dorsale proteica utilizzando metodi come l'eliminazione riduttiva della β, quindi desalinizzati per rimuovere i sali dal rilascio chimico e derivatizzati per migliorare la ionizzazione e il rilevamento. I glicani purificati e derivatizzati vengono quindi co-cristallizzati con un'opportuna matrice MALDI su una piastra target MALDI e vengono acquisiti spettri di massa che forniscono informazioni sulle masse degli ioni glicano intatti. Successivamente, i glicani vengono frammentati in esperimenti MS/MS per fornire informazioni sulla struttura dei glicani¹⁴. Qui forniamo un protocollo dettagliato per rilasciare, desalinizzare e permetilare glicani e analizzarli mediante MALDI-TOF MS.

Protocollo

NOTA: Vedere la Figura 1 per una rappresentazione schematica del flusso di lavoro.

Figura 1: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Rilascio di glicani

1. Preparazione del tampone per l'eliminazione β
   NOTA: Questo deve essere preparato fresco prima di ogni utilizzo.
   1. Pesare un pellet di idrossido di sodio (NaOH) e scioglierlo in una quantità adeguata di H₂O in una provetta da 50 mL per ottenere una soluzione 0,1 M.
   2. In una provetta da 5 mL, sciogliere 189 mg di boroidruro di sodio (NaBH₄) in 5 mL della soluzione alcalina preparata sopra al punto 1.1.1.
      ATTENZIONE: NaOH è corrosivo e NaBH₄ è corrosivo, tossico, infiammabile e rappresenta un pericolo per la salute. Entrambi i prodotti chimici devono essere maneggiati sotto una cappa chimica utilizzando idonei dispositivi di protezione individuale. Non sciogliere NaBH₄ direttamente in H₂O, poiché si decompone e rilascia idrogeno che può essere autoinfiammato.
2. Impostazione della reazione di eliminazione β
   1. In un flaconcino di vetro da 4 mL, sciogliere fino a 100 μg di mucine purificate in 250 μL di H₂O.
      NOTA: Alcune mucine potrebbero non dissolversi completamente e formare invece una sospensione di particelle molto piccole.
   2. Aggiungere 250 μl di tampone per l'eliminazione del β e chiudere bene la fiala con un tappo rivestito in PTFE. Incubare la reazione a 45 ^oC per 16 ore.
3. Fermare la reazione
   1. In un flacone di vetro da 100 ml, aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale a 95 ml di H₂O (concentrazione del 5% (v/v)).
      NOTA: Questo può essere conservato a temperatura ambiente e riutilizzato.  ATTENZIONE: L'acido acetico è infiammabile e corrosivo e deve essere utilizzato in una cappa chimica con i necessari dispositivi di protezione individuale.
   2. Sul ghiaccio, aggiungere 1 mL della soluzione di acido acetico al 5% a ciascuna reazione (passaggio 1.2.3) in modo gocce. A questo punto, cerca l'effervescenza dovuta al rilascio di idrogeno dall'eccesso di NaBH₄. Se l'effervescenza non si è fermata dopo l'aggiunta di 1 mL di acido acetico al 5%, ripetere questo passaggio.
      NOTA: Se non c'è effervescenza dopo l'aggiunta del 5% di acido acetico, la reazione di eliminazione del β potrebbe essere incompleta o non riuscita.
4. Dissalazione dei campioni
   1. In un flacone di vetro da 100 mL, preparare una sospensione densa di resina scambiatrice di cationi, forma H⁺ , 200-400 mesh in acido acetico al 5% (v/v).
   2. Collegare una pipetta di vetro con una piccola quantità di lana di vetro. Aggiungere 1,5 mL di sospensione di resina sulla pipetta di vetro dall'alto e lasciarla riposare e scolare. Questo renderà la colonna di desalinizzazione.
   3. Lavare la resina con 2 mL di acido acetico al 5%. Scartare il flusso.
   4. Aggiungere il campione di mucina alla colonna di desalinizzazione. Raccogliere il flusso in una provetta da 5 mL.
   5. Sciacquare le fiale del campione con 1 mL di acido acetico al 5% e caricarlo sulla colonna di desalinizzazione. Raccogliere il flusso nello stesso tubo.
   6. Lavare la colonna 2 volte con 1 mL di acido acetico al 5%. Raccogliere il flusso nello stesso tubo.
   7. Utilizzare un evaporatore centrifugo per rimuovere l'acido acetico e concentrare i campioni (5 mbar, 30 ^oC, 2 h).
   8. Congelare i campioni a -80 ^oC e asciugarli per una notte su un liofilizzatore.
      NOTA: In alternativa, l'evaporazione centrifuga può continuare fino all'essiccazione, ma renderà più difficile la ridissoluzione dei campioni.
   9. In un flacone di vetro da 100 ml, aggiungere 5 ml di acido acetico a 95 ml di metanolo (concentrazione del 5% (v/v)).
      ATTENZIONE: Il metanolo è infiammabile e tossico. Deve essere utilizzato in una cappa aspirante con i necessari dispositivi di protezione individuale.
   10. Sciogliere i campioni in 0,5 mL di acido acetico metanolico ed essiccare i campioni sotto un flusso di azoto. Ripeti questo passaggio 3-5 volte. Conservare i campioni essiccati a 4 ^oC.
5. Permetilazione dei glicani
   1. In un flaconcino di vetro da 8 mL, miscelare una soluzione di NaOH al 50% (0,2 mL) con 0,4 mL di metanolo e agitare accuratamente. Si formerà un precipitato bianco che si dissolverà rapidamente di nuovo.
   2. Utilizzando una siringa di vetro, aggiungere 4 mL di dimetilsolfossido anidro (DMSO) e agitare accuratamente.
   3. Centrifugare la soluzione per 2 minuti a 2.000 × g. Questo formerà un gel sul fondo del tubo, una fase liquida nel mezzo e i sali accumulati nella parte superiore.
   4. Decantare accuratamente il surnatante e i sali, senza disturbare il gel.
   5. Ripetere i passaggi 1.5.2-1.5.4 5 volte fino a quando non si formano più sali. Se i sali si attaccano alle pareti del tubo, agitare delicatamente il tubo per portare i sali in sospensione, senza disturbare il gel sul fondo, oppure rimuoverli utilizzando una pipetta di vetro Pasteur.
   6. Dopo che non si sono più formati sali, risospendere il gel in 4 mL di DMSO anidro. Questa sospensione è la base della permetilazione.
      NOTA: Questa quantità di base di permetilazione è sufficiente per ~25 campioni. Le quantità possono essere modificate di conseguenza.
   7. Ai campioni essiccati, aggiungere 100 μl di DMSO anidro e 150 μl di base di permetilazione. Utilizzando una pipetta di vetro, aggiungere 80 μL di iodometano il più rapidamente possibile, per evitare l'assorbimento di umidità dall'ambiente.
      ATTENZIONE: Lo iodometano è tossico e rappresenta un pericolo per la salute e l'ambiente. Deve essere utilizzato in una cappa aspirante con i necessari dispositivi di protezione individuale.
   8. Incubare le reazioni di permetilazione per 30 minuti a temperatura ambiente agitando energicamente.
   9. Aggiungere 0,5 mL di H₂O per terminare la reazione. I campioni diventeranno torbidi.
      NOTA: Se i campioni non diventano torbidi, è possibile che la reazione di permetilazione sia stata incompleta.
   10. Sciacquare i campioni con azoto fino a quando non diventano limpidi.
   11. Caricare i campioni su una piastra di estrazione a 96 pozzetti (60 mg) idrofila-lipofila bilanciata (HLB) o su cartucce HLB. Applicare una pressione positiva per spingere i campioni attraverso la fase solida a una velocità di flusso di ~1 mL/min. Se si utilizzano cartucce HLB, utilizzare una tettarella di gomma o un collettore a vuoto per applicare pressione ai campioni. Scartare il flusso.
   12. Lavare i pozzetti con 2 x 1 mL di H₂O. Applicare una pressione positiva ed eliminare il flusso.
   13. Eluire i glicani dalla piastra HLB utilizzando 1 mL di metanolo. Applicare la pressione solo fino a quando il metanolo inizia a fuoriuscire dalla piastra. Quindi, il flusso di gravità è sufficiente per fornire la portata richiesta. Raccogli il flusso.
   14. Ripetere ancora una volta la fase di eluizione.
   15. Essiccare i campioni utilizzando un evaporatore centrifugo
   16. In un flaconcino di vetro da 4 mL, preparare il tampone TA50 mescolando 1 mL di acetonitrile, 998 μL di H₂O e 2 μL di acido trifluoroacetico.
       ATTENZIONE: L'acetonitrile è infiammabile e l'acido trifluoroacetico è corrosivo. Entrambi devono essere utilizzati in una cappa aspirante, utilizzando idonei dispositivi di protezione individuale.
   17. In una provetta da microcentrifuga, preparare la soluzione della matrice sciogliendo 10 mg di super-DHB [miscela 9:1 (p/p) di acido 2,5-diidrossibenzoico e acido 2-idrossi-5-metossibenzoico] in 1 mL di TA50.
   18. Sciogliere i campioni essiccati in 10 μl di TA50.
   19. Mescolare 1 μl del campione con 1 μl della soluzione della matrice, posizionarlo su una piastra target MALDI in acciaio e lasciarlo asciugare.

2. Analisi MALDI TOF dei campioni

1. Configurazione per l'acquisizione dei dati degli ioni genitori
   1. Spara 1.000 colpi dal laser al 50% di intensità.
      NOTA: Questi possono variare a seconda delle impostazioni globali dello strumento e possono essere regolati secondo necessità.
   2. Nella scheda Supporto laser , impostare l'impostazione della camminata casuale per completare il campione.
   3. Nella scheda Rilevamento , impostare l'intervallo di massa su 500 - 3.000; Aumentare questo intervallo se si osservano forti picchi a 2.500-3.000 m/z. Impostare il guadagno del rivelatore su 20x.
      NOTA: Il guadagno può variare in base alle impostazioni globali dello strumento e può essere regolato secondo necessità.
   4. Nella scheda Spettrometro , impostare la polarità su positivo e la soppressione della matrice su Deflessione, 300 Da.
   5. Fare clic su Start | una volta terminata l'acquisizione dei dati, Salva con nome per salvare i dati in una directory appropriata.
2. Apertura degli spettri genitori per acquisire gli spettri di frammentazione
   1. Dopo aver fatto clic con il pulsante destro del mouse sugli spettri, selezionare Trova elenco massa.
   2. Dall'elenco generato, selezionare gli ioni pertinenti per la frammentazione e fare clic su aggiungi all'elenco MS/MS dopo aver fatto clic con il pulsante destro del mouse sui picchi selezionati.
   3. Fare nuovamente clic con il pulsante destro del mouse sull'elenco delle masse e selezionare Elenco MS/MS.
   4. Fare clic su Invia a flexControl.
   5. Su flexControl, caricare il metodo LIFT e passare alla scheda LIFT .
   6. Seleziona ogni picco caricato uno per uno e acquisisci sia gli ioni genitore che quelli frammento passando dalla modalità Genitore a Frammenti. Regolare l'intensità del laser e il numero di scatti secondo necessità. Fare clic su Salva per salvare i dati dopo la frammentazione di ogni ione genitore.
   7. Esporta gli spettri in formato '.ascII'.
      NOTA: Questo può essere successivamente importato in Glycoworkbench per ulteriori analisi.
3. Analisi dei dati con glycoworkbench
   1. In Glycoworkbench, caricare il file .ascII esportato dello spettro di massa ed eseguire una correzione di base e un filtraggio del rumore utilizzando i relativi pulsanti nella parte inferiore della finestra, prima di calcolare i centroidi di picco. Nella finestra pop-up, scegli l'intervallo di massa appropriato, il rapporto segnale/rumore Min e l'intensità di picco MS minima.
   2. Una volta calcolati i centroidi di picco, utilizzare lo strumento Glyco-Peakfinder per trovare le composizioni di struttura che corrispondono all'elenco dei picchi. Selezionare perMe come Derivatizzazione, redEnd come Estremità riducente e il numero minimo e massimo di residui previsti.
      1. Per le mucine, selezionare l'esoso, la N-acetil-esosamina, la desossi-esosio e l'acido N-acetil-neuraminico. Per i glicani solfatati, utilizzare l'altra opzione di residuo con una massa di 87,9. Per i dati MALDI-TOF, impostare Max # ioni Na e Max # cariche sono impostate su 1 e la precisione su 0,5 Da.
         NOTA: Potrebbe essere necessario aumentare ulteriormente la precisione, a seconda della calibrazione dello spettrometro di massa.
   3. Seleziona tutte le annotazioni corrette tenendo premuto il tasto Ctrl e facendo clic su ciascuna annotazione; quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sull'annotazione e fare clic su Aggiungi all'elenco dei picchi annotati.
   4. Per generare un report che confronta più spettri annotati, nella scheda degli strumenti , in reporting, selezionare Crea un report che confronta diversi profili. Stampa il report in formato PDF per salvarlo.
   5. Dopo aver identificato i picchi dei glicani, calcolare l'abbondanza relativa di ogni singola struttura come percentuale dell'area totale sotto la curva di tutti i picchi dei glicani.
   6. Per l'analisi degli spettri di frammentazione, caricare gli spettri su Glycoworkbench e generare l'elenco dei picchi come al punto 2.3.1.
   7. Disegna le strutture putative dei glicani che corrispondono alle composizioni di glicani annotate. Generare frammenti per ogni struttura disegnata selezionando l'opzione di calcolo dei frammenti pertinente nello strumento Frammenti . Quindi, seleziona tutti i frammenti, fai clic con il pulsante destro del mouse su di essi e fai clic su Copia frammenti nell'area di disegno.
   8. Per supportare ulteriormente l'analisi della frammentazione, selezionare un picco di interesse facendo clic su di esso nel visualizzatore dello spettro. Successivamente, facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando Trova tutte le strutture che corrispondono ai picchi, interrogare il m/z del picco selezionato rispetto ai database online per le strutture di glicani putativi.
   9. Seleziona le strutture putative di interesse e copiale nella finestra canvas del software facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando l'opzione appropriata.
   10. Per calcolare i possibili frammenti che possono essere generati da ogni struttura di glicani, selezionare la struttura di interesse nell'area di disegno e quindi, nella scheda Strumenti , scegliere Frammenti e Calcola frammenti per la struttura corrente.
   11. Se sono stati calcolati frammenti per più di una struttura di glicani, visualizzare la tabella di confronto nella scheda di riepilogo , nella vista Tabella frammenti .
   12. Seleziona i frammenti che corrispondono all'elenco dei picchi per ogni potenziale struttura di glicani e seleziona Copia frammenti nell'area di disegno dal menu a discesa del tasto destro.
   13. Nella scheda Strumenti , in profiler, selezionare Annota picchi con tutte le strutture e quindi fare clic su Strumenti | Reportistica | Creare un report delle annotazioni. Stampa il report in formato PDF per salvarlo.

Risultati

Nei risultati seguenti, la mucina gastrica suina (PGM) è stata utilizzata per ottimizzare le fasi di desalinizzazione e permetilazione. Per confrontare due approcci di desalinizzazione comunemente usati, dopo il rilascio dei glicani, i campioni sono stati desalinizzati mediante scambio cationico (come descritto nel protocollo precedente) e co-evaporazione del borato con metanolo o mediante estrazione in fase solida con cartucce di carbonio grafitato poroso (PGC). Ciò richiede il precondizionamento della cartuccia con acetonitrile all'80% e H₂O al 100%, una fase di lavaggio con acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1% (v/v) e l'eluizione dei glicani con 2 mL di acetonitrile al 25% in TFA allo 0,1%, 2 mL di acetonitrile al 50% in TFA allo 0,1% e 2 mL di acetonitrile all'80% in TFA allo 0,1%.

Gli spettri risultanti dopo la permetilazione sono stati analizzati nell'intervallo da m/z 500 a m/z 2.500. Nel campione desalinizzato con scambio ionico e rimozione del borato sono state identificate un totale di 33 strutture di glicani, mentre nel campione desalinizzato con estrazione di PGC sono state identificate 32 strutture (Figura 2A). Una struttura di glicano non è stata identificata nel campione desalinato con PGC (contrassegnata con un asterisco nella Figura 2A). Questa analisi comparativa ha dimostrato che il recupero di glicani più grandi non era altrettanto efficiente dopo l'estrazione del PGC, rispetto allo scambio ionico. Ciò è evidenziato anche dalla relativa abbondanza di glicani più grandi, che rappresentano il 21% dei glicani totali dopo l'estrazione del PGC, rispetto al 31% per lo scambio ionico. Inoltre, la desalinizzazione mediante scambio ionico e la rimozione del borato hanno portato a spettri con rapporti segnale/rumore più elevati rispetto a quelli prodotti dopo la desalinizzazione mediante estrazione in fase solida con PGC (Figura 2B).

Per ottimizzare il tempo di reazione di permetilazione, le aliquote della stessa reazione di permetilazione sono state estinte aggiungendo H₂O in diversi punti temporali (ad esempio, 5 min, 30 min o 90 min). I risultati hanno mostrato che 33 picchi di glicani potevano essere identificati nell'intervallo da m/z 500 a m/z 2.500, nei campioni permetilati per 30 o 90 minuti, con spettri risultanti simili. Al contrario, è stato possibile identificare solo 31 picchi di glicani quando la permetilazione è stata effettuata per 5 minuti (Figura 3). È interessante notare che le due strutture che non sono state identificate in questo tempo di reazione più breve (contrassegnate da un asterisco nella Figura 3) sono le due strutture sialilate, suggerendo che la modifica degli acidi sialici non è efficiente in 5 minuti, nelle condizioni testate.

La frammentazione è stata utilizzata per ogni picco di glicani PGM per confermare la composizione dei glicani e determinare la struttura dei glicani. Di seguito sono presentati due esempi (Figura 4). Nella Figura 4A, viene presentato lo spettro di frammentazione di un picco a 983 m/z. La composizione del glicano è assegnata come HexNAc₂Hex₂. Ci sono due potenziali strutture per questa composizione di glicani, Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (glicano 1) o Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (glicano 2). La frammentazione di questo composto ha prodotto uno spettro di massa con picchi che possono essere assegnati a diversi frammenti del glicano. Il picco a m/z 529 e il picco a m/z 708 sono caratteristici delle strutture 1 e 2, rispettivamente, e possiamo concludere che entrambi i glicani 1 e 2 sono presenti nella miscela di glicani PGM.

Nella Figura 4B, viene presentato lo spettro di frammentazione di un picco a m/z 2.026. Glycoworkbench ha calcolato due potenziali composizioni di glicani per questo picco, Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ e Hex₃HexNAc₄dHex₂. La composizione sialilata ha un'accuratezza inferiore (~160 ppm e 178 ppm, rispettivamente), suggerendo che la prima deve essere la scelta corretta. Tuttavia, il profilo di frammentazione indica la presenza di Fuc, non di Neu5Ac; Pertanto, la seconda composizione è quella corretta. Qui, sono presentate quattro strutture di glicani putativi e lo spettro è stato annotato con i frammenti calcolati da ciascuna struttura di glicani putativi. Nello spettro annotato, possiamo notare che sono presenti picchi caratteristici solo dei glicani 4 e 6, mentre non sono stati identificati picchi caratteristici dei glicani 3 e 5. Sulla base di questi dati, possiamo concludere che i glicani 4 e 6 sono presenti.

Figura 2: Confronto dei picchi dei glicani in base alla desalinizzazione e all'estrazione in fase solida. (A) Confronto del profilo dei glicani PGM dopo la desalinizzazione mediante cromatografia a scambio cationico e rimozione del borato o mediante estrazione in fase solida PGC. (B) Confronto dei due approcci di desalinizzazione nel rapporto segnale/rumore risultante per ciascun picco di glicano identificato. L'asterisco specifica il glicano che è stato identificato solo nei campioni dissalati mediante scambio cationico e rimozione del borato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Confronto del profilo dei glicani PGM dopo permetilazione per 5, 30 o 90 minuti. Gli asterischi indicano i glicani sialilati che sono stati identificati solo dopo 30 o 90 minuti di permetilazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempi di spettri di frammentazione da glicani PGM. (A) Frammentazione del picco del glicano a m/z 983. (B) Frammentazione del picco dei glicani a m/z 2026. Le caselle indicano le potenziali strutture dei glicani. I numeri sopra i frammenti indicano da quale struttura del glicano potrebbero essere derivati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Per studiare i glicani, i ricercatori impiegano una varietà di metodologie, che vanno dall'uso di lectine per identificare epitopi specifici alla più sofisticata cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS) e risonanza magnetica nucleare (NMR) per ottenere una caratterizzazione dettagliata delle strutture dei glicani. I principali vantaggi della MALDI-TOF MS rispetto agli approcci alternativi sono la sensibilità e la natura ad alto rendimento del metodo¹³. Tuttavia, poiché non vi è la capacità di separare i composti isobarici, diverse strutture di glicani con lo stesso valore m/z producono un mix di frammenti sotto MS/MS che è quindi difficile da deconvolgare¹³. Se è necessario determinare l'esatta struttura dei glicani della mucina, la LC-MS dovrebbe essere il metodo di scelta.

Qui, presentiamo un protocollo per l'analisi dei glicani della mucina mediante MALDI-TOF MS che include tutte le fasi critiche del processo, dal rilascio dei glicani, alla desalinizzazione e alla permetilazione, all'acquisizione e all'analisi dei dati. È importante riconoscere che ciascuno di questi passaggi può essere eseguito utilizzando approcci diversi e tutti presentano vantaggi e limitazioni associati.

In questo protocollo, abbiamo utilizzato l'eliminazione riduttiva della β per rilasciare i glicani. La reazione avviene in condizioni basiche. Se i campioni di mucina sono già in sospensione e non sono stati precedentemente purificati, il pH deve essere controllato utilizzando una carta indicatrice di pH; se acido, deve essere aumentato a un pH di ~8-9. Un limite di questo approccio è che le condizioni di base necessarie per il rilascio dei glicani portano anche all'idrolisi e, quindi, alla perdita dei gruppi O-acetilici spesso presenti negli acidi sialici, in una reazione nota come saponificazione.

Mentre in letteratura sono stati descritti altri metodi per il rilascio di glicani 15,16,17,18, alcuni dei quali possono preservare i gruppi O-acetilici labili, l'eliminazione riduttiva della β rimane il gold standard nel campo. Questo approccio richiede un'alta concentrazione di sali. I sali e altri contaminanti a soppressione ionica devono quindi essere rimossi prima dell'analisi MALDI-TOF¹⁹, in quanto possono influenzare l'efficienza di ionizzazione e la quantificazione dei glicani. In questo caso, la cromatografia a scambio cationico, seguita dalla rimozione del borato mediante evaporazione del metanolo, si è dimostrata l'approccio più efficiente per la desalinizzazione dei glicani rilasciati dalla mucina. In questo caso, i glicani non interagiscono con la resina e invece fluiscono attraverso di essa, mentre gli ioni sodio sono intrappolati sulla resina. Tuttavia, la preparazione delle colonne a scambio ionico è laboriosa e rende questo approccio inefficiente per esperimenti su larga scala con numerosi campioni. In questi casi, la desalinizzazione PGC può essere preferita, poiché questa resina è disponibile anche in un formato di piastra a 96 pozzetti. Tuttavia, come presentato in precedenza, la desalinizzazione mediante estrazione di PGC può portare a un'eluizione inefficiente, in particolare di glicani più grandi, e questo dovrebbe essere considerato quando si interpretano i risultati.

Sebbene i glicani nativi possano essere analizzati anche da MALDI-TOF, di solito viene impiegata la permetilazione, poiché questa reazione aumenta significativamente la sensibilità di rilevamento, poiché i glicani nativi hanno una bassa efficienza di ionizzazione²⁰. Inoltre, la permetilazione rende i glicani caricati negativamente, come i glicani solfatati o sialilati, più facili da rilevare in modalità positiva e preserva gli epitopi dei glicani labili, come gli acidi sialici o il fucosio²⁰. Più comunemente, la permetilazione viene lasciata funzionare per 5-10 minuti ^14,21, con alcuni rapporti che consentono alla reazione di continuare fino a 40 minuti²². Qui, abbiamo dimostrato che, nelle condizioni testate, i glicani sialilati non venivano rilevati in modo efficiente dopo 5 minuti di permetilazione ed era necessaria un'incubazione più lunga.

Oltre al tempo di reazione, un altro fattore che può influenzare l'efficienza della permetilazione è il contenuto di acqua nella reazione. La presenza di acqua può portare a una sottometilazione o a una metilazione parziale dei glicani, dove non tutti i gruppi ossidrilici sono stati convertiti in gruppi^{metilici 23}. Questo può essere facilmente determinato come se si fosse verificata una sottometilazione, gruppi di picchi che differiscono di 14 Da (la differenza di massa tra gruppi ossidrilici e metilici) possono essere osservati negli spettri di massa. Questo problema può essere risolto ripetendo la reazione di permetilazione e rianalizzando i dati.

Un fattore limitante nell'analisi dei glicani è l'interpretazione degli spettri. Nonostante i recenti progressi, questo processo è ancora in gran parte manuale e richiede una buona conoscenza e comprensione delle vie biosintetiche dei glicani per annotare accuratamente gli spettri. Strumenti come Glycoworkbench²⁴ possono aiutare fornendo possibili annotazioni, strutture e composizioni dei glicani, ma a causa dell'eterogeneità intrinseca delle miscele di glicani, i ricercatori devono ancora prendere la decisione di quale scelta sia quella corretta. Nell'esempio presentato sopra utilizzando PGM, Glycoworkbench ha offerto due potenziali composizioni di glicani per il picco a mz 2.025,7620 e, sulla base del profilo di frammentazione, abbiamo concluso che era presente la struttura fucosilata, piuttosto che quella sialilata. Tuttavia, se non era disponibile uno spettro di frammentazione (come spesso accade per i glicani a bassa abbondanza), i ricercatori possono basare l'annotazione sulla conoscenza che i glicani con una composizione di Hex3HexNAc1Neu5Ac3 si trovano sui gangliosidi, piuttosto che sulle mucine, e questa opzione non dovrebbe quindi essere considerata nel contesto della PGM. Pertanto, le strutture o le composizioni dei glicani identificate dovrebbero essere incrociate con pubblicazioni precedenti e dovrebbero concordare con i principi della biosintesi degli O-glicani. Nel complesso, questo protocollo rappresenta una risorsa preziosa, soprattutto per i ricercatori che sono nuovi nel campo della glicobiologia e con un interesse per lo studio delle interazioni che avvengono all'interfaccia della mucosa.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pipette pasteur di vetro da 150 mm	Fisher Scientific	15202699	Consumabili Riferimento nel testo (se applicabile): pipetta in vetro
Tubi da 5 mL	Eppendorf	30122305	Consumo
Piastra di estrazione HLB a 96 pozzi	Fisher Scientific	16553290	Consumo
acido acetico	Sigma-Aldrich	A6283	Reagente
acetonitrile	Fisher Scientific	15624520	Reagente
DMSO anidro	Sigma-Aldrich	5.89569	Reagente
Metanolo anidro	Sigma-Aldrich	5.89596	Reagente
Spettrometro di massa Autoflex	Bruker		Attrezzatura
DOWEX 50w x8 resina, forma H+, mesh 200-400	Sigma-Aldrich	44519	Reagente Riferimento nel testo (se applicabile): resina di scambio cationico
Riscaldatore a blocco secco	Concedere	QBD2	Attrezzatura
Evaporatore/Concentratore per riscaldatori a blocchi	Cole-Palmer	WZ-36610-99	Attrezzatura
flexAnalysis	Bruker		Software, proprietario
flexControl	Bruker		Software, proprietario
Genevac EZ-2	Biopharma	EZ-2	Apparecchiatura Riferimento nel testo (se applicabile): evaporatore centrifugo
Fiale di vetro con tappi in PTFE abbinati (4 mL)	Wheaton	DWKW224582-144EA	Consumo
Fiale di vetro con tappi in PTFE abbinati (8 mL)	Fisher Scientific	11587413	Consumo
lana di vetro	Supelco	1.04086	Consumo
Banco da lavoro glico-lavorativo	NA		Software; scaricabile da https://glycoworkbench.software.informer.com/
Cartucce HLB SPE	Supelco	57493-U	Consumabile, come alternativa alla piastra di estrazione HLB a 96 pozzi
Iodometano	Sigma-Aldrich	289566	Reagente
Targa bersaglio MALDI	Bruker		Attrezzatura
Liofilizzatore ModulyoD	Thermo Fisher	ModulyoD-230	Attrezzatura Riferimento nel testo (se applicabile): liofilizzatore
NaBH4	Sigma-Aldrich	452882	Reagente
Pellet NaOH	Sigma-Aldrich	567530	Reagente
Soluzione NaOH 50%	Sigma-Aldrich	415413	Reagente
Processore a pressione positiva-96	Acque	186006961	Attrezzatura
super DHB	Sigma-Aldrich	50862	Reagente
Acido trifluoroacetico	Sigma-Aldrich	T6508	Reagente