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Articolo metodologico

Marcatura in vivo di isotopi stabili per l'identificazione con spettrometria di massa dei metaboliti paterni trasferiti dallo spermatozoo all'ovocita durante la fecondazione

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DOI:

10.3791/67765

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17 giugno 2025

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

In questo articolo

Sommario

Questa procedura mira a identificare i metaboliti trasferiti dagli spermatozoi agli ovociti durante la fecondazione utilizzando la marcatura degli isotopi stabili con 2H2O o U13C Glucosio seguita da analisi metabolomica. I tori marcati con deuterio sono accoppiati con madri non marcate. Gli embrioni pre-impianto raccolti vengono analizzati mediante spettrometria di massa per separare i metaboliti paterni (deuterati) da quelli materni (non deuterati).

Abstract

Il contributo paterno alla genetica embrionale è stato finora limitato alle sequenze alleliche per decenni. Un decennio di risultati suggerisce, invece, che i fattori epigenetici - metilazione del DNA, modificazioni istoniche, organizzazione cromosomica e RNA regolatori - svolgono un ruolo cruciale nell'eredità paterna e influenzano lo sviluppo embrionale e l'espressione genica dello zigote. Insieme agli acidi nucleici, il metaboloma degli spermatozoi (lipidi, carboidrati, amminoacidi liberi) può fungere da segnale epigenetico. Questo protocollo mira a identificare i metaboliti trasferiti da spermatozoo a ovocita mediante spettrometria di massa. La procedura prevede la marcatura degli isotopi stabili degli spermatozoi con glucosio 2H2O o U13C per tracciare, mediante metabolomica, i metaboliti paterni trasferiti all'ovocita durante la fecondazione. L'obiettivo generale del protocollo è quello di rivelare il ruolo del metaboloma dello sperma paterno nella suscettibilità della prole al dismetabolismo e può essere adattato per fornire informazioni su come le condizioni ambientali, come la dieta e l'esposizione agli inquinanti, alterano i messaggi metabolici paterni, influenzando potenzialmente la salute della prole e la predisposizione al diabete, all'obesità e alle malattie cardiovascolari.

Introduzione

L'epigenoma paterno influenza la suscettibilità della prole al dismetabolismo
A differenza della pletora di ruoli pre e post-concezionali sfruttati dalle madri durante lo sviluppo embrionale, per decenni si è pensato che il contributo degli spermatozoi fosse esclusivamente genetico. Secondo la teoria dell'eredità genetica, il contributo paterno alla variabilità fenotipica di un individuo (inclusa la sua suscettibilità alla malattia) doveva essere attribuito esclusivamente alla sequenza genetica delle varianti alleliche ereditate paternamente e alle loro interazioni con quelle ereditate dalla madre1. Al giorno d'oggi, è chiaro che gli alleli non sono gli unici messaggi genetici trasmessi dal padre alla sua prole durante la fecondazione e che, invece, una moltitudine di segnali epigenetici contribuiscono all'eredità paterna 2,3,4. I segnali epigenetici finora identificati includono: (1) gruppi metilici aggiunti covalentemente alle citosine del genoma parentale 5,6,7, (2) modificazioni post-traduzionali (acetilazione, metilazione) degli istoni associati ai cromosomi spermatici e veicolati agli ovociti8, (3) l'organizzazione 3D dei cromosomi paterni che porta all'interazione intracromosomica (nota anche come domini di associazione topologica, TAD) persistente nello zigote9,10 e (4) molecole di RNA regolatorie (miRNA, frammenti derivati da tRNA e RNA che interagiscono con piwi)11,12 e rRNA13 e tRNA14 rilasciati dallo spermatozoo nell'ovocita durante la fecondazione.

L'epigenoma paterno è un importante veicolo di informazioni per la progenie. Le informazioni paterne influenzeranno lo zigote, l'embrione durante il suo sviluppo e, dopo la nascita, la propensione della prole al dismetabolismo e alle malattie. Questa eredità non mendeliana (indicata come intergenerazionale o transgenerazionale a seconda che colpisca una o più generazioni consecutive), è considerata da molti autori uno dei fattori che contribuiscono sotto copertura al drastico aumento delle malattie dismetaboliche che si verificano nei paesi occidentali sviluppati15. Infatti, secondo le teorie PoHaD (Paternal Origin of Health and Disease) e DoHaD (Developmental Origin of Health and Disease), il contributo epigenetico dei genitori è uno dei fattori che predispongono la prole a sviluppare diabete, obesità e malattie cardiovascolari in età adulta16,17. È interessante notare che l'epigenoma parentale è eccezionalmente suscettibile agli stimoli ambientali e può essere influenzato da condizioni metaboliche (come l'uso di droghe, le abitudini alimentari e la fitness metabolica)18 così come da parametri strettamente ambientali (come l'esposizione a sostanze inquinanti, le relazioni sociali e lo stress mentale e relazionale)5,11. Ciascuno degli stimoli sopra menzionati può quindi alterare gli epigenomi delle cellule germinali (spermatozoi e ovociti) e influenzare le generazioni future.

Il consumo di diete ad alto contenuto di grassi (HFD) rappresenta uno degli stimoli ambientali più ampiamente studiati in grado di alterare l'epigenoma paterno e portare a messaggi deleteri inviati alla prole19. Questo stimolo colpisce il fenotipo della prole (fino alla terza generazione), che spesso mostra una maggiore propensione a sviluppare dismetabolismo, indipendentemente dall'apporto calorico. La prole del padre che consuma HFD manifesta ritardo della crescita, intolleranza al glucosio e insulino-resistenza sia nei topi che nei ratti20,21. Nell'uomo, l'eredità epigenetica è stata studiata principalmente nelle generazioni nate durante e immediatamente dopo periodi di carestia o sovralimentazione22. Nella coorte di Överkalix, la disponibilità di cibo dei nonni paterni durante il loro periodo di crescita lenta era correlata al rischio di mortalità complessiva, alle malattie cardiovascolari, all'IMC, alla circonferenza della vita e alla massa grassa dei loro nipoti23. Recentemente, l'evidenza della trasmissione intergenerazionale paterna è stata confermata in altre coorti24.

Metaboliti paterni coinvolti nell'eredità intergenerazionale
Nonostante l'evidenza clinica ed epidemiologica, i dettagli molecolari dell'eredità intergenerazionale paterna rimangono poco chiari. In un primo momento, l'identificazione di tutti i trasduttori molecolari dell'informazione epigenetica deve ancora essere completata. L'evidenza scientifica suggerisce che la componente nucleica degli spermatozoi, da sola, non può spiegare la complessità dell'eredità intergenerazionale. Variazioni nella metilazione del DNA sono state effettivamente misurate negli spermatozoi di topi e ratti alimentati con HFD, ma in una percentuale così bassa della popolazione di spermatozoi che questo non può spiegare l'elevata penetranza del fenotipo dismetabolico osservata nella prole25. D'altra parte, il pool di RNA di segnalazione trasferiti dagli spermatozoi agli ovociti ha un'emivita molto breve e, sebbene sia in grado di influenzare l'espressione genica zigotica, sembra improbabile che venga mantenuto a concentrazioni efficaci dopo la fecondazione, nello zigote negli embrioni del giorno 2, del giorno 3, nelle morule e nelle blastocisti. Pertanto, sembra evidente che nuovi determinanti molecolari devono essere coinvolti nel meccanismo di ereditarietà intergenerazionale.

Insieme agli acidi nucleici, lo sperma contribuisce anche con componenti metabolomici allo zigote, come lipidi, carboidrati e aminoacidi 26,27,28,29. Questi metaboliti, in particolare quelli dotati di attività modulatorie, potrebbero influenzare l'espressione genica zigotica e lo sviluppo embrionale e quindi potrebbero agire come segnali epigenetici30. Inoltre, analogamente agli acidi nucleici, la concentrazione e l'abbondanza relativa di questi metaboliti negli spermatozoi possono essere influenzate dalle condizioni ambientali vissute dal padre e quindi rappresentare veicoli di informazioni per la prole 28,30,31,32,33,34. In effetti, è stato dimostrato che il metaboloma spermatico degli spermatozoi maturi dipende dallo stato di salute del padre ed è influenzato da fattori ambientali come la dieta, l'esercizio fisico, le sostanze tossiche e gli interferenti endocrini.

Comprendere il ruolo dei metaboliti degli spermatozoi nello sviluppo embrionale è complicato da diverse limitazioni tecniche: (1) la differenza di dimensioni tra lo spermatozoo e l'ovocita, che si traduce in un contributo minimo di massa metabolica dello spermatozoo per lo zigote, e (2) le diverse variazioni metabolomiche che lo spermatozoo subisce durante le sue fasi di produzione (spermatogenesi), maturazione dell'epididimo, eiaculazione e fusione con l'ovocita.

Fluttuazione del metaboloma degli spermatozoi durante la maturazione degli spermatozoi
Nei mammiferi, gli spermatozoi sono prodotti nel testicolo attraverso la spermatogenesi, un processo dipendente dalle cellule staminali spermatogoniali mediante il quale gli spermatogoni impegnati si sviluppano in spermatociti primari che entrano nella meiosi e producono spermatidi aploidi rotondi. La morfogenesi di queste cellule in spermatozoi avviene attraverso la spermiogenesi, un massiccio rimodellamento morfo-funzionale degli spermatidi, da cellule rotonde a cellule allungate/condensate/altamente specializzate, corrispondenti all'ultima fase della spermatogenesi. Tuttavia, gli spermatozoi risultanti sono immobili e non ancora in grado di fecondare35. Dopo la spermiazione, quando gli spermatozoi vengono rilasciati dalla rete testicolare nell'epididimo, gli spermatozoi interagiscono con le cellule epiteliali dell'epididimo e interagiscono con le proteine e le vescicole esosomiali secrete da queste cellule (epididimosomi, ricchi di sfingomielina e acido arachidonico). Il passaggio attraverso l'epididimo consente agli spermatozoi di raggiungere la piena maturità e, anche se mantenuti in uno stato pre-capacitato, acquisiscono competenza per la motilità36. Durante il transito dell'epididimo, la membrana spermatica si carica più negativamente e si arricchisce di sfingomielina. Anche la membrana spermatica diventa più fluida a causa di una progressiva riduzione del colesterolo e di un concomitante aumento degli acidi grassi polinsaturi (principalmente acidi arachidonico, docosapentaenoico e docosaesaenoico). Dopo l'eiaculazione, nel tratto genitale femminile, le proteine del liquido seminale e l'albumina promuovono la capacitazione degli spermatozoi promuovendo l'iperpolarizzazione e l'afflusso di calcio per attivare la motilità degli spermatozoi. La membrana plasmatica degli spermatozoi capacitati presenta un'ulteriore maggiore fluidità, un basso rapporto colesterolo/fosfolipidi e un ridotto contenuto di acido sialico, gangliosiside GM1 e trigliceridi31,37.

Prima di incontrare l'ovocita, lo spermatozoo subisce la reazione acrosomiale, una fusione dell'acrosoma (un organello membranoso derivato dal Golgi che copre la parte anteriore del nucleo dello spermatozoo e si forma durante la spermiogenesi) con la membrana plasmatica dello sperma, che facilita la riorganizzazione della membrana plasmatica dello sperma e la competenza a penetrare nella zona pellucida (ZP), una matrice di glicoproteine che circonda l'ovocita35, 38. Come passaggio finale, l'emifusione tra lo spermatozoo e la membrana dell'ovocita, promossa dalle proteine spermatiche IZUMO1, SPACA6 e TMEM9539, provoca l'incorporazione dei lipidi spermatici nelle membrane dell'ovocita e il trasferimento del contenuto nucleico e metabolico nell'ovocita.

Motivazione della procedura
Lo scopo di questa procedura è identificare i metaboliti trasportati dallo spermatozoo e trasferiti nell'ovocita al momento della fecondazione (Figura 1). Per distinguere tra metaboliti derivati da spermatozoi e ovociti nello zigote, gli spermatozoi vengono marcati con Deuterio (2H, un isotopo dell'idrogeno) o 13C (un isotopo del carbonio) utilizzando la marcatura metabolica in vivo con Ossido di Deuterio, 2H2O40, o uniformemente marcato U13C Glucosio41. I topi maschi marcati con isotopi vengono quindi accoppiati con femmine non marcate per raccogliere infine zigoti, morule e blastocisti. Gli embrioni in fase iniziale vengono elaborati per estrarre (1) metaboliti polari, (2) metaboliti non polari e (3) steroli. I metabolomi vengono quindi analizzati utilizzando tecniche di spettrometria di massa. I metaboliti isotopicamente marcati (paterni) saranno identificati e distinti da quelli non marcati (materni), dimostrando inequivocabilmente la loro origine paterna.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Napoli Federico II, Italia. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Selezione e raggruppamento dei maschi C57BL/6J

  1. Maschi selezionati C57BL/6J di circa 12 settimane.
  2. Dividi i maschi in due gruppi e chiamali LABELED (sottoposti a marcatura con isotopi stabili) o NON LABELED (usato come controllo e per misurare l'efficacia della marcatura isotopica negli spermatozoi e nelle morule).
  3. Per svuotare l'epididimo dagli spermatozoi non marcati, consentire ai maschi di accoppiarsi con femmine accoppiate.

2. Marcatura isotopica stabile di maschi C57BL/6J

  1. Se si utilizza 2H2O per l'etichettatura in vivo , preparare acqua arricchita al 10% v/v 2H2O da utilizzare come acqua potabile mescolando 100 mL di 2H2O con 900 mL di acqua di rubinetto. Se si utilizza l'U13C-glucosio per l'etichettatura in vivo , preparare il 5%-15% di acqua di U13C-glucosio da utilizzare come acqua potabile sciogliendo 50-150 g di U13C-glucosio in 1 L di acqua del rubinetto;
    ATTENZIONE: Il consumo prolungato di 2H2O è tossico per i topi. Impostare per ogni specifico ceppo di topo, la quantità massima di 2H2O da aggiungere nell'acqua potabile per ottenere la massima efficienza di etichettatura e il minimo effetto collaterale. Il consumo prolungato di glucosio provoca iperglicemia e diabete nei topi. Impostare la quantità massima di U13C-glucosio da aggiungere all'acqua potabile per ottenere la massima efficienza di etichettatura e il minimo effetto collaterale.
  2. Sostituisci le bottiglie d'acqua con quelle contenenti acqua potabile marcata con isotopi e lascia che i topi la bevano per 2,5-5 settimane (coprendo almeno la metà della spermatogenesi), rinnovando il liquido due volte a settimana.
  3. Alla fine del periodo di trattamento, consentire ai maschi marcati di accoppiarsi con femmine superovulate.

3. Superovulazione delle femmine C57BL/6J

  1. Femmine selezionate di circa 4 settimane con un peso compreso tra 12,5-14 g, in età prepuberale.
  2. Indurre la maturazione del follicolo mediante iniezione intraperitoneale di 5 UI/50 μL/topo di PMSG (siero di cavalla gravida).
  3. Dopo 47 ore, iniettare per via intraperitoneale l'ormone luteinizzante HCG (gonadotropina corionica umana, 5 UI/50 μL/topo) per favorire il completamento della maturazione del follicolo e indurre l'ovulazione e la formazione del corpo luteo.
  4. Dopo l'iniezione di HCG, consentire alle femmine di accoppiarsi con topi MARCATI e NON MARCATI, secondo il passaggio 1 della Figura 1.
  5. Dopo l'accoppiamento, eseguire il controllo del tappo vaginale42. Separa le femmine positive e mettile in gabbia.

4. Raccolta di embrioni preimpianto mediante lavaggio

  1. Sacrificare le femmine vaginali plug-positive seguendo protocolli istituzionalmente approvati (2,5 giorni dopo il coito per raccogliere le morule).
  2. Posizionare gli animali in decubito dorsale sul tavolo; bagnare l'addome con etanolo al 70% ed eseguire un'ampia laparotomia.
  3. Rimuovere l'utero da un lato pizzicando la cervice e tagliando l'estremità caudale della cervice; dall'altro lato, tagliando all'estremità del corno uterino (porzione infundibolare).
  4. Posizionare gli uteri nella piastra di Petri con PBS per sciacquarli e poi trasferirli in un'altra piastra di Petri pulita per evitare la presenza di residui.
  5. Per lavare l'utero, caricare una siringa da 2,5 ml con il terreno di coltura e collegarla a un ago Hamilton a punta smussata da 33 G.
  6. Inserire l'ago nell'infundibolo dell'ovidotto preparato come descritto sopra e lavare l'intero utero.
  7. Raccogli le morule in una goccia di terreno di coltura per lavarle da eventuali residui di mucosa e sangue.
  8. Trasferire i campioni raccolti in nuove provette di raccolta e raggrupparli in MORULAE MARCATE e MORULAE NON MARCATE, a seconda che derivino da eventi di accoppiamento che coinvolgono tori MARCATI o NON MARCATI. Congelare i campioni in azoto liquido.
  9. Sacrificare un gruppo di femmine superovulate non accoppiate (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) per raccogliere ovociti non fecondati. Trasferire i campioni raccolti in nuove provette di raccolta ed etichettarli come OVOCITI NON MARCATI. Congelare i campioni in azoto liquido.

5. Raccolta di spermatozoi dalla cauda dell'epididimo

  1. Sacrificare tori ETICHETTATI o NON ETICHETTATI.
  2. Posizionare gli animali in decubito dorsale sul tavolo, bagnare l'addome con etanolo al 70% ed eseguire un'ampia laparotomia.
  3. Rimuovere l'epididimo e immergerlo immediatamente in 3 ml di PBS (pH 7,6) e tagliarlo liberamente per drenare lo sperma dai dotti.
  4. Filtrare i campioni di sperma attraverso la garza.
  5. Centrifugare gli spermatozoi a 800 x g per 10 minuti (a temperatura ambiente).
  6. Risospendere il pellet in 1 mL di acqua fredda deionizzata. Solo gli spermatozoi resisteranno alla soluzione ipotonica, mentre i non spermatozoi scoppieranno.
  7. Centrifugare gli spermatozoi a 800 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
  8. Etichettare le provette e raggrupparle come SPERMATOZOI ETICHETTATI e SPERMATOZOI NON ETICHETTATI, a seconda che siano stati raccolti da tori ETICHETTATI o NON ETICHETTATI.
  9. Congelare i campioni in azoto liquido e conservarli a -80 °C.

6. Estrazione di lipidi e metaboliti polari

  1. Equilibrare il campione dai passaggi 1-5 a 4°C su ghiaccio.
  2. Aggiungere 225 μL di metanolo ghiacciato (MeOH) ai campioni e incubare a -30 °C per 1 minuto e, successivamente, metterli in un bagno sonico per 10 minuti.
    1. Facoltativo: durante l'impostazione della condizione sperimentale, aggiungere 0,1-2 ppm di C16-Ceramide-13 C3-15 N e L-Lisina-ε-15N cloridrato come standard interni per misurare l'efficienza dell'estrazione rispettivamente per i metaboliti non polari e polari.
  3. Aggiungere 750 μL di etere metil-terz-butilico ghiacciato (MTBE) in un termomiscelatore per 1 ora a 4 °C (550 giri/min).
  4. Aggiungere 188 μL di H2O ai campioni dopo averli centrifugati. Separare le fasi superiori (lipidi) da quelle inferiori (metaboliti polari) ed essiccarle.
    ATTENZIONE: Il MeOH provoca cecità e danni al fegato, ai reni e al cuore se ingerito. La sovraesposizione ha un effetto cumulativo sul sistema nervoso centrale. L'MTBE può causare irritazione alla pelle, agli occhi e alle vie respiratorie. Lavorare sotto una cappa aspirante.
  5. Asciugare il campione utilizzando un concentratore sottovuoto. Conservare i campioni essiccati a -80 °C fino all'analisi di massa/spettrometria.
    NOTA: I campioni essiccati possono essere conservati a -80 °C per un massimo di 6 mesi, in attesa di analisi di massa/spettrometria. Per l'identificazione dei metaboliti meno rappresentati negli embrioni preimpianto, potrebbe essere necessario raggruppare campioni ottenuti dalla stessa coppia di accoppiamento e dallo stesso evento di accoppiamento.

7. Estrazione degli steroli

NOTA: Evitare l'uso di tubi e punte di plastica [verranno sciolti dal solvente organico non polare]; utilizzare invece tubi di vetro e pipette di vetro Pasteur per erogare liquidi.

  1. Equilibrare il campione dai passaggi 1-5 a 4 °C su ghiaccio. Risospendere i campioni raccolti in 500 μl di una soluzione di metanolo/H20 70% v/v e trasferire la sospensione in una provetta di vetro.
    1. Omogeneizzare a vortice per 30 s. Lasciare l'omogeneizzato per 16 ore a 4 °C.
    2. Opzionale: durante l'impostazione della condizione sperimentale, aggiungere 0,1-2 ppm dello sterolo vegetale Sitostanol-5,6,22,23-d4 come standard interni per misurare l'efficienza di estrazione per gli steroli.
      ATTENZIONE: Il MeOH provoca cecità e danni al fegato, ai reni e al cuore se ingerito. La sovraesposizione ha un effetto cumulativo sul sistema nervoso centrale.
  2. Centrifugare il campione a 3,220 x g per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una provetta di vetro pulita e integrarlo con 500 μl di PBS.
  3. Aggiungere 7 mL di etere etilico ghiacciato e agitare per 1 minuto. Lasciare riposare il campione per 1-2 minuti e attendere la separazione di fase. Congelare immergendo il tubo in un bagno di ghiaccio secco/acetone. Trasferire la fase di etere etilico non congelata in una provetta di vetro appena etichettata.
    ATTENZIONE: L'etere etilico è un liquido e un vapore estremamente infiammabili e si decompone in perossidi esplosivi nell'aria e nella luce. Non lavorare a stretto contatto con le fiamme. L'etere etilico è pericoloso se ingerito e dannoso per la pelle.
  4. Sbrinare la fase acquosa a 37 °C e ripetere il passaggio 4.3. Combinare le fasi di etere etilico raccolte ai passaggi 4.3-4.4 in un'unica provetta di vetro.
  5. Asciugare il campione utilizzando un concentratore sottovuoto. Conservare i campioni essiccati a -80 °C fino all'analisi di massa/spettrometria.

8. Derivatizzazione del campione

NOTA: I campioni trarrebbero beneficio dalla derivatizzazione TMS per l'analisi di metaboliti specifici (colesterolo, acidi grassi, aminoacidi).

  1. Equilibrare i campioni a temperatura ambiente
    ATTENZIONE: Un equilibrio incompleto può causare la condensazione dell'acqua atmosferica sulle pareti dei tubi e sui campioni. L'acqua compete fortemente per la derivatizzazione della TMS.
  2. Solubilizzare i campioni in 50 μL di piridina e derivatizzarli aggiungendo 25 μL di N,O-Bis(trimetilsilil(TMS)trifluoroacetammide (BSTFA). Incubare i campioni per 90 minuti a 60 °C. Centrifugare i campioni e procedere immediatamente con l'analisi GC-MS.
    ATTENZIONE: La piridina è infiammabile, irritante e tossica. BSTFA è infiammabile, corrosivo e irritante. Lavorare sotto una cappa aspirante e utilizzare guanti protettivi.

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Risultati

Al fine di monitorare il trasferimento dei metaboliti dallo spermatozoo all'ovocita, le morule isolate da femmine C57 BL/6J accoppiate con tori di gruppi MARCATI e NON MARCATI vengono raccolte e analizzate mediante Metabolomica basata sulla spettrometria di massa. I metaboliti sono stati estratti come descritto nei passaggi 6-7 e derivatizzati con TMS come descritto nel passaggio 8. È stata eseguita la profilazione metabolomica e lipidomica di morule MARCATE, morule NON MARCATE, ovociti NON MARCATI, spermatozoi MARCATI e...

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Discussione

Il protocollo descritto consente l'identificazione dei metaboliti trasferiti dagli spermatozoi agli ovociti durante la fecondazione utilizzando la marcatura degli isotopi stabili di topi maschi con glucosio 2H2O o U13C seguita dall'analisi metabolomica. I metaboliti marcati isotopicamente che si trovano nelle morule sono di origine paterna.

Sebbene l'idrogeno e il deuterio siano isotopi, non sono del tutto identici in termini d...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2H2O filtrato, 99,8 atom % 2HSigma Aldrich756822
AcetoneSigma Aldrich179124
Agilent  SIL-8Agilent (Santa Clara, CA, U.S.A.)
C16-Ceramide-13C3-15NStandard LGCTRC-C342770-25MG
diclorometanoSigma Aldrich34856
Etere dietilicoSigma Aldrich673811
etanoloSigma Aldrich1,11,727
HCG (gonadotropina corionica umana,Sigma AldrichCG5-1VL
L-lisina-ε-15N cloridratoSigma Aldrich608971
Maschio e femmina  Topi C57BL/6JOlaHsdInotiv C57BL/6JOlaHsd
metil terz-butil etere (MTBE)Sigma Aldrich306975
MetOHSigma Aldrich1,06,035
N,O-bis(trimetilsilil(TMS)
trifluoroacetammide (BSTFA)		Supelco15238
PBSApplichemCodice A0965-9010
PMSG (cavalla gravida' s siero)Lee Biosolutions493-10
piridinaSigma Aldrich360570
Shimadzu GCMS 2010plus Shimadzu
Sitostanolo-5,6,22,23-d4Sigma Aldrich680028
trifluoracetato di sodioSigma Aldrich1615138
SolariX XR 7TDaltonici Bruker
TimsTOF Pro Q-TOF Daltonici Bruker
Glucosio U13C Sigma Aldrich389374
Ultimate RS3000 UHPLC Thermo Fisher Scientifico
Precolonna VanGuard CSHTM (5,0 &volte; 2,1 mm; 1,7 μ m, 130 & Aring;)Acque

Riferimenti

  1. Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
  2. Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A. A decade of exploring the mammalian sperm epigenome: Paternal epigenetic and transgenerational inheritance. Front Cell Dev Biol. 6, 50(2018).
  3. Horsthemke, B. A critical view on transgenerational epigenetic inheritance in humans. Nat Commun. 9 (1), 2973(2018).
  4. Schagdarsurengin, U., Steger, K. Epigenetics in male reproduction: Effect of paternal diet on sperm quality and offspring health. Nat Rev Urol. 13 (10), 584-595 (2016).
  5. Skinner, R. C., Gigliotti, J. C., Ku, K. -M., Tou, J. C. A comprehensive analysis of the composition, health benefits, and safety of apple pomace. Nutr Rev. 76 (12), 896-909 (2018).
  6. King, S. E., Skinner, M. K. Epigenetic transgenerational inheritance of obesity susceptibility. Trends Endocrinol Metab. 31 (7), 478-494 (2020).
  7. Martínez Duncker Rebolledo, E., et al. Sperm DNA methylation defects in a new mouse model of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase 677C>T variant and correction with moderate dose folic acid supplementation. Mol Hum Reprod. 30 (4), gaae008(2024).
  8. Lismer, A., et al. Histone H3 lysine 4 trimethylation in sperm is transmitted to the embryo and associated with diet-induced phenotypes in the offspring. Dev Cell. 56 (5), 671-686.e6 (2021).
  9. Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. Chromatin remodeling and epigenetic features of germ cells. Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).
  10. Diaz-Castillo, C., Chamorro-Garcia, R., Shioda, T., Blumberg, B. Transgenerational self-reconstruction of disrupted chromatin organization after exposure to an environmental stressor in mice. Sci Rep. 9 (1), 13057(2019).
  11. Gapp, K., et al. Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci. 17 (5), 667-669 (2014).
  12. Chen, Q., et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder. Science. 351 (6271), 397-400 (2016).
  13. Liberman, N., et al. 18S rRNA methyltransferases DIMT1 and BUD23 drive intergenerational hormesis. Mol Cell. 83 (18), 3268-3282.e7 (2023).
  14. Tomar, A., et al. Epigenetic inheritance of diet-induced and sperm-borne mitochondrial RNAs. Nature. 630 (8017), 720-727 (2024).
  15. Pinhas-Hamiel, O., Zeitler, P. The global spread of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents. J Pediatr. 146 (5), 693-700 (2005).
  16. Galan, C., Krykbaeva, M., Rando, O. J. Early life lessons: The lasting effects of germline epigenetic information on organismal development. Mol Metab. 38, 100924(2020).
  17. Rando, O. J., Simmons, R. A. I'm eating for two: Parental dietary effects on offspring metabolism. Cell. 161 (1), 93-105 (2015).
  18. Perez, M. F., Lehner, B. Intergenerational and transgenerational epigenetic inheritance in animals. Nat Cell Biol. 21 (2), 143-151 (2019).
  19. Carone, B. R., et al. Paternally induced transgenerational environmental reprogramming of metabolic gene expression in mammals. Cell. 143 (7), 1084-1096 (2010).
  20. Pastore, A., et al. Pre-conceptional paternal diet impacts on offspring testosterone homoeostasis via epigenetic modulation of cyp19a1/aromatase activity. NPJ Metab Health Dis. 2 (1), 8(2024).
  21. Fullston, T., et al. Paternal obesity initiates metabolic disturbances in two generations of mice with incomplete penetrance to the F2 generation and alters the transcriptional profile of testis and sperm microRNA content. FASEB J. 27 (10), 4226-4243 (2013).
  22. Lumey, L., et al. Cohort profile: The Dutch Hunger Winter Families Study. Int J Epidemiol. 36 (6), 1196-1204 (2007).
  23. Pembrey, M. E., et al. Sex-specific, male-line transgenerational responses in humans. Eur J Hum Genet. 14 (2), 159-166 (2006).
  24. Comas-Armangue, G., Makharadze, L., Gomez-Velazquez, M., Teperino, R. The legacy of parental obesity: Mechanisms of non-genetic transmission and reversibility. Biomedicines. 10 (10), 2461(2022).
  25. Shea, J. M., et al. Genetic and epigenetic variation, but not diet, shape the sperm methylome. Dev Cell. 35 (6), 750-758 (2015).
  26. Dupont, J., Bertoldo, M. J., Rak, A. Energy sensors in female and male reproduction and fertility. Int J Endocrinol. 2018, 8285793(2018).
  27. Guiton, R., Henry-Berger, J., Drevet, J. R. The immunobiology of the mammalian epididymis: The black box is now open. Basic Clin Androl. 23 (1), 8(2013).
  28. Jarvis, S., et al. High fat diet causes distinct aberrations in the testicular proteome. Int J Obes. 44 (9), 1958-1969 (2020).
  29. Liu, L. -L., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma signaling in human sperm physiology. Asian J Androl. 17 (6), 942(2015).
  30. Masaki, H., et al. Long-chain fatty acid triglyceride metabolism disorder impairs male fertility: A study using adipose triglyceride lipase deficient mice. Mol Hum Reprod. 23 (7), 452-460 (2017).
  31. Cheng, X., et al. Lipidomics profiles of human spermatozoa: Insights into capacitation and acrosome reaction using UPLC-MS-based approach. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1273878(2023).
  32. Collodel, G., Castellini, C., Lee, J. C. -Y., Signorini, C. Relevance of fatty acids to sperm maturation and quality. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7038124(2020).
  33. Watkins, A. J., et al. Paternal diet programs offspring health through sperm- and seminal plasma-specific pathways in mice. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (40), 10064-10069 (2018).
  34. Darbandi, M., et al. Oxidative stress-induced alterations in seminal plasma antioxidants: Is there any association with keap1 gene methylation in human spermatozoa. Andrologia. 51 (1), e13159(2019).
  35. Deneke, V. E., Pauli, A. The fertilization enigma: How sperm and egg fuse. Annu Rev Cell Dev Biol. 37 (1), 391-414 (2021).
  36. Cobellis, G., et al. A gradient of 2-arachidonoylglycerol regulates mouse epididymal sperm cell start-up. Biol Reprod. 82 (2), 451-458 (2010).
  37. Kawano, N., Yoshida, K., Miyado, K., Yoshida, M. Lipid rafts: Keys to sperm maturation, fertilization, and early embryogenesis. J Lipids. 2011, 264706(2011).
  38. Rubinstein, E., Ziyyat, A., Wolf, J., Lenaour, F., Boucheix, C. The molecular players of sperm-egg fusion in mammals. Semin Cell Dev Biol. 17 (2), 254-263 (2006).
  39. Satouh, Y., Inoue, N., Ikawa, M., Okabe, M. Visualization of the moment of mouse sperm-egg fusion and dynamic localization of IZUMO1. J Cell Sci. 125 (pt 3), 498-506 (2012).
  40. Kim, J., Seo, S., Kim, T. -Y. Metabolic deuterium oxide (D2O) labeling in quantitative omics studies: A tutorial review. Anal Chim Acta. 1242, 340722(2023).
  41. Li, X., et al. Sustained high glucose intake accelerates type 1 diabetes in NOD mice. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1037822(2022).
  42. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  43. Katz, J. J. Chemical and biological studies with deuterium. , Sigma Xi, The Scientific Research Honor Society. (2024).
  44. Oakberg, E. F., Hughes, A. M. Deuterium oxide effect on spermatogenesis in the mouse. Exp Cell Res. 50 (2), 306-314 (1968).
  45. Sumiyoshi, M., Sakanaka, M., Kimura, Y. Chronic intake of high-fat and high-sucrose diets differentially affects glucose intolerance in mice. J Nutr. 136 (3), 582-587 (2006).
  46. Aragno, M., Mastrocola, R. Dietary sugars and endogenous formation of advanced glycation endproducts: Emerging mechanisms of disease. Nutrients. 9 (4), 385(2017).
  47. Wilkinson, D. J., Brook, M. S., Smith, K. Principles of stable isotope research-with special reference to protein metabolism. Clin Nutr Open Sci. 36, 111-125 (2021).
  48. Wilkinson, D. J., et al. A validation of the application of D2O stable isotope tracer techniques for monitoring day-to-day changes in muscle protein subfraction synthesis in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (5), E571-E579 (2014).

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