Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

Sommario

Le RASopatie sono sindromi genetiche multisistemiche causate dall'iperattivazione della via RAS-MAPK. Varianti potenzialmente patogene in attesa di convalida emergono continuamente, mentre le scarse evidenze precliniche limitano la terapia. Qui, descriviamo il nostro protocollo in vivo per testare e convalidare in modo incrociato i livelli di attivazione ERK associati alla RASopathy e la sua modulazione farmacologica durante l'embriogenesi mediante imaging FRET dal vivo in zebrafish teen-reporter.

Abstract

Le RASopatie sono sindromi genetiche causate dall'iperattivazione di ERK e che provocano malattie multisistemiche che possono anche portare alla predisposizione al cancro. Nonostante un'ampia eterogeneità genetica, la maggior parte dei casi è alla base di mutazioni germinali con guadagno di funzione nei regolatori chiave della via RAS-MAPK e, grazie a tecniche avanzate di sequenziamento, continuano ad essere identificate varianti potenzialmente patogene che influenzano la via RAS-MAPK. La validazione funzionale della patogenicità di queste varianti, essenziale per una diagnosi accurata, richiede protocolli rapidi e affidabili, preferibilmente in vivo. Data la scarsità di trattamenti efficaci nella prima infanzia, tali protocolli, soprattutto se scalabili in modelli animali economicamente vantaggiosi, possono essere strumentali nell'offrire un terreno preclinico per il riposizionamento/riposizionamento dei farmaci.

Qui descriviamo passo dopo passo il protocollo per la generazione rapida di modelli transitori di RASopathy in embrioni di zebrafish e l'ispezione diretta dei cambiamenti di attività ERK associati alla malattia che si verificano già durante la gastrulazione attraverso l'imaging FRET (Förster resonance energy transfer) multispettrale in tempo reale. Il protocollo utilizza un reporter ERK transgenico di recente costituzione e integrato con l'hardware dei microscopi commerciali. Forniamo un esempio di applicazione per i modelli di zebrafish della sindrome di Noonan (NS) ottenuti dall'espressione di Shp2^D61G. Descriviamo un metodo semplice che consente la registrazione del cambiamento del segnale ERK nel modello di pesce NS prima e dopo la modulazione farmacologica del segnale da parte degli inibitori MEK a basso dosaggio disponibili. Descriviamo in dettaglio come generare, recuperare e valutare i segnali FRET raziometrici da acquisizioni multispettrali prima e dopo il trattamento e come convalidare in modo incrociato i risultati tramite l'immunofluorescenza classica su embrioni interi nelle fasi iniziali. Descriviamo quindi come, attraverso l'esame di parametri morfometrici standard, interrogare i cambiamenti tardivi nella forma dell'embrione, indicativi di una conseguente compromissione della gastrulazione, negli stessi embrioni la cui attività ERK è valutata mediante FRET vivo a 6 ore dopo la fecondazione.

Introduzione

Le RASopatie sono sindromi genetiche che compromettono il normale sviluppo e colpiscono vari organi e tessuti. Queste condizioni sono spesso causate da mutazioni germinali con guadagno di funzione (GoF) nei geni chiave e negli attori coinvolti nella segnalazione RAS/MAK, con conseguente iperattivazione (aumento della fosforilazione) della chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK). ERK regola alcuni processi fondamentali importanti durante lo sviluppo - crescita dei tessuti - traslocando nel nucleo ^1,2. Le mutazioni somatiche nei geni coinvolti nella via RAS-MA....

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali che hanno coinvolto la stabulazione e l'allevamento degli animali sono state condotte secondo le linee guida ARRIVE per l'utilizzo del pesce zebra nella ricerca animale e autorizzate dalla Direzione Generale della Sanità Animale e dei Farmaci veterinari - DGSAF. Tutte le reazioni DNA/RNA e le sessioni di imaging possono essere aumentate o ridotte a piacere, a seconda del materiale finale richiesto o del numero di geni e varianti testate.

1. Generazione e trattamento farmacologico di modelli transitori di RASopathy di zebrafish

NOTA: ....

Risultati

Questo protocollo mostra un flusso di lavoro semplice per generare rapidamente modelli di RASopathy transitori in embrioni di zebrafish e valutare le fluttuazioni ERK nei mutanti precoci con un metodo di imaging FRET live standard applicato a un sensore ERK zebrafish di recente costituzione ^6,9. Come recentemente dimostrato ^6,7 all'interno dello stesso flusso di lavoro sp.......

Discussione

Nonostante decenni di ricerca e miriadi di mutazioni che portano a forme altamente eterogenee di RASopatie ora mappate, varianti genetiche con significato sconosciuto continuano ad emergere dagli sforzi di sequenziamento su pazienti non diagnosticati. In effetti, in molti casi, la diagnosi basata esclusivamente sulle caratteristiche cliniche può essere impegnativa e gli approcci genomici funzionali per convalidare i risultati del sequenziamento rimangono fondamentali. Inoltre, nonostante.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Plastica
1.7 L Acquario di riproduzione - Design in stile spiaggia	Tecniplast	1.7L INCLINATA	Vasca riproduttiva
Capillari GC100F-10	Apparecchiatura Harvard	30-0019	Microiniezione embrionale a stadio unicellulare
Piastre di coltura cellulare e tissutale - 12 pozzi	BIOFIL	TCP011012	Raccolta e trattamento degli embrioni
Piastre di coltura cellulare e tissutale - 6 pozzi	BIOFIL	TCP011006	Raccolta e trattamento degli embrioni
Piatto di coltura cellulare	SPL Scienze della Vita	20100	Raccolta embrionali
Piatti di vetro Nunc 12mm	Thermo Fisher	150680	Imaging spettrale FRET dell'embrione
Pipetta Pasteur	Corning	357524	Trasferimento embrionale
Tubi Lobind proteici 2ml	Eppendorf	30108450	Analisi IHC
reagenti e altri
Caviale 500-800 & micro; m	Rettenmaier Italia	BE2269 (500-800)	Cibo secco per pesci
Cisti di artemia blu del Grande Lago Salato	Sanders	00004727	Cibo per pesci vivi
Sale oceanico istantaneo	Tecniplast	XPSIO25R	Sale marino disidratato per la preparazione di cibi vivi
Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Adolescente)	Contatti per ordinare*: Progetto Nazionale BioResource Zebrafish, Unità di Supporto per lo Sviluppo delle Risorse Animali, RRD, RIKEN Center for Brain Science, Giappone. https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *sulla firma MTA.	-	Fornitore della linea ERK Reporter per pesci zebra. Gli embrioni di pesce possono essere ottenuti tramite firma MTA dal National BioResource Project del Giappone per il pesce zebra (RIKEN, Giappone). La linea di pesci zebra è depositata dal Nara Institute of Science and Technology (Takaaki Matsui) e dal National Institute of Genetics (NIG/ROIS) (Koichi Kawakami, brevetto per il sistema Tol2) (Wong et al., 2018, Urasaki et al., 2006, Okamoto e Ishioka, 2010).
6x colorante di carico	Segnalazione cellulare	B7024S	Elecroforesi su gel
Scala del DNA a 100 pb	NEB	N3231S	Elecroforesi su gel
Agarose	Sigma-Aldrich	1,01,236	Elecroforesi su gel
Agarosio, bassa temperatura di gelificazione	Sigma-Aldrich	A9414-10G	Montaggio dell'embrione per immagini spettrali FRET e test IHC
Albumina Sirica Bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	Analisi IHC
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	223506	Componente medio E3
Nitrato di calcio	Sigma-Aldrich	237124	Componente della soluzione di Danieau
Dimetil Solfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Analisi IHC
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Componente tampone TBE per la preparazione del gel
Etanolo 99%+	Fisher Scientific	10048291	Purificazione in vitro dell'RNA
Formaldeide 16%	Thermo Fisher	28908	Fissazione embrionale
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Elecroforesi su gel
Gel Loading Buffer II (PAGINA Denaturante)	Thermo Fisher	AM8546G	Trascrizione in vitro dell'RNA
Acido Acetico Glaciale	Sigma-Aldrich	695092	Componente tampone TBE per la preparazione del gel
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G6279-1L	Analisi IHC
Alexa Fluor 488 anti-topo per capre	Thermo Fisher	A11001	Analisi IHC
Anti-coniglio per capre Alexa Fluor 633	Thermo Fisher	A21070	Analisi IHC
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Componente della soluzione di Danieau
KpnI - HF (Enzima + tampone rCutSmart)	NEB	R3142	Linearizzazione plasmidiale
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	230391	Componente medio E3/componente di soluzione Danieau stock
Marcatori RNA del Millennio	Thermo Fisher	AM7150	Elecroforesi su gel
Kit di purificazione del DNA genomico Monarch	NEB	T3010L	Linearizzazione plasmidiale
MAPK monoclonale topino p44/42	Segnalazione cellulare	4696S	Analisi IHC
Kit di trascrizione mMACHINE SP6	Thermo Fisher	AM1340	Trascrizione in vitro dell'RNA
Siero normale per capra (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	Analisi IHC
Ambione dell'acqua privo di nucleasi	Thermo Fisher	AM9937	Trascrizione in vitro dell'RNA
PD0325901	Sigma-Aldrich	PZ0162	Inibitore MEK
Soluzione rossa di fenolo	Sigma-Aldrich	P0290	Componente della miscela microiniezione
Kit di coda Poly A	Thermo Fisher	AM1350	Trascrizione in vitro dell'RNA
Cloruro di potassio bioxtra	Sigma-Aldrich	P9333	Componente medio E3/componente soluzione Danieau stock/componente soluzione stock PBS
Fosfato diidrogeno di potassio	Sigma-Aldrich	P0662	Componente della soluzione stock PBS
Proteinasi K	Sigma-Aldrich	P2308	Analisi IHC
Fosfo-p44/42 policlonale coniglio MAPK	Segnalazione cellulare	4695S	Analisi IHC
Colorazione con gel di DNA sicura per SYBR	Thermo Fisher	S33102	Elecroforesi su gel
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	31434-M	Componente medio E3/componente soluzione Danieau stock/componente soluzione stock PBS
Dibase fosfato di sodio	Sigma-Aldrich	71643	Componente della soluzione stock PBS
Base Trizma	Sigma-Aldrich	T1503	Componente tampone TBE per la preparazione del gel
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Componente buffer PBSTr
Equipaggiamento
Alliance Mini HD9 & nbsp;	Uvitec	-	Sistema di imaging
Centrifuga 5430 R	Eppendorf	5428000205	Microcentrifuga
Termomixer Eppendorf C	Eppendorf	-	Montaggio embrionale
FemtoJet 4x	Eppendorf	-	Sistema di microiniezione
Infinite M Plex	Tecan	-	Lettore di piastre multimodalità
Leica M205FA	Leica Microsystems	-	Microscopio stereo a fluorescenza
Leica TCS-SP8X equipaggiata con incubatore (OkoLab)	Leica Microsystems	-	Microscopio confocale
Sistema di elettroforesi Horizionale GT Mini-sottocella	Bio-Rad	1704406	Elecroforesi su gel
PC-100 Estrattore verticale	Narishige	-	Estrazione di ago
Alimentatore universale PowerPac	Bio-Rad	1645070	Elecroforesi su gel
Stellaris 5	Leica Microsystems	-	Microscopio confocale
Vortex MiniStar silverline	VWR	-	Preparazione dei plasmidi
Software
Biorender	Biorender	Licenza CC-BY 4.0	Elaborazione di cartoni animati per Figure
Excel	Microsoft Office Professional Plus 2019	-	Analisi dei dati
Software delle Figi	ImageJ	15.3t	Rendering di imaging e analisi quantitative (misurazioni dei segnali FRET, intensità di fluorescenza ERK nell'analisi IHC, lunghezza degli assi embrionali)
GraphPad Prism	GraphPad Software LLC	v. 9	Analisi dei dati statistici
Software per lo spettrofotometro iControl	Tecan	v. 2.0	Quantificazione dell'RNA
Illustratore	Adobe	26.0.3 (64 bit)	Assemblaggio delle figure
Software LASX	Leica Microsystems	v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X)	Acquisizione di immagini per esperimenti spettrali FRET e imaging embrionale per misurazioni della lunghezza degli assi
Software Q9 Mini 18.02-SN	Uvitec	-	Acquisizione dell'immagine in gel