Definizione e valutazione di un modello avanzato di fibrosi polmonare in vitro basato sull'uomo

Summary

È stato sviluppato un metodo di imaging per valutare l'attivazione dei fibroblasti in fette di polmone umano tagliate con precisione sulla base della proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP). Questa metodologia stabilisce una piattaforma robusta e riproducibile per la stadiazione della progressione fibrotica, facendo avanzare modelli traslazionali in vitro per lo sviluppo terapeutico mantenendo la fedeltà del microambiente tissutale umano.

Abstract

La fibrosi polmonare è caratterizzata da distruzione irreversibile della struttura alveolare e da un'eccessiva deposizione di matrice extracellulare. Sebbene i modelli animali siano stati ampiamente utilizzati nella ricerca sulla fibrosi polmonare, nessuno dei modelli attualmente disponibili ricapitola completamente la natura progressiva dell'IPF o la sua caratteristica istologica distintiva, come i focolai fibroblastici. I modelli avanzati in vitro , tra cui le fette polmonari tagliate con precisione (PCLS), sono spesso considerati il sistema di test polmonare più rilevante dal punto di vista fisiologico e sono stati impiegati con successo per lo screening dei farmaci. Tuttavia, l'incapacità di differenziare il grado di fibrosi nel polmone IPF ha provocato l'accecamento e l'incertezza nel PCLS ottenuto. Ricerche precedenti hanno dimostrato che la proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP) potrebbe valutare l'attività pro-fibrotica dell'ILD, contribuendo potenzialmente alla diagnosi precoce e alla selezione di finestre terapeutiche appropriate. In questo studio, PCLS da 600 μm sarà ottenuto da donatori sani e pazienti con IPF utilizzando uno shock slicer e valutato utilizzando sonde molecolari mirate a FAP per determinare il grado di attività dei fibroblasti in base all'intensità del segnale fluorescente. Questo approccio fornisce un modello in vitro avanzato e una tecnica di valutazione per la ricerca sulla fibrosi polmonare, migliorando la capacità di studiare i meccanismi della malattia e valutare gli interventi terapeutici.

Introduction

La fibrosi polmonare (PF) è una forma comune con un'eziologia sconosciuta e una prognosi particolarmente sfavorevole, con un tasso di sopravvivenza mediano a cinque anni di solo il 25%¹. Il modello di somministrazione intratracheale di bleomicina è attualmente il modello animale più utilizzato per gli studi preclinici². Tuttavia, la fibrosi indotta dalla bleomicina è transitoria e si risolve nel tempo, il che contrasta nettamente con la natura irreversibile dell'IPF³. Inoltre, il modello di bleomicina intratracheale presenta sfide significative a causa della gravità eterogenea della fibrosi derivante dalla somministrazione endotracheale, sia chirurgica che non chirurgica. Queste limitazioni degli attuali modelli animali contribuiscono all'alto tasso di fallimento degli studi clinici che hanno come bersaglio l'IPF⁴.

Le fette di polmone tagliate con precisione (PCLS) sono state utilizzate in una varietà di malattie perché preservano fedelmente le reti di diafonia cellulare specifiche della malattia e il microambiente ^5,6,7. Nella fibrosi polmonare, il PCLS da polmoni IPF mantiene l'architettura tissutale nativa e l'eterogeneità cellulare, consentendo l'osservazione di vari tipi di cellule e interazioni cellula-matrice extracellulare ^8,9, stabilendoli come un modello rappresentativo ex vivo per lo studio della fisiopatologia polmonare. Tuttavia, poiché la fibrosi polmonare è caratterizzata da lesioni fibrotiche eterogenee nei polmoni, il campionamento PCLS è intrinsecamente cieco. Non è possibile distinguere visivamente se le sezioni ottenute rappresentano aree fibrotiche in fase quiescente, in fase attiva o in tessuto polmonare normale. Questa limitazione sottolinea la necessità di strumenti di valutazione visiva e di screening. Ricerche precedenti hanno scoperto che la proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP) era altamente e specificamente espressa nel tessuto polmonare dei pazienti con IPF, indicando che la FAP poteva valutare l'attività pro-fibrotica dell'ILD¹⁰.

In questo studio, un anticorpo a catena singola contro la FAP è stato marcato con verde indocianina (ICG) per sviluppare una sonda di imaging molecolare mirata con una maggiore penetrazione tissutale. I PCLS da 600 μm ottenuti da donatori sani e pazienti con IPF sono stati sottoposti a imaging utilizzando questa sonda e l'attività dei fibroblasti è stata valutata in base all'intensità del segnale fluorescente. Questa modalità di imaging supera le tecniche convenzionali di valutazione della fibrosi (Western blotting, qPCR, colorazione tricromica di Masson o immunofluorescenza) grazie alla semplicità di funzionamento, al mantenimento dell'integrità e della vitalità citoarchitettonica e al monitoraggio longitudinale della progressione patogena. Ancora più importante, è facile da usare e richiede solo 90 minuti. Ciò fornisce uno strumento di screening avanzato per il modello in vitro PCLS, facilitando la ricerca sulla fibrosi polmonare.

Protocol

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Primo Ospedale dell'Università di Medicina di Guangzhou (2021G-29). L'IPF è stata diagnosticata sulla base dell'esame fisico e dei risultati della tomografia computerizzata ad alta risoluzione del torace, seguendo i criteri diagnostici stabiliti da ATS/ERS/JRS/ALAT (2022). Tutti i campioni di pazienti con IPF sono stati ottenuti da trapianto di polmone o biopsia polmonare. Campioni di tessuto polmonare sano sono stati ottenuti da donatori di organi con diagnosi di morte cerebrale10. Il consenso scritto per la raccolta dei tessuti è stato ottenuto da ciascun paziente o dalla famiglia del paziente prima della raccolta. Per i dettagli relativi a tutti i materiali, le soluzioni e gli strumenti utilizzati in questo protocollo, fare riferimento alla Tabella dei materiali.

1. Preparazione del PCLS umano

NOTA: I pazienti vengono sottoposti a screening di routine per virus come HIV, HCV o sifilide prima del trapianto di polmone o della biopsia e devono risultare negativi prima di procedere con gli esperimenti successivi per garantire la sicurezza sul lavoro del personale di laboratorio.

1. Preparazione delle soluzioni
   1. Preparare una soluzione tamponata con fosfato (1× PBS) e preraffreddare a 4 °C.
   2. Preparare una soluzione di agarosio al 2%. Pesare 2 g di agarosio e trasferirlo in un matraccio di Erlenmeyer. Aggiungere 100 ml di PBS, mescolare accuratamente e scaldare in microonde fino a quando la miscela raggiunge un'ebollizione vigorosa (≥95 °C), diventando completamente chiara, omogenea e priva di particelle o striature visibili. Agitare il pallone di tanto in tanto durante il riscaldamento per evitare un'ebollizione eccessiva. Mettere la soluzione a bagnomaria a 37 °C fino al momento dell'uso.
2. Fette di polmone tagliate con precisione
   1. Lavare la superficie esterna del tessuto polmonare con PBS per rimuovere le impurità e il sangue in eccesso.
   2. Utilizzare una siringa da 20 ml (ago da 1,2 mm) per aspirare un volume appropriato di agarosio e inserirlo nella trachea. Iniettare lentamente l'agarosio nei lobi polmonari fino a quando non si gonfia completamente. Interrompere l'iniezione non appena si incontra una marcata resistenza per evitare perdite di agarosio.
      NOTA: Sono necessari circa 10 ml di agarosio per ogni blocco di tessuto di 5 × 2 × 1 cm, evitando il trabocco. Per i pezzi di tessuto più piccoli, utilizzare una siringa da 5 ml e stampi per l'inclusione (ad es. stampi in silicone, vassoi di plastica o provette da centrifuga tagliate a misura) per facilitare l'inclusione. Versare uno strato di base di agarosio spesso 1-2 mm nello stampo e lasciarlo semi-solidificare. Posizionare delicatamente il tessuto polmonare sull'agarosio semisolido, quindi versare lentamente altro agarosio per coprire completamente il tessuto, evitando bolle. Lasciare che l'agarosio si solidifichi completamente.
   3. Mettere i polmoni sul ghiaccio per circa 30 minuti per consentire la polimerizzazione dell'agarosio. Controllare la durezza e la freddezza della pleura per confermare la polimerizzazione; Continuare a raffreddare se necessario.
   4. Tagliare il tessuto polmonare in lastre di 1-2 cm utilizzando una lama affilata.
   5. Centrare la vaschetta del bagno di ghiaccio sul banco di taglio e riempirla in anticipo con i cubetti di ghiaccio per il pre-raffreddamento.
   6. Accendere l'interruttore di alimentazione e tenere premuto il pulsante SU per sollevare il sample stage in una posizione adeguata.
   7. Caricare con cautela la lama sul portacoltello.
      NOTA: Maneggiare la lama con cautela per evitare lesioni. Smaltire le lame usate negli appositi contenitori per oggetti taglienti.
   8. Taglia un pezzo di nastro adesivo lungo circa 3 cm e largo 1 cm. Fissare il lato adesivo al vassoio e rivestire uniformemente il lato non appiccicoso con adesivo cianoacrilato.
   9. Raccogli un pezzo di tessuto polmonare usando una pinza. Asciugare la superficie con carta assorbente e posizionarla sul nastro adesivo. Premere delicatamente per garantire un'adesione salda.
   10. Dopo che la colla si è solidificata, caricare la vaschetta sulla vaschetta del bagno di ghiaccio. Riempire con PBS pre-raffreddato fino a quando il blocco di tessuto non è sommerso.
   11. Impostare la frequenza di vibrazione su "10" e la velocità di taglio su "2". Premere il pulsante FWD per iniziare ad affettare. Dopo che la prima fetta è stata completamente tagliata, premere il pulsante STP per fermarsi, quindi premere il pulsante RVE per ritrarre la lama. Scartare la prima fetta.
   12. Ruotare manualmente la piattaforma girevole 6 volte per impostare lo spessore della sezione a 600 μm. Premere il pulsante FWD per riprendere l'affettatura e premere il pulsante STP dopo che la sezione è stata tagliata. Premere RVE per ritrarre il coltello e recuperare la fetta di polmone usando una pinzetta. Metti la fetta in PBS contenente l'1% di penicillina/streptomicina (P/S) e tienila in ghiaccio.
   13. Ripetere i passaggi di affettatura precedenti per ottenere ulteriori PCLS, ciascuno di circa 600 μm di spessore.
   14. Quando il blocco di tessuto corrente è quasi esaurito, sostituirlo con un nuovo blocco di tessuto e ripetere i passaggi da 1.2.4 a 1.2.13.

2. Purificazione degli anticorpi FAP

NOTA: Generare l'anticorpo a dominio singolo specifico per FAP contenente un tag His C-terminale come descritto in precedenza^11,12.

1. Eseguire la visualizzazione dei fagi per consentire la selezione ad alto rendimento di frammenti di anticorpi specifici per FAP (scFv) eseguendo ripetute panoramiche di librerie combinatorie su bersagli immobilizzati o in fase di soluzione. Recupera i fagi legati attraverso un lavaggio e un'eluizione rigorosi. Amplifica i fagi reinfettando E. coli e arricchisci i leganti bersaglio in 3-4 cicli. Convalida i cloni utilizzando il sequenziamento ELISA dei fagi e del DNA per identificare gli anticorpi ad alta affinit๲.
2. Clonare la sequenza di DNA che codifica il frammento variabile a catena singola anti-FAP nel vettore pET-28a(+) fuso con un tag His per l'espressione in E. coli¹³.
3. Trasformare il plasmide ricombinante in cellule di E. coli BL21 (DE3). Indurre l'espressione proteica utilizzando isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) in colture shake-flask incubate per una notte a 20 °C¹⁴.
4. Purificare l'anticorpo FAP dal surnatante utilizzando perle di acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA). Eseguire lo scambio di buffer con PBS per le applicazioni downstream.
5. Valutare la purezza degli anticorpi mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato di poliacrilammide (SDS-PAGE). Una singola banda dominante al peso molecolare previsto indica un'elevata purezza.

3. Valutazione dell'affinità anticorpale FAP

1. Coltura di cellule di rene embrionale umano 293T (HEK 293T) nel Medium di Eagle Modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina.
2. Aggiungere la proteina di attivazione dei fibroblasti umani (hFAP) che sovraesprime il lentivirus alle cellule 293T al 90% di confluenza. Incubare per 96 ore per generare una linea cellulare stabile di 293T-hFAP.
3. Digerire entrambe le cellule 293T e 293T-hFAP con lo 0,25% di tripsina-EDTA e raccogliere le cellule.
4. Lavare le cellule con PBS e incubare con anticorpo FAP seguito da Alexa Fluor 488-coniugato anti-His IgG.
5. Analizza l'intensità della fluorescenza utilizzando un citometro a flusso NovoCyte^15,16.

4. Etichettatura della sonda molecolare scFv-FAP-ICG

1. Regolare la concentrazione di FAP-scFv a 2 mg/mL utilizzando PBS.
2. Aggiungere l'estere NHS verde indocianina (ICG-NHS) per ottenere un rapporto molare di 5:1 (ICG-NHS:FAP-scFv).
3. Mescolare accuratamente agitando e agitando.
4. Incubare la reazione al buio a temperatura ambiente per 2 ore.
5. Rimuovere il colorante non legato utilizzando una colonna di desalinizzazione. Conservare il prodotto coniugato finale a 4 °C al buio.

5. Sonda molecolare scFv-FAP-ICG per la valutazione del grado di attività dei fibroblasti nei PCLS

1. Dopo aver tagliato il PCLS, posizionare una sezione per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti. Sciacquare ogni pozzetto due volte con 1 ml di PBS per rimuovere il sangue e i detriti residui.
2. Immergere il PCLS in 1 ml di DMEM senza FBS. Aggiungere scFv-FAP-ICG a una concentrazione finale di 5 μg/mL. Incubare su agitatore a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente, al riparo dalla luce.
3. Lavare i campioni con PBS tre volte, ciascuna per 5 minuti.
4. Acquisisci immagini a fluorescenza ICG di PCLS utilizzando il sistema di imaging animale in vivo con le seguenti impostazioni: lunghezza d'onda di eccitazione a 785 nm e lunghezza d'onda di emissione a 810 nm.
5. Valutare l'attività della fibrosi del PCLS in base all'intensità della fluorescenza. Definisci le regioni di interesse (ROI) utilizzando un software compatibile, con radianza di fluorescenza espressa in fotoni/s/cm²/sr.
   1. Fare clic sul pulsante Seleziona ROI per consentire al software di delineare automaticamente l'area pseudo-colorata. Se il posizionamento del ROI non è accurato, regola manualmente. Fare clic su Calcola per determinare la potenza del segnale all'interno della regione. Se sono selezionate più sottoregioni, sommare i valori di tutte le sottoregioni.

Results

La procedura di preparazione per PCLS di tessuto polmonare umano è illustrata nella Figura 1. Il tessuto polmonare umano è stato incorporato nell'agarosio e successivamente tagliato in blocchi di tessuto di circa 1 cm³ utilizzando una lama di rasoio. I tessuti tagliati e appiattiti sono stati fissati su una piattaforma per il sezionamento a 600 μm di spessore utilizzando un microtomo (Figura 1A, B). I PCLS sono stati incubati in piastre a 12 pozzetti ...

Discussion

Attraverso i metodi di ricerca di cui sopra, sono stati preparati PCLS da donatori sani e pazienti con IPF. Contemporaneamente, le cellule di mammifero sono state utilizzate per esprimere frammenti variabili a catena singola di FAP e la loro purezza e specificità sono state verificate. Una sonda molecolare mirata alla FAP e marcata con ICG è stata impiegata per rilevare i livelli di espressione della FAP, riflettendo il grado di attivazione dei fibroblasti. Questo approccio fornisce un m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % tripsina-EDTA	Gibco	15050-057
2× Colore SYBR Verde qPCR Master Mix (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
Siringa da 20 ml	Vincitore	V532159
cella 293T	Beyotime	C6008
502 colla	Zhuolide	D-40
Agarosio, bassa temperatura di gelificazione	Sigma Aldrich	A9414-25G
Anticorpo anti-collagene I	abcam	ab138492
Anticorpo anti-fibronectina	abcam	ab2413
Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
Blade	Gillette	7in83a7Q
Kit di trascrizione inversa a colori (con dispositivo di rimozione del gDNA)	EZBioscience	A0010CGQ
Coomassie Blue Super Fast Soluzione colorante	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
Pallone di Erlenmeyer	Sichuan Shunbo	GG-17
FAP Coniglio mAb	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
Pinze	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
Microbilancia IPTG	MCE	367-93-1
	Secura	Secura225D-1CN
microonde	Mideo	PM2002
di imaging animale in vivo multimodale	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
Citometro a flusso NovoCyte	ACEA  Biosciences	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
Purificazione universale dell'RNA	EZBioscience	EZB-RN4
Vibratomo	DOSAKA	DTK-1000N
β-actina Coniglio pAb	Yeasen	30102ES
Primer
β-primer di actina-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-primer di actina-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP primer-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP primer-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
Collagene-I primer-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
Collagene-I primer-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
Primer per Fibronectina-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
Primer per Fibronectina-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA