Articolo metodologico

Modello murino di parodontite avanzata indotta da legatura di nylon nel secondo molare superiore

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DOI:

10.3791/67848

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30 maggio 2025

 ,  , 
1Undergraduate Program of Dental Surgeon, Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FES-Iztacala), Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM), 2Innate Immunity Laboratory, Biomedicine Research Unit (UBIMED), FES-Iztacala, UNAM, 3Doctoral Program in Biological Sciences, UNAM

In questo articolo

Sommario

Questo studio descrive un metodo di legatura in nylon 6-0 modificato per indurre la parodontite nei topi, che è altamente riproducibile e rappresenta un'alternativa per i ricercatori per studiare la malattia parodontale dal suo sviluppo alle sue conseguenze patologiche.

Abstract

La malattia parodontale (PD) è una malattia infiammatoria che colpisce i tessuti di supporto dei denti ed è una delle malattie più diffuse in tutto il mondo. La sua forma grave, la parodontite, porta alla distruzione dei tessuti molli, dei denti e delle ossa. Modelli animali di parodontite sono stati sviluppati utilizzando primati, cani, maiali in miniatura e topi. Tra questi, il modello murino indotto dalla legatura offre vantaggi come la rapida progressione della malattia, la riproducibilità, la prevedibilità e il basso costo, replicando efficacemente gli aspetti chiave della parodontite umana. I modelli murini che utilizzano legature hanno fornito preziose informazioni sui microambienti microbiologici e immunologici del tessuto parodontale, evidenziando il ruolo critico dei biofilm nelle risposte immunitarie e la loro associazione con le malattie sistemiche. Questo studio presenta un metodo di legatura in nylon modificato per indurre la parodontite nei topi. La modifica prevede l'utilizzo di una sutura di nylon invece di una sutura di seta e il suo posizionamento sotto l'area di contatto interprossimale piuttosto che farla passare attraverso il punto di contatto. Questo approccio semplifica la tecnica inducendo efficacemente la parodontite. La metodologia dettagliata per il posizionamento della sutura è illustrata graficamente e la progressione della parodontite è dimostrata attraverso analisi istologiche e istometriche.

Introduzione

La malattia parodontale (PD) è un disturbo infiammatorio dei tessuti di sostegno dei denti ed è tra le malattie più diffuse al mondo1; è stato riportato che l'incidenza della malattia di Parkinson varia dal 20% al 50% in tutto il mondo2. La malattia di Parkinson ha diversi gradi di progressione; la sua forma lieve, chiamata gengivite, colpisce solo i tessuti molli e la sua forma grave, chiamata parodontite (PT), colpisce i tessuti duri come l'osso3. Poiché la PT è una malattia infiammatoria, deve essere considerata una risposta immunitaria complessa che può essere modificata da diversi fattori di rischio che possono alterare il processo della malattia4, come il diabete mellito5, le malattie cardiovascolari6, le interazioni ormonali come gli esiti avversi della gravidanza7 o la preeclampsia8, le malattie infiammatorie9 e persino le alterazioni oculari10 o la demenza11.

Pertanto, per comprendere l'eziologia associata allo sviluppo o alla prevalenza del PT, per testare nuove o più efficaci strategie terapeutiche, o per identificare qualsiasi correlazione tra malattie sistemiche e PT o il microbiota parodontale, sono necessari modelli animali12.

La scelta di un metodo di ricerca efficace è fondamentale per comprendere lo sviluppo del PT e rispondere adeguatamente alle domande di ricerca13. Nel corso degli anni sono stati sviluppati diversi modelli animali per lo studio del PT; Tuttavia, modelli come primati, cani, conigli e maiali in miniatura sono costosi e complessi da usare 14,15,16. I modelli murini di PT, in particolare il modello PT indotto dalla legatura, presentano numerosi vantaggi, tra cui rapido sviluppo, riproducibilità, prevedibilità e basso costo 17,18,19.

Sebbene vengano utilizzati diversi metodi per indurre il PT, come l'inoculazione batterica orale, l'iniezione di lipopolisaccaridi e l'induzione della legatura10,20, ognuno ha vantaggi e svantaggi17, il modello murino di PT indotto dalla legatura del nylon assomigliava al meccanismo umano per il suo sviluppo 20,21,22,23. La PT si verifica attraverso la ritenzione del microbiota residente, causando infiammazione e portando alla perdita di tessuto. Inoltre, i topi possono essere geneticamente modificati per studiare diverse popolazioni cellulari o molecole di interesse per lo studio del PT.

La legatura dentale può essere eseguita utilizzando diversi materiali, come fili ortodontici, suture di seta 24,25 o suture di nylon26. Il materiale più comune per indurre PT mediante legatura nei topi è la seta; questa metodologia è stata spiegata da diversi autori, come Marchesan et al.18, Abe et al.27 e Chadwick et al.22, ognuno con le proprie modifiche, e tutti questi metodi sono stati utilizzati con successo da diversi ricercatori28. Tuttavia, posizionare una sutura di seta attorno ai molari superiori nei topi può essere complesso. Marchesan et al. hanno suggerito l'uso di un "portalegature"; Abe et al. e Chadwick et al. hanno posizionato la sutura attraverso il punto di contatto, sebbene Chadwick et al. l'abbiano posizionata attorno ai molari M1 e M2.

Suture in nylon di diversi spessori sono state utilizzate per lo sviluppo di PT in diversi modelli animali 29,30,31. Lima et al.31 hanno utilizzato suture di nylon 5-0; In studi precedenti, abbiamo utilizzato suture di nylon 6-0 con risultati simili28.

Rispetto alle suture multifilamento, le suture in nylon sono sintetiche monofilamento non riassorbibili e presentano una risposta tissutale infiammatoria inferiore32; inoltre, le suture in nylon consentono anche l'accumulo microbico33,34 e ci sono prove dell'adesione di Fusobacterium nucleatum e Porphyromona intermedia35,36, insieme a batteri anaerobi facoltativi nelle suture in nylon 12,14,17,19,24,27,35,37 (Tabella 1).

Queste caratteristiche possono consentire che la risposta infiammatoria si concentri principalmente sull'accumulo batterico piuttosto che sull'accumulo di materiale. Inoltre, il nylon ha proprietà meccaniche migliori, come la resistenza alla trazione, rispetto alla seta38.

Pertanto, nel presente studio, la sutura in nylon 6-0 posizionata intorno a M2 sotto l'area di contatto interprossimale ha indotto lo sviluppo di parodontite in stadio avanzato nel topo. Questo approccio consente il posizionamento della legatura con pinzette normali e i risultati sono coerenti. Dopo 30 giorni, lo sviluppo del PT può essere confermato dall'analisi istometrica e istologica.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono animali da esperimento sono state condotte nel rigoroso rispetto del "Quadro etico per la ricerca biomedica sugli animali da laboratorio", seguendo lo standard ufficiale messicano NOM-062-ZOO-1999. Questo studio è stato approvato dal comitato etico della Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FES-Iztacala) con protocollo CE/FESI/072024/1765. I topi sono stati alloggiati in camere per animali con libero accesso a cibo e acqua in un ambiente privo di agenti patogeni presso la struttura per animali FES-Iztacala. Questo protocollo è una modifica del metodo precedentemente descritto da Abe et al.27. Le femmine di topi BALB/c di sei-otto settimane (del peso di 16 g) sono state divise in gruppi di controllo (CTL) e parodontite (PT). La parodontite è stata indotta posizionando una sutura di nylon 6-0 il giorno 0 per promuovere un'adesione batterica sostenuta e innescare una progressione grave e cronica della malattia. Dopo 30 giorni, tutti i topi sono stati soppressi (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) per valutare il danno tissutale e la perdita di attaccamento (AL) attraverso l'analisi istometrica (Figura 1). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dell'anestesia

  1. Preparare una diluizione di xilazina e ketamina (1:10) con acqua iniettabile (brodo). Conservare a 4 °C e consumare entro 4 settimane.
  2. Identifica e pesa ogni topo. Preparare una dose basata sul peso di xilazina (1 mg/kg) e ketamina (2 mg/kg) per l'applicazione intramuscolare utilizzando una siringa da insulina.
  3. Iniettare il 50% della dose totale della soluzione anestetica nel quarto posteriore. Ripetere la procedura sul lato opposto.
  4. Metti i topi in una scatola profonda (10 cm³) e lasciali addormentare, il che richiede circa 3-5 minuti.
  5. Prevenire la secchezza oculare e i danni alla cornea dovuti all'anestesia applicando una goccia di ipromellosa su ciascun occhio ogni 15 minuti fino a quando i topi non sono completamente svegli e possono sbattere le palpebre normalmente.
    NOTA: I topi devono essere tenuti sotto osservazione per 45 minuti, la durata approssimativa dell'anestesia. Se un mouse si riattiva prima del completamento della procedura, la procedura deve essere sospesa e il mouse deve essere sostituito.

2. Posizionamento degli animali

  1. Una volta che il mouse è addormentato, posizionarlo su un tavolo da lavoro rivolto verso l'alto con la testa rivolta verso l'operatore. Tirare delicatamente ogni gamba senza tensione e fissarla con del nastro microporoso per evitare movimenti involontari improvvisi. Copri il topo con una coperta o una garza per mantenere il calore corporeo.
  2. Per mantenere il muso aperto, posizionare un'estremità di un elastico ortodontico attorno agli incisivi superiori e fissare l'altra estremità a un supporto superiore senza tensione. Posizionare un secondo elastico ortodontico attorno agli incisivi inferiori e fissarlo a un supporto inferiore con un elastico.
  3. Posizionare i separatori di guance e spostare con cautela la lingua da un lato per una migliore visibilità.
  4. Posizionare il microscopio in modo da consentire un'adeguata visualizzazione dei molari superiori, iniziando dall'obiettivo di ingrandimento più basso. Una volta individuato, regolare l'ingrandimento per garantire un comfort e una messa a fuoco ottimali per l'operatore.

3. Posizionamento della legatura

  1. Una volta che l'immagine è chiara, identifica i tre molari superiori: il molare più grande e prossimale (M1), il molare successivo (M2) e il molare più piccolo e distale (M3). Posizionare una sutura in nylon 6-0, poiché il suo diametro facilita il posizionamento della legatura e provoca meno danni meccanici ai tessuti rispetto alle suture più larghe.
    1. Individuare il lato distale di M2, tenere la punta della sutura di nylon 6-0 con una pinzetta e posizionare la punta alla base della papilla dal palatino. Applicare una leggera pressione attraverso la base dello spazio palatale interprossimale verso la superficie vestibolare (Figura 2A).
    2. Una volta che la sutura in nylon 6-0 si incrocia, tirarla attraverso lo spazio interprossimale verso il lato vestibolare (Figura 2B).
  2. Posizionare la punta della sutura di nylon 6-0 alla base dell'area interprossimale sulla superficie mesiale di M2 dal lato vestibolare. Spingere delicatamente la punta della sutura per attraversarla sotto lo spazio interprossimale e farla passare attraverso lo spazio vestibolare fino al palatino (Figura 2C).
  3. Tirare delicatamente la sutura in nylon 6-0, tenere la punta con una pinzetta, regolarla intorno a M2 e fissare la sutura con tre semplici nodi.
  4. Tagliare la sutura di nylon 6-0 con le forbici sottili (Figura 2D).

4. Recupero degli animali

  1. Per rilasciare il mouse, rimuovere i separatori delle guance, il nastro microporoso dalle gambe e gli elastici ortodontici. Per prima cosa, rimuovere l'elastico attorno agli incisivi inferiori, quindi rimuovere l'elastico attorno agli incisivi superiori.
    1. Rimuovi il mouse dal piano di lavoro, avvolgilo in una garza o in un panno e posizionalo a faccia in su. Mantenere la lingua di lato per mantenere aperte le vie aeree e prevenire l'ostruzione.
  2. Tenere l'animale al caldo, coperto con un panno o una garza, e sotto osservazione fino a quando non è completamente sveglio. Quindi, mettili nelle loro gabbie regolari.
  3. Applicare una goccia di ipromellosa in ciascun occhio fino a quando il mouse non può sbattere le palpebre normalmente.
  4. Tenere l'animale in condizioni standard.

5. Controllo della legatura

  1. Controllare la permanenza della legatura in nylon ogni settimana (Figura 3A, B).
  2. Prendi il mouse, tieni saldamente la testa e il corpo e usa una pinzetta per aprire il muso. Osservare la sutura di nylon 6-0 attorno a M2 sotto la luce di una lampada.
  3. Stabilire lo sviluppo della malattia parodontale in base all'accumulo di biofilm e all'irritazione meccanica. Verificalo attraverso l'analisi istologica.

6. Istologia

  1. Dopo 30 giorni, sopprimere i topi in una camera di CO2 (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Raccogliere le mascelle come precedentemente riportato39. Lavare i fazzoletti prelevati in una soluzione di NaCl allo 0,9% e metterli in nuove provette da microcentrifuga etichettate.
  2. Fissare i campioni in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 2 ore agitando.
  3. Lavare i campioni con acqua di rubinetto per 2 ore.
  4. Per rimuovere i minerali dall'osso e preparare sezioni di paraffina di alta qualità, decalcificare i campioni in venti volumi di una soluzione di EDTA al 4% (pH 7,3) per 20 giorni in provette da microcentrifuga, cambiare l'EDTA ogni 4 giorni40.
  5. Incorporare i campioni nella paraffina. Tagliare sezioni di 5 μm dell'area M2 e colorarle con ematossilina ed eosina (H&E)41.

7. Analisi dei dati

  1. Osservare le sezioni istologiche colorate al microscopio ottico per eseguire un'analisi descrittiva dei cambiamenti nella configurazione dell'epitelio del solco, delle fibre gengivali, delle fibre parodontali, dell'altezza e dell'integrità della cresta alveolare.
  2. Determinare la perdita di attacco (AL) misurando la distanza tra la giunzione cemento-smalto (CEJ) e il punto più alto della cresta ossea. Traccia una linea tra questi due punti utilizzando un programma di editing digitale. Eseguire analisi istometriche sulle superfici buccale e palatale secondo la metodologia descritta da Semenoff et al.42 (Figura 4).

8. Analisi statistica

  1. Analizza i dati ottenuti dai gruppi CTL e PT utilizzando il test U di Mann-Whitney. Considera p < 0,05 come statisticamente significativo. Utilizza statistiche e software grafici per l'analisi.

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Risultati

Questa metodologia consente ai topi indotti di sviluppare la parodontite (PT) dalla seconda settimana in poi. I topi sono stati monitorati settimanalmente per verificare la presenza della legatura. L'eutanasia è stata eseguita il giorno 30. Sono state valutate le caratteristiche cliniche di tutti i gruppi. Il gruppo di controllo ha mantenuto nel tempo caratteristiche normali, come il colore e la struttura della gengiva marginale. Rispetto a quelli del gruppo CTL, i tessuti del gruppo PT hanno mostrato infiammazione, sang...

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Discussione

Diversi modelli animali di parodontite sono stati utilizzati per valutare diversi aspetti, come le risposte microbiologiche e immunitarie, e presentano alcune somiglianze con la malattia umana43. Questi risultati forniscono prove del quadro della malattia parodontale, come il ruolo dei biofilm, la risposta immunitaria e le interazioni con le condizioni sistemiche44,45.

I modelli...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non vi sono conflitti di interesse in merito alla pubblicazione di questo articolo.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Consiglio per la Scienza e la Tecnologia dello Stato del Messico (COMECYT) numero di sovvenzione [FICDTEM-2021-072] e dal Programma di sostegno per i progetti di ricerca e l'innovazione tecnologica (PAPIIT)-UNAM, numero di sovvenzione [IN-217021]. Ringraziamo il programma di specializzazione in Endoperiodontología, FES Iztacala, UNAM per le strutture fornite per realizzare questo video e Rosalba Yañez Ortiz, DDS, per il suo supporto nella realizzazione di questo video. Alcune figure sono state create con il programma Biorender (Contratto numero ME282NWCI1).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di NaCl allo 0,9% PiSARisciacquo mascelle 
Sutura in nylon 6-0Atramat, Internacional Farmacé uticaPE1946-NPosizionamento legatura
Amscope 3.7 programma per fotocamera digitaleAmscope x64, 4.11.21973.20230107per la raccolta dei dati
 Sigma– AldrichE5134Decalcificazione 
Forbici finigenerichePer tagliare la sutura in nylon 6-0
Pinze per tessuti finigenericheSutura in nylon 6-0
GarzagenericaPer mantenere la temperatura corporea
GraphPad Prism GraphPad Prism Versione 8.3.0Analisi dei dati 
Ipromellosagenerica Lubrificante per gli occhi
Acqua iniettabilePisaDiluizione della soluzione anestetica
KetaminaAnesket, PisaAnesthetic
Micro provette per centrifuga Cellpro801501Per contenere i tessuti durante la decalcificazione 
Micropori3M 1533Per fissare il mouse
microscopio fotocamera digitaleAmscope Istologia MU1603 
MicrotubiAxygenMCT-150-CConservare la diluizione dell'anestetico
Microscopio ottico Istologia UNICOSerie G380 
Elastici orhodonticiTP Orthodintics, Inc bluPer tenere il muso aperto 
Soluzione di paraformaldeideSigma– Aldrich158127Fissazione dei tessuti 
Paraplast IstologiaLeica 39601006 
Microscopio operatorio Carl Zeiss GmbH Berlino6-0 sutura in nylon
Siringhe da insulina ultra fini 6 mm U-100, 0,3 mLBD326385Per iniettare la soluzione anestetica 
Elastici universali generico Per mantenere il muso aperto 
Piano di lavoro genericoBase in legno per sostenere i topi 
XilazinaPorcina, PisaPreanestetico
Soluzione EDTA

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