Questo studio valuta la tolleranza alla siccità mediata da Arabidopsis DREB1A nella canna da zucchero transgenica. Sotto stress, sono stati osservati un miglioramento della fotosintesi, dell'efficienza nell'uso dell'acqua e dell'accumulo di biomassa. DR-21 ha mostrato la più alta espressione di DREB1A , migliorando la resilienza alla siccità. I risultati forniscono informazioni sui meccanismi molecolari e offrono una potenziale strategia per lo sviluppo di varietà di canna da zucchero resistenti al clima in regioni con acqua limitata.
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Articolo di ricerca
Miglioramento della fotosintesi e dell'efficienza nell'uso dell'acqua nella canna da zucchero transgenica che esprime Arabidopsis DREB1A in condizioni di stress da siccità
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo stress da siccità impone una limitazione critica alla produttività della canna da zucchero, rendendo così necessario lo sviluppo di cultivar resistenti allo stress per un'agricoltura sostenibile. Il presente studio mirava a migliorare la tolleranza alla siccità nella canna da zucchero introducendo il gene Arabidopsis DREB1A sotto il controllo del promotore rd29A inducibile dallo stress. Le linee transgeniche di canna da zucchero sono state generate tramite trasformazione mediata da bombardamento di particelle e successivamente valutate attraverso valutazioni molecolari, fisiologiche e agronomiche in condizioni controllate e stressate dalla siccità.
L'analisi molecolare ha confermato un'integrazione transgenica stabile, con linee transgeniche che mostrano un aumento fino a 10 volte dell'espressione di DREB1A rispetto alle piante wild-type. Le valutazioni fisiologiche hanno dimostrato che, in condizioni di stress da siccità al 60% della capacità di campo (FC), le linee transgeniche hanno mantenuto tassi fotosintetici (PN) superiori del 224-270%, la conduttanza stomatica (gs) aumentata dell'84-167% e il contenuto relativo di acqua (RWC) è aumentato del 25-31% rispetto ai controlli non transgenici. Inoltre, le foglie della canna da zucchero transgenica hanno mostrato una migliore regolazione osmotica e l'efficienza nell'uso dell'acqua. Le valutazioni agronomiche hanno inoltre rivelato miglioramenti significativi nella crescita e nella produttività delle piante. In condizioni di stress da siccità (60% FC), le linee transgeniche hanno mostrato un'altezza della canna maggiore del 76-109%, con un diametro della canna del 71-86% più grande. La biomassa dei germogli è aumentata del 39-87% e la biomassa delle radici è aumentata del 65-103%.
Inoltre, la percentuale Brix, indicativa dell'accumulo di saccarosio, è aumentata del 36-55% nelle piante transgeniche al 60% di FC. Questi risultati stabiliscono una solida correlazione tra l'espressione di DREB1A , una maggiore resilienza fisiologica e un miglioramento delle prestazioni agronomiche in condizioni di siccità. La capacità della canna da zucchero transgenica che esprime DREB1A di sostenere una maggiore attività fotosintetica, una superiore efficienza nell'uso dell'acqua e un maggiore accumulo di biomassa sottolinea il suo potenziale come strategia genetica per lo sviluppo di varietà di canna da zucchero resistenti alla siccità. Questo studio offre nuove intuizioni sui meccanismi molecolari alla base della tolleranza alla siccità e fornisce un approccio promettente per garantire una coltivazione sostenibile della canna da zucchero nelle regioni con scarsità d'acqua.
Introduzione
La canna da zucchero (Saccharum officinarum L.) è la seconda coltura da reddito del Pakistan, coltivata principalmente per il suo alto contenuto di saccarosio. Tuttavia, la produzione ottimale viene raramente raggiunta a causa delle periodiche carenze idriche 1,2. È un membro della famiglia delle Poaceae ed è raggruppato nel clade PACCAD della sottofamiglia Panicoideae3. I membri di questo clade sono spesso indicati come erbe della stagione calda e mostrano un sistema fotosintetico C4 4. La modalità primaria di fissazione della CO2 nella canna da zucchero è la fotosintesi C4 con fotorespirazione minima5. Le graminacee C4, come la canna da zucchero, possono fissare più CO2 rispetto alle graminacee C3, producendo livelli più elevati di saccarosio e mostrando una migliore efficienza nell'uso dell'azoto (NUE) e dell'acqua (WUE)6,7,8. Tuttavia, i requisiti di umidità del suolo per la canna da zucchero sono piuttosto elevati 9,10,11.
A causa del cambiamento climatico e della limitata disponibilità di acqua, la produzione di varietà di canna da zucchero ad alto rendimento e resistenti allo stress idrico è fondamentale 12,13,14. La tolleranza delle piante allo stress idrico è un tratto multigenico influenzato dall'intensità, dal tempo e dalla durata dello stress. A causa della posizione geografica del Pakistan (30,3753° N, 69,3451° E), le pratiche di allevamento convenzionali non sono fattibili a causa della bassa fioritura e della vitalità del polline15. Pertanto, il miglioramento varietale attraverso l'allevamento tradizionale dipende dalla variazione genetica e dalla successiva selezione dei caratteri agronomici desiderati16. In questo contesto, la trasformazione dei geni correlati allo stress attraverso l'ingegneria genetica è uno degli approcci alternativi più promettenti per migliorare la tolleranza allo stress delle piante 17,18,19.
Le risposte abiotiche agli stress nelle piante sono regolate da più famiglie di fattori di trascrizione (TF) ed elementi cis-agenti, tra cui WRKY, MYB, bHLH, ERF e NAC. Questi TF regolano le reti nella regolazione osmotica, nello scavenging delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), nella regolazione stomatica e nelle vie di segnalazione dello stress 20,21,22,23,24,25,26. Ad esempio, i TF WRKY modulano la segnalazione dello stress attraverso vie ABA-dipendenti, mentre le proteine MYB regolano la biosintesi dei flavonoidi e la funzione stomatica in condizioni di stress da siccità27. Allo stesso modo, i fattori bHLH ed ERF interagiscono con la segnalazione dell'etilene, migliorando così la resilienza alla siccità28. Data la complessità delle risposte allo stress, rivolgersi a regolatori chiave come DREB1A è una strategia promettente per migliorare la tolleranza alla siccità.
In questo studio, abbiamo studiato il ruolo di ArabidopsisDREB1A nella canna da zucchero transgenica, concentrandoci sul suo impatto sulla fotosintesi, sulle relazioni idriche e sui tratti di resa in condizioni di stress idrico. Il ruolo delle proteine leganti DRE (DREB) nella modulazione della tolleranza allo stress idrico è stato riportato in precedenza 27,29,30. Ad esempio, Kasuga et al. hanno osservato che DREB regola positivamente l'espressione della sequenza DRE in Arabidopsis thaliana31. Inoltre, molti ricercatori hanno suggerito che la sovraespressione di DREB1A della canna da zucchero transgenica mostra un'espressione costitutiva di geni inducibili dallo stress e livelli di zucchero più elevati rispetto alla canna da zucchero wild-type 17,28,32,33.
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Protocollo
Generazione di rd29A: vettore di espressione DREB1A (Figura 1)
Il frame a lettura aperta DREB1A a lunghezza intera (ORF, 651 bp) è stato amplificato dal cDNA di Arabidopsis thaliana L. utilizzando primer specifici per gene che incorporano siti di restrizione BamHI ed EcoRI: forward 5/-GGCGGATCCATGAACTCATTTTCTGCT-3/ e reverse 5/-GGCGAATTCTTAATAACTCCATAACGA-3/. Allo stesso modo, il promotore rd29A (499 bp) è stato amplificato dal DNA genomico di Arabidopsis utilizzando primer contenenti siti KpnI e BamHI: forward 5/-GCGGGTACCCCTATTAGAACGATTAAGGAG-3/ e reverse 5/-GGCGGATCCGGTGGTTCCTCTTTGATCC-3/. Le reazioni di PCR sono state effettuate in un volume di 25 μL contenente 2,5 μL di tampone PCR 10x, 1,5 mM di MgCl2, 0,2 mM di ciascun dNTP, 0,4 μM di ciascun primer, 1 U di Taq DNA polimerasi e 1 μL di DNA stampo (circa 100 ng per il DNA genomico o 50 ng per il cDNA), con l'aggiunta di acqua priva di nucleasi al volume finale. Le condizioni di amplificazione per entrambi i frammenti del promotore DREB1A e rd29A erano le seguenti: denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti; 35 cicli di denaturazione a 95 °C per 30 s, ricottura a 58 °C per 30 s ed estensione a 72 °C per 1 min; segue un'ultima prolunga a 72 °C per 7 min. I prodotti amplificati sono stati risolti su un gel di agarosio allo 0,7% e purificati con gel utilizzando un kit di estrazione del gel secondo il protocollo del produttore.
I prodotti amplificati della PCR del promotore DREB1A e rd29A sono stati clonati nel vettore di clonazione, pTZ57R/T, utilizzando il clonaggio TA, e i prodotti sono stati sottoposti a sequenziamento Sanger per conferma. La sequenza DREB1A (Accession No. AM992886) è stato inviato a GenBank (il promotore rd29A è stato inserito nei siti KpnI e BamHI, e la sequenza di codifica DREB1A è stata inserita a valle nei siti BamHI ed EcoRI, sostituendo così il promotore originale 2x35S e posizionando DREB1A sotto il controllo di rd29A. La cassetta finale (rd29A::DREB1A::CamV) è stata asportata utilizzando KpnIed EcoRV e clonata nella regione T-DNA del vettore binario pGA482 per generare il costrutto utilizzato per la trasformazione delle piante (Figura 1). Dopo il sequenziamento Sanger iniziale per convalidare i prodotti clonati, non è stata effettuata alcuna ulteriore verifica del sequenziamento.
Analisi della sequenza genica
Utilizzando lo strumento bioinformatico di riferimento, è stata eseguita un'analisi filogenetica delle sequenze proteiche di AtDREB1A e DREB1 da 13 diverse specie di dicotiledoni e monocotiledoni e confrontata tramite il metodo del neighbor-joining. Le sequenze di amminoacidi sono state recuperate da Phytozome (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) e GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). L'analisi dell'allineamento di sequenze multiple è stata eseguita utilizzando il programma online Clustal Omega. Una volta acquisite le sequenze essenziali da Phytozome e GenBank, non è più necessario il recupero delle sequenze.
Preparazione di espianti e pistola ad induzione per callo20,34
La cultivar di canna da zucchero è stata coltivata nel campo sperimentale di NIBGE, Faisalabad. Dopo 6 mesi, la parte superiore della canna sana è stata asportata per recuperare la regione apicale, che è stata tagliata fino alla gemma terminale. In condizioni sterili, i rotoli di foglie sono stati pelati in segmenti cilindrici di ~5 mm e sterilizzati in superficie con etanolo al 70%. Dalla regione immediatamente sopra il meristema apicale, sono stati preparati circa 10-15 dischi apicali (~3 mm di dimensione) per canna. I dischi sono stati coltivati sul terreno di induzione del callo (CIM) come precedentemente descritto 1,20,34. Dopo 4-6 settimane, i Calli embriogenici risultanti sono stati sottoposti a subcoltura su CIM fresco per un'ulteriore proliferazione. NOTA: L'uso di etanolo al 70% per la disinfezione delle superfici è stato ritenuto sufficiente e non sono state necessarie ulteriori fasi di sterilizzazione.
Trasformazione genetica di rd29A: DREB1A in canna da zucchero attraverso Gene Gun20,34
Il callo embriogenico proliferato era disposto al centro della piastra di Petri contenente CIM. Dopo 3 giorni, i calli sono stati bombardati con un vettore binario esprimibile in oro rivestito d'oro, pGA482, contenente rd29A: DREB1A, utilizzando un fucile biolistico PDS-1000/He come descritto in dettaglio34. Dopo il bombardamento, piccole porzioni di calli sono state coltivate su CIM per 3 giorni e poste al buio a 26 ± 2 oC. Successivamente, i calli sono stati coltivati su terreno di selezione del callo (CSM) contenente 60 mg/L di geneticina, sottoposti a subcoltura su CSM ogni 10 giorni e posti al buio a 26 ± 2 oC.
Dopo 30 giorni, i calli sani sono stati coltivati su un terreno di selezione per la rigenerazione (RSM) contenente 60 mg/L di antibiotico per ottenere germogli. Le piastre sono state poste in una stanza di crescita per 4 settimane a temperatura controllata (26 ± 2 °C), 16 h/8 h di fotoperiodo luce/buio, 500 μmol m-2 s-1 di intensità luminosa e umidità controllata35. I germogli sanitari rigenerati sono stati coltivati su terreno di selezione radicante (RtSM) contenente 60 mg/L di antibiotico in barattoli di vetro e posti nella camera di crescita nelle condizioni sopra menzionate. Dopo 4-6 settimane, i trasformanti putativi sono stati trasferiti in piccoli vasi di plastica contenenti terriccio sabbioso sterilizzato e posti nella stanza di crescita nelle condizioni sopra menzionate. Non è più necessaria la sub-coltura del terreno di selezione del callo (CSM) oltre i 10 giorni.
Conferma molecolare di piante di canna da zucchero transgeniche
Come descritto in precedenza, il DNA genomico è stato isolato dalle foglie giovani di presunte piantine di canna da zucchero transgeniche utilizzando il metodo di estrazione CTAB36. La qualità e la concentrazione del DNA sono state valutate utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop e l'elettroforesi su gel di agarosio. L'amplificazione PCR del gene marcatore selezionabile nptII (750 bp) e del transgene DREB1A (651 bp) è stata eseguita utilizzando primer specifici per il gene elencati nella Tabella 1. Ogni reazione PCR da 25 μL conteneva 1 tampone PCR, 2,5 mM di MgCl₂, 0,2 mM di dNTP ciascuno, 0,4 μM di ciascun primer, 1 U di Taq DNA polimerasi, ~100 ng di DNA genomico e acqua deionizzata in volume. Le reazioni sono state eseguite in un termociclatore nelle seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti; 35 cicli a 94 °C per 30 s, 58 °C per 30 s, 72 °C per 45 s; seguita da un'estensione finale a 72 °C per 5 minuti. I prodotti PCR sono stati risolti su un gel di agarosio all'1% e visualizzati sotto luce UV per confermare l'amplificazione. Le piantine transgeniche PCR-positive (T0) sono state quindi trasferite in grandi vasi di terracotta e indurite in un ambiente di serra controllato fino alla maturità. Al momento della maturazione, i segmenti di canna provenienti da cinque eventi di T₁ confermati da PCR selezionati casualmente sono stati piantati e propagati in microappezzamenti per 12 mesi per generare set clonali sufficienti per l'esperimento sullo stress da siccità. NOTA: Una volta confermati i geni nptII e DREB1A , non sono state eseguite ulteriori amplificazioni PCR.
Studio dell'espressione di DREB1A
L'espressione relativa di DREB1A nelle foglie stressate di piante di canna da zucchero transgeniche e non transgeniche è stata quantificata mediante PCR in tempo reale (qPCR). L'RNA totale è stato isolato da ~100 mg di tessuto fogliare utilizzando il reagente di estrazione secondo il protocollo del produttore. La qualità dell'RNA è stata verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio e quantificata utilizzando uno spettrofotometro. Per ogni campione, 2 μg di RNA sono stati trascritti in senso inverso utilizzando il kit di sintesi del cDNA seguendo le istruzioni del fornitore, con primer oligo(dT).
Il cDNA risultante è stato utilizzato come stampo per amplificare un DREB1A di 188 bp utilizzando primer specifici per il gene: 5'-ACAGAGGAGTTCGTCGGAGA-3' e 5'-GAGTCTCCAAGCCGAGTCAG-3' inverso. Ogni reazione qPCR da 25 μL conteneva 12,5 μL di 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,4 μM di ciascun primer, 2 μL di cDNA diluito (~100 ng di stampo) e acqua priva di nucleasi per portare il volume a 25 μL. Le reazioni sono state eseguite in triplicato su un termociclatore utilizzando il seguente programma: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 min, seguiti da 40 cicli di 95 °C per 30 s, 56 °C per 30 s e 72 °C per 30 s, con un'estensione finale a 72 °C per 10 min.
Per confermare l'efficienza e la linearità delle reazioni qPCR, è stata inizialmente generata una curva standard utilizzando diluizioni seriali di 10 volte del DNA plasmidico contenente il frammento DREB1A clonato. Tuttavia, per l'analisi dell'espressione, la quantificazione relativa è stata eseguita utilizzando il metodo 2−ΔΔCt 37. Il gene dell'actina è servito come riferimento endogeno e il livello di espressione di DREB1A in ciascuna linea transgenica è stato normalizzato a quello del controllo wild-type. Tutti i valori di Ct sono stati raccolti utilizzando le impostazioni di base e di soglia automatiche consigliate dal software dello strumento. Sono state accettate solo curve di fusione con picchi singoli e netti, confermando la specificità. L'RNA di alta qualità e non degradato era essenziale per una quantificazione accurata. I campioni di RNA impuri o degradati sono stati esclusi per evitare di compromettere l'affidabilità della sintesi del cDNA e dell'analisi dell'espressione genica a valle.
Studio dei cambiamenti mediati da DREB1A nella canna da zucchero: esperimento sullo stress idrico20,34
Dopo 1 anno, tre repliche di cinque segmenti di canna (due nodi/segmento) di piante transgeniche e non transgeniche (wild-type) sono state seminate a 5 cm di profondità in vasi di terracotta contenenti 18 kg di terreno (ECe 1.34; SAR 2,72; pH 7,8). Sono stati applicati tre regimi di stress idrico: 100, 80 e 60% FC ( Tabella 2). L'attività fotosintetica della canna da zucchero (PN, E e gs) e le relazioni idriche delle piante (Ψw, Ψs e RWC) sono state studiate dopo 12 mesi. Non modificare i regimi idrici stabiliti, poiché ciò influirà sulla consistenza dei trattamenti.
Determinazione dell'attività fotosintetica
Dopo 180 giorni di stress idrico, i parametri di scambio gassoso - tasso di fotosintesi (PN), tasso di traspirazione (E) e conduttanza stomatica (gs) - sono stati misurati sia in piante di canna da zucchero transgeniche che selvatiche utilizzando un sistema di fotosintesi portatile. Le misurazioni sono state effettuate tra le 09:00 e le 11:00 utilizzando la terza foglia completamente espansa dalla cima di ogni pianta. L'anta selezionata è stata inserita delicatamente nella camera dell'anta trasparente incorporata (3 cm2 area di morsetto), garantendo un contatto completo senza pieghe o ostruzioni. Le condizioni ambientali sono state registrate in tempo reale dal sistema, mentre l'intensità della luce è stata mantenuta a circa 1.000 μmol m-2 s-1 sotto la luce solare naturale. Il dispositivo è stato lasciato equilibrare per 30-60 s fino a quando non sono state ottenute letture allo stato stazionario per l'assimilazione della CO2 e lo scambio di vapore acqueo. I sensori interni dello strumento registravano automaticamente la temperatura fogliare, l'umidità relativa e la concentrazione di CO2 nell'ambiente. Per ogni genotipo e trattamento, le misurazioni sono state replicate su almeno tre piante biologicamente indipendenti e i dati sono stati archiviati internamente e successivamente esportati per l'analisi. È stata prestata attenzione a mantenere condizioni ambientali coerenti tra le repliche per garantire l'affidabilità dei dati.
Determinazione del potenziale idrico fogliare e del potenziale osmotico
Il potenziale idrico (Ψw) della terza foglia completamente espansa dalla sommità delle piante è stato determinato utilizzando la camera a pressione di tipo Scholander. Le foglie sono state poi congelate a -20 oC in provette da 1,5 mL e la linfa cellulare ottenuta dalle foglie congelate è stata utilizzata per analizzare il potenziale osmotico (Ψs) utilizzando l'osmometro.
Determinazione del contenuto d'acqua relativo alle foglie
Il contenuto d'acqua delle foglie delle piante transgeniche e selvatiche è stato esaminato in dettaglio. Sono stati misurati i pesi freschi delle foglie e le foglie sono state immerse in acqua distillata per una notte. Successivamente è stato registrato il peso turgido delle foglie, mentre il peso secco è stato determinato incubando le foglie a 70 °C per 72 h. La RWC fogliare è stata calcolata utilizzando la seguente formula:
NOTA: Per analizzare con precisione il potenziale osmotico utilizzando un osmometro, le foglie devono essere congelate a -20 °C una volta determinato il potenziale idrico.
Attributi di rendimento
I caratteri di resa della canna da zucchero sono stati misurati nella fase di raccolta, come l'altezza della canna (cm), il diametro, il numero di canne fresabili, il grado brix (%) e la biomassa di germogli e radici.
Analisi statistiche
Gli esperimenti sul campo (controllati utilizzando una recinzione) sono stati eseguiti utilizzando un layout di progettazione a blocchi completi randomizzati con tre repliche per trattamento (cinque piante per replica; n = 15). È stata eseguita un'analisi bidirezionale della varianza per analizzare i cambiamenti in diversi caratteri agronomici e fisiologici a un livello di significatività di P ≤ 0,05.
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Risultati
Caratterizzazione molecolare di linee transgeniche di canna da zucchero
La cassetta di espressione rd29A: DREB1A è stata costruita e clonata nel vettore binario esprimibile dalla pianta pGA482 (Figura 1), che è stato poi trasformato nel genoma della canna da zucchero utilizzando la tecnica di trasformazione biolistica-mediata e ha sviluppato con successo piantine di canna da zucchero transgeniche come descritto (Figura 2). La presenz...
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Discussione
Lo sviluppo della tolleranza allo stress idrico nelle piante è fondamentale a causa della continua espansione delle regioni soggette a siccità in tutto il mondo. Come approccio biotecnologico potenzialmente fattibile, abbiamo studiato il ruolo di DREB1A nella tolleranza allo stress idrico nelle linee transgeniche di canna da zucchero. Studi precedenti hanno riportato il ruolo del fattore di trascrizione DREB1A nell'indurre l'espressione di più geni che conferiscono toll...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ricercatori dell'Università della Principessa Nourah bint Abdulrahman che sostengono il numero del progetto (PNURSP2025R39), Università della Principessa Nourah bint Abdulrahman, Riyadh, Arabia Saudita.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
Tutti i dati sono forniti in questo documento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vettore di clonazione, pTZ57R/T | Fermentas, Vilnius, Lituania | ||
| analizzatore di scambio gassoso a infrarossi | Bio-Rad, California, Stati Uniti | ||
| Osmometro | Bio-Rad, California, Stati Uniti | ||
| Macchina per PCR | Bio-Rad, California, Stati Uniti | ||
| PDS-1000/He Pistola biolistica | ThermoFisher Sceintific Inc, Stati Uniti | ||
| PCR in tempo reale | ThermoFisher Sceintific Inc, Stati Uniti | ||
| Kit di sintesi del cDNA RevertAid | CI-340, CID Bio-Science, Inc., Stati Uniti | ||
| Camera a pressione di tipo Scholander | Skye instruments, Llandrindod Wells, Birmingham, Regno Unito | ||
| Reagente TRIzol | Wescor-5500, Logan, Utah, Stati Uniti |
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