Questo protocollo descrive un metodo per indurre l'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) nei topi per studiare la progressione della fibrosi tissutale nella nefropatia ostruttiva. Include procedure chirurgiche, cure post-operatorie e metodi per la valutazione della fibrosi.
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Articolo metodologico
Modello di ostruzione ureterale unilaterale per lo studio della fibrosi interstiziale renale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fibrosi renale è l'esito patologico finale della malattia renale cronica progressiva (CKD). Il modello di ostruzione ureterale unilaterale (UUO) è ampiamente utilizzato per chiarire i meccanismi molecolari e cellulari alla base della fibrosi interstiziale renale e per identificare potenziali bersagli terapeutici. Questo modello si è stabilito nei topi attraverso la legatura chirurgica di un uretere unilaterale, una procedura relativamente semplice e facile da eseguire. Tuttavia, il modello murino UUO è noto per mostrare una significativa variabilità e incoerenza, influenzate da fattori quali il ceppo del topo, l'età, il sesso, il tipo di anestesia, la durata dell'intervento chirurgico, la temperatura corporea durante la procedura, le capacità chirurgiche dell'operatore, le condizioni di alimentazione e lo stato di salute generale dei topi. Le variazioni nelle tecniche chirurgiche, nel posizionamento della sutura e nella durata dell'ostruzione contribuiscono alla variabilità dei risultati. Inoltre, il campionamento incoerente dei reni ostruiti aumenta ulteriormente la variabilità nella valutazione della fibrosi renale. Questo studio delinea il processo di sviluppo del modello murino UUO e di valutazione della fibrosi interstiziale, discute le sfide tecniche che contribuiscono all'imprevedibilità del modello e propone potenziali soluzioni. Queste intuizioni mirano a stabilire un approccio più standardizzato e universalmente applicabile per lo studio della fibrosi renale.
Introduzione
La malattia renale cronica (CKD) colpisce oltre il 10% della popolazione mondiale e la sua prevalenza è in aumento1. Varie condizioni del tratto urinario, tra cui anomalie anatomiche congenite, nefrolitiasi, iperplasia prostatica e tumori della vescica, possono portare a ostruzione ureterale². Di conseguenza, il modello murino di ostruzione ureterale unilaterale (UUO) è uno strumento chiave per identificare nuovi meccanismi di fibrosi interstiziale renale, comprendere la progressione della malattia e valutare potenziali strategie di trattamento. È stato ampiamente utilizzato per studiare l'origine dei miofibroblasti, dei sottocluster di (mio)fibroblasti, del metabolismo delle cellule tubulari e dell'arresto del ciclo cellulare, della transizione parziale epitelio-mesenchimale e di altri processi correlati 3,4,5,6,7,8.
Oltre alla fibrosi interstiziale renale indotta da UUO, altri modelli di fibrosi interstiziale renale comunemente usati nei roditori includono modelli indotti da tossine, come quelli che utilizzano acido aristolochico, acido folico e adenina, nonché modelli indotti chirurgicamente come la nefrectomia 5/6 e il danno da ischemia-riperfusione (IRI). Il modello UUO offre diversi vantaggi rispetto ai modelli alternativi di fibrosi renale. Ad esempio, la fibrosi renale indotta da tossine richiede un periodo di modellazione relativamente lungo (circa 1-2 mesi) e i suoi effetti collaterali tossici su altri organi possono complicare l'indagine sui meccanismi della fibrosi 9,10,11. I modelli indotti chirurgicamente, come la nefrectomia 5/6, possono portare a sanguinamento renale e infezione significativi, aumentando il rischio di mortalità post-operatoria. Inoltre, l'entità della fibrosi interstiziale indotta è direttamente correlata al volume del tessuto renale resecato, rendendo difficile riprodurre costantemente lo stesso grado di fibrosi in ciascun topo12.
Il modello IRI renale è un metodo primario per indurre danno renale acuto alla CKD e ha una significativa rilevanza clinica. La gravità della fibrosi può essere modulata regolando il tempo ischemico e la temperatura corporea; tuttavia, rispetto al modello UUO, è più complesso chirurgicamente e l'induzione della fibrosi interstiziale richiede una durata maggiore13. Rispetto a questi modelli, il modello UUO presenta diversi vantaggi, tra cui una breve durata della modellazione, variabilità minima, ripetibilità e una procedura chirurgica relativamente semplice. Il modello murino UUO, che non coinvolge tossine, viene creato legando un uretere, portando alla nefropatia ostruttiva entro due settimane. Ciò si traduce in idronefrosi, dilatazione tubulare e fibrosi interstiziale, molto simile al processo patologico osservato nell'uomo14. La gravità della fibrosi - lieve, moderata o grave - può essere controllata regolando la durata dell'esperimento.
Sebbene il modello murino UUO sia più semplice da eseguire rispetto ad altri modelli indotti da insulti per lo studio della CKD, diversi fattori possono influenzare significativamente la sua stabilità. Questi fattori includono il ceppo del topo, l'età, il sesso, il tipo di anestesia, la durata dell'intervento, la temperatura corporea durante l'intervento, le capacità chirurgiche dell'operatore e le condizioni di alimentazione e lo stato di salute dei topi15,16.
Ridurre al minimo lo stress chirurgico e le infezioni durante l'esecuzione della procedura in modo costante e organizzato in anestesia è essenziale per creare un modello murino UUO riproducibile. Inoltre, la ricerca sui meccanismi e sui potenziali bersagli terapeutici della CKD può essere compromessa da operatori inesperti, portando a un aumento della perdita di topi e a una maggiore eterogeneità del modello. Per affrontare queste sfide, vengono delineati gli aspetti tecnici chiave del processo chirurgico - prima, durante e dopo la procedura - evidenziando le questioni critiche che richiedono attenzione. Inoltre, la metodologia di valutazione per il modello murino UUO è dettagliata per fornire ai ricercatori un approccio coerente e affidabile.
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono condotte in conformità con le linee guida dell'agenzia e approvate dal Comitato Etico Istituzionale per gli Animali dell'Università di Medicina di Nanchino. Per eliminare le differenze di sesso e ceppo e garantire la comparabilità dei risultati, vengono utilizzati solo topi CD1 maschi di età compresa tra 8 e 10 settimane e con un peso di 22-25 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione degli animali e degli strumenti
- Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico.
- Pesare e anestetizzare i topi (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Collegare correttamente il dispositivo per anestesia per inalazione e posizionare i topi nella camera di induzione con isoflurano al 2% miscelato con ossigeno a 1-2 L/min. Quindi, posizionare il naso del topo nel cono nasale con una fornitura costante di anestesia. Confermare il livello appropriato di sedazione valutando la mancanza di risposta a un pizzicamento delle dita dei piedi.
NOTA: Controllare regolarmente la frequenza respiratoria e valutare il livello di anestesia utilizzando il riflesso del pedale dei topi. Regolare l'isoflurano in modo appropriato. - Posiziona il mouse su un pad termico elettronico in posizione supina con la testa e il collo estesi per mantenere aperte le vie aeree. Fissa le zampe con del nastro adesivo basso.
- Utilizzare un termometro per monitorare la temperatura ambiente e mantenerla a 37-38 °C. Inserire una sonda rettale e mantenere la temperatura corporea interna dei topi intorno ai 36,5-37 °C durante la procedura.
- Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la lesione da xerosi corneale.
- Radere i peli sulla zona chirurgica con una crema depilatoria e disinfettarli con la soluzione di betadine tre volte.
2. Procedura chirurgica
NOTA: Una volta che la temperatura corporea si stabilizza al set point e il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi è assente, avviare le seguenti procedure chirurgiche.
- Utilizzare una lama chirurgica per praticare un'incisione chirurgica verticale di circa 1-1,5 centimetri dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole per esporre la cavità addominale.
- Spostare l'intestino sul lato destro della cavità addominale utilizzando un batuffolo di cotone inumidito con soluzione fisiologica sterile per esporre il rene sinistro, situato sotto la parte posteriore della milza e adiacente alla colonna vertebrale.
- Usa una pinza per iride curva per eliminare il grasso e il tessuto connettivo che circonda l'uretere sinistro. Dopo un leggero isolamento, legare l'uretere sinistro vicino al polo inferiore del rene utilizzando una sutura intrecciata di seta 3/0. Eseguire una seconda legatura dell'uretere sinistro tra la prima legatura e la vescica.
NOTA: Per ridurre al minimo la variabilità tra i topi, assicurarsi che la posizione di legatura rimanga coerente in tutti i soggetti. Usa la pinza sinistra per posizionare la sutura nelle punte della pinza destra e fai scorrere la sutura sotto l'uretere17. Evitare di includere il grasso in eccesso e il tessuto connettivo nella legatura, poiché ciò potrebbe portare a un'ostruzione renale incompleta. Per ottenere questo risultato, accarezzare delicatamente l'uretere con tamponi di cotone asciutti. - Riposizionare con cura l'intestino nella cavità peritoneale. Sutura separatamente gli strati muscolari e cutanei utilizzando una sutura intrecciata in seta 3/0.
NOTA: La sutura della pelle e degli strati muscolari può causare la rottura della ferita da sutura e danni ai visceri addominali. - Quando si opera su più topi, pulire gli strumenti chirurgici con acqua corrente ed etanolo al 75% prima di procedere con il topo successivo.
3. Cure e monitoraggio post-chirurgico
- Iniettare 0,5 mL di soluzione fisiologica calda per via intraperitoneale per prevenire la disidratazione.
- Rimetti i topi in una gabbia pulita fino a quando non riprendono piena coscienza.
- Somministrare buprenorfina (50 μg/kg) per iniezione sottocutanea per 3 giorni. Monitora quotidianamente i topi per segni di mancanza di toelettatura, diminuzione dell'alimentazione e postura anormale.
4. Valutazioni post-operatorie
- Istologia
- Eutanasia dei topi con un sovradosaggio di isoflurano (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Raccogliere i reni ostruiti e controlaterali non ostruiti18 dopo l'eutanasia.
- Utilizzare l'area della sezione trasversale più grande della sezione renale per l'esame istologico.
- Fissare i tessuti renali in paraformaldeide al 4% e tagliare i campioni ottenuti in sezioni di 4 μm.
- Colorare le sezioni renali con acido periodico di Schiff (PAS), colorazione tricromica di Masson (MTS) o colorazione rosso Sirius per rilevare il danno tubulare renale e la fibrosi renale.
- Selezionare dieci campi casuali delle sezioni renali al microscopio ottico con un ingrandimento di 200×.
- Calcola la proporzione dell'area blu positiva al collagene utilizzando il software ImageJ.
- Western blot
- Estrarre circa 20 mg di tessuto renale dallo stesso polo dei reni UUO utilizzando il tampone18 del test di radioimmunoprecipitazione (RIPA).
- Quantificare la concentrazione proteica utilizzando un saggio dell'acido bicinchoninico19.
- Caricare quantità uguali di campioni proteici su gel di Bis-Tris al 4%-10% per l'elettroforesi e trasferirli su membrane di polivinilidene difluoruro (PVDF).
- Bloccare le membrane in PVDF con il 5% di latte in soluzione salina tamponata Tris (TBST) e incubarle con anticorpi primari per una notte a 4 °C.
- Lavare le membrane in PVDF con TBST e incubarle con anticorpi secondari a temperatura ambiente per 1 ora.
- Rileva i livelli di proteine utilizzando un metodo di chemiluminescenza potenziata (ECL) e analizzali utilizzando il software ImageJ, con gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come controllo del carico.
- Funzionalità renale
- Anestetizzare i topi con isoflurano inalato (vedere passaggio 1.2).
- Raccogliere campioni di sangue per via retro-orbitale dopo l'anestesia.
- Centrifugare campioni di sangue a 3.000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Misurare la creatinina sierica e l'azoto ureico nel sangue (BUN) utilizzando un analizzatore chimico automatico a secco per monitorare la funzionalità renale.
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Risultati
Istologia
La colorazione periodica con acido di Schiff (PAS) ha rivelato dilatazione tubulare, perdita dei bordi a spazzola, formazione di calchi e gonfiore epiteliale tubulare. La colorazione tricromica di Masson e il rosso Sirio hanno mostrato fibrosi interstiziale dopo UUO, in contrasto con i normali tubuli compatti con lumi distinguibili osservati nel gruppo sham. Il grado di fibrosi interstiziale renale, indicato dalle aree blu nella colorazione tricromica di Masson e dalle aree rosse nella color...
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Discussione
Viene fornita una procedura completa per stabilire il modello UUO, un approccio ampiamente utilizzato per studiare la fibrosi interstiziale renale. Inoltre, sono dimostrate l'identificazione e la valutazione del modello, comprese le valutazioni della funzionalità renale e delle alterazioni istologiche. Vengono discusse le variabili che contribuiscono all'eterogeneità del modello e i fattori tecnici modificabili.
La suscettibilità all'UUO varia significativamen...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Science Foundation of China (82370686/2024YFA1107704), dalla sovvenzione per il professore appositamente nominato di Jiangsu, dal progetto di innovazione scientifica e tecnologica di Nanchino, dal programma di coltivazione dei talenti di alto livello dell'ospedale della provincia di Jiangsu (Fase I) (CZ0121002010037), dalla Fondazione per le scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20240055) e dal Jiangsu Medical Innovation Team to JR; Progetto di miglioramento della capacità clinica dell'ospedale della provincia di Jiangsu (il primo ospedale affiliato alla Nanjing Medical University) (JSPH-MA-2023-4), sviluppo del programma accademico prioritario degli istituti di istruzione superiore del Jiangsu (Cina) e della National Natural Science Foundation of China (81970639/82151320) a HM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 mL siringa | Mingankang | / | |
| 4/0 sutura chirurgica | Jinhuan Medical | F401 | |
| 75% etanolo | Lircon | 6303060031 | |
| Pompa ad aria per anestesia | RWD Life Science | R510-29 | |
| Camere di induzione per anestesia | RWD Life Science | V102-V | |
| Tagliacapelli | per animali Jinke | / | |
| Soluzione di betadina | Lircon | 6303030036 | |
| Buprenorfina (analgesico) | RWD Life Science | / | |
| Pinze a iride curve | jinke | / | |
| Cuscinetto termico elettronico | Reptizoo | AHM23 | |
| pinze dritte fini | Jinke | / | |
| Filtro gas Canister | RWD Life Science | R510-31-6 | |
| Garze | Pads Winner Medical | 601-026576 | |
| Forbici per iride | Jinke | / | |
| Isoflurano (anestetico) | RWD Life Science | R510-22-10 | |
| Macchina per anestesia animale multi-uscita | RWD Life Science | R550IE | |
| Porta ago | jinke | / | |
| Unguento oftalmico | Dechra NDC | 17033-211-38 | |
| Batuffolo di cotone sterile | Winner Medical | 601-015213 | |
| Soluzione salina sterile | Shimen | H20066533 |
Riferimenti
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