Piattaforma di imaging ottico multimodale per lo studio del metabolismo cellulare

Jorge Villazon; Zhi Li; Aining Fan; Lingyan Shi

doi:10.3791/67906

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Articolo metodologico

Piattaforma di imaging ottico multimodale per lo studio del metabolismo cellulare

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DOI:

10.3791/67906

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6 giugno 2025

Jorge Villazon^*¹ , Zhi Li^*¹ , Aining Fan¹ , Lingyan Shi¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, ²Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, ³Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, ⁴Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, ⁵Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Utilizzando una piattaforma multimodale che combina modalità di imaging ottico label-free, abbiamo sviluppato un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle dinamiche cellulari e del metabolismo. Attraverso l'imaging tramite fluorescenza multifotone, generazione di seconda armonica e microscopia a scattering Raman stimolato, possiamo generare una panoramica olistica dell'ambiente cellulare e molecolare.

Abstract

Le tecnologie di imaging ottico sono fondamentali negli studi biomedici per la loro capacità di ottenere informazioni sia morfologiche che funzionali da campioni biologici ad alta risoluzione spaziale. Questi processi ottici sfruttano varie interazioni luce-molecola, come la diffusione, l'assorbimento, l'emissione e la generazione armonica, tra i fotoni e le molecole all'interno di cellule, tessuti o organi. Mentre l'imaging biomedico convenzionale si è storicamente concentrato sull'applicazione di un'unica modalità, ricerche recenti hanno dimostrato che queste diverse tecniche forniscono intuizioni complementari e i loro risultati combinati offrono una comprensione più completa dei cambiamenti molecolari nei processi di invecchiamento e nello sviluppo della malattia e dei fondamenti della biologia cellulare.

Negli ultimi decenni, i metodi di imaging ottico label-free sono avanzati, consentendo un'esplorazione dettagliata degli ambienti cellulari e subcellulari. Ad esempio, la fluorescenza multifotone (MPF) non solo facilita l'imaging mirato delle proteine, ma quantifica anche l'attività metabolica attraverso coenzimi autofluorescenti, raggiungendo un'elevata profondità di penetrazione e risoluzione spaziale. La generazione di seconda armonica (SHG) viene utilizzata per visualizzare strutture come il collagene nella matrice extracellulare, mentre lo scattering Raman stimolato (SRS) mappa i legami chimici e la composizione molecolare in situ con risoluzione subcellulare.

Abbiamo sviluppato una piattaforma di imaging multimodale che combina le modalità MPF, SHG e SRS. L'integrazione di queste modalità in un'unica piattaforma consente l'acquisizione di informazioni sfaccettate dalla stessa localizzazione all'interno di cellule, tessuti, organi o persino corpi, facilitando un'esplorazione più dettagliata delle intricate relazioni tra metabolismo cellulare, struttura della matrice extracellulare e composizione molecolare. Questo sistema multimodale offre risoluzione subcellulare, penetrazione profonda dei tessuti, imaging in situ di cellule vive/tessuti, nonché rilevamento senza marcatura e coregistrazione istantanea senza la necessità di regolazioni della posizione, commutazione del dispositivo o allineamento post-analisi. Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging label-free con questa piattaforma multimodale e dimostriamo la sua applicazione nella caratterizzazione del metabolismo cellulare e dell'eterogeneità molecolare in cellule e tessuti per lo studio dell'invecchiamento e delle malattie.

Introduzione

L'imaging biomedico ottico è stato fondamentale per far progredire la nostra comprensione della struttura e della funzione biologica. Le immagini sono generate modulando la luce di eccitazione e rilevando i segnali dalle interazioni luce-tessuto. Il primo microscopio composto, sviluppato da Hans e Zacharias Janssen intorno al 1590, utilizzava due lenti convesse in un tubo, fornendo un ingrandimento fino a 30x¹. I moderni microscopi ottici, dopo secoli di progressi, possono ora raggiungere risoluzioni fino a 1-3 nm ^2,3. Oltre a offrire un'alta risoluzion....