Articolo metodologico

Piattaforma di imaging ottico multimodale per lo studio del metabolismo cellulare

DOI:

10.3791/67906

⸱

6 giugno 2025

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Utilizzando una piattaforma multimodale che combina modalità di imaging ottico label-free, abbiamo sviluppato un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle dinamiche cellulari e del metabolismo. Attraverso l'imaging tramite fluorescenza multifotone, generazione di seconda armonica e microscopia a scattering Raman stimolato, possiamo generare una panoramica olistica dell'ambiente cellulare e molecolare.

Abstract

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Le tecnologie di imaging ottico sono fondamentali negli studi biomedici per la loro capacità di ottenere informazioni sia morfologiche che funzionali da campioni biologici ad alta risoluzione spaziale. Questi processi ottici sfruttano varie interazioni luce-molecola, come la diffusione, l'assorbimento, l'emissione e la generazione armonica, tra i fotoni e le molecole all'interno di cellule, tessuti o organi. Mentre l'imaging biomedico convenzionale si è storicamente concentrato sull'applicazione di un'unica modalità, ricerche recenti hanno dimostrato che queste diverse tecniche forniscono intuizioni complementari e i loro risultati combinati offrono una comprensione più completa dei cambiamenti molecolari nei processi di invecchiamento e nello sviluppo della malattia e dei fondamenti della biologia cellulare.

Negli ultimi decenni, i metodi di imaging ottico label-free sono avanzati, consentendo un'esplorazione dettagliata degli ambienti cellulari e subcellulari. Ad esempio, la fluorescenza multifotone (MPF) non solo facilita l'imaging mirato delle proteine, ma quantifica anche l'attività metabolica attraverso coenzimi autofluorescenti, raggiungendo un'elevata profondità di penetrazione e risoluzione spaziale. La generazione di seconda armonica (SHG) viene utilizzata per visualizzare strutture come il collagene nella matrice extracellulare, mentre lo scattering Raman stimolato (SRS) mappa i legami chimici e la composizione molecolare in situ con risoluzione subcellulare.

Abbiamo sviluppato una piattaforma di imaging multimodale che combina le modalità MPF, SHG e SRS. L'integrazione di queste modalità in un'unica piattaforma consente l'acquisizione di informazioni sfaccettate dalla stessa localizzazione all'interno di cellule, tessuti, organi o persino corpi, facilitando un'esplorazione più dettagliata delle intricate relazioni tra metabolismo cellulare, struttura della matrice extracellulare e composizione molecolare. Questo sistema multimodale offre risoluzione subcellulare, penetrazione profonda dei tessuti, imaging in situ di cellule vive/tessuti, nonché rilevamento senza marcatura e coregistrazione istantanea senza la necessità di regolazioni della posizione, commutazione del dispositivo o allineamento post-analisi. Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging label-free con questa piattaforma multimodale e dimostriamo la sua applicazione nella caratterizzazione del metabolismo cellulare e dell'eterogeneità molecolare in cellule e tessuti per lo studio dell'invecchiamento e delle malattie.

Introduzione

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L'imaging biomedico ottico è stato fondamentale per far progredire la nostra comprensione della struttura e della funzione biologica. Le immagini sono generate modulando la luce di eccitazione e rilevando i segnali dalle interazioni luce-tessuto. Il primo microscopio composto, sviluppato da Hans e Zacharias Janssen intorno al 1590, utilizzava due lenti convesse in un tubo, fornendo un ingrandimento fino a 30x1. I moderni microscopi ottici, dopo secoli di progressi, possono ora raggiungere risoluzioni fino a 1-3 nm 2,3. Oltre a offrire un'alta risoluzione, i sistemi di imaging avanzati offrono ora una penetrazione più profonda nei tessuti, una maggiore efficienza e danni minimi al campione, rendendoli particolarmente adatti per l'imaging di cellule vive e tessuti. L'imaging label-free è particolarmente vantaggioso in quanto acquisisce le informazioni senza interrompere i processi intracellulari o compromettere l'integrità del campione.

La microscopia a fluorescenza multifotone (MPF), in particolare la microscopia a fluorescenza a due fotoni, è stata ampiamente utilizzata per l'imaging label-free. A differenza della microscopia a fluorescenza convenzionale, che si basa sull'assorbimento e l'emissione lineare di un singolo fotone, l'eccitazione MPF comporta l'assorbimento simultaneo di più fotoni, la cui energia combinata eccita una singola molecola di fluoroforo 4,5. Questi fotoni, tipicamente nello spettro infrarosso, possiedono la metà o meno dell'energia richiesta per l'eccitazione di un singolo fotone. Le lunghezze d'onda più lunghe e l'eccitazione localizzata nel punto focale di questo processo non lineare si traducono in una minore diffusione, una penetrazione più profonda nei tessuti e una ridotta fototossicità.

Le informazioni metaboliche cellulari possono essere acquisite mediante microscopia MPF label-free attraverso il rilevamento di segnali di autofluorescenza da substrati metabolici endogeni, come la riduzione della nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) e la flavina adenina dinucleotide (FAD). Questi coenzimi mostrano spettri di eccitazione ed emissione distinti e il loro rapporto di intensità della fluorescenza, noto come rapporto redox (NADH/FAD), riflette lo stato ossidativo della cellula. Da quando Britton Chance ha introdotto per la prima volta il concetto di rapporto redox nel 1979, sono stati proposti rapporti aggiuntivi, tra cui NAD(P)H/FAD, NAD(P)H/(FAD + NAD(P)H) e FAD/(FAD + NAD(P)H), 6,7,8,9. La quantificazione di questi rapporti ottici redox tramite l'imaging MPF fornisce preziose informazioni sulle dinamiche metaboliche. Ad esempio, l'imaging MPF può distinguere le cellule tumorali dalle cellule normali in base al loro metabolismo alterato, dimostrando il suo potenziale per la diagnosi del cancro 10,11,12. Tuttavia, il rilevamento dell'autofluorescenza basato su MPF presenta dei limiti. Altri fluorofori intrinseci, come la cheratina, possono contribuire all'intensità della fluorescenza, portando a diafonia spettrale e interpretazione imprecisa del segnale13. Inoltre, il rapporto redox riflette solo i cambiamenti complessivi di ossidoriduzione cellulare e non distingue tra NADH proveniente da fonti diverse (ad esempio, citoplasmatico o mitocondriale) o tra NADH e NAD(P)H, poiché entrambi mostrano picchi spettrali simili a 450 nm, risultando in segnali di intensità miscelati14.

La Second Harmonic Generation (SHG), un processo ottico non lineare dimostrato per la prima volta in campo biomedico negli anni '80, è stato ampiamente utilizzato per l'imaging label-free di strutture cellulari15,16. Simile all'MPF, l'SHG comporta l'assorbimento simultaneo di due fotoni della stessa energia da un laser pulsato ultraveloce. Questi fotoni vengono ricombinati per emettere un nuovo fotone a una frequenza doppia rispetto alla luce incidente, con conseguente rilevamento del segnale della seconda armonica. Questa interazione ottica non lineare si verifica esclusivamente in materiali non centrosimmetrici che mostrano una suscettibilità del secondo ordine diversa da zero per indurre una polarizzazione per generare il segnale della seconda armonica17,18. Ciò rende l'SHG particolarmente efficace per l'imaging delle proteine filamentose e delle strutture fibrillari, come il collagene, la miosina e la tubulina, senza richiedere coloranti a fluorescenza esogena 15,17,19,20. L'anomalia nell'abbondanza, nella rigidità, nell'allineamento e nella struttura della fibrosi e del collagene sono prevalenti in molte condizioni come l'infiammazione e il cancro, rendendo l'SHG uno strumento promettente per il rilevamento efficiente e non invasivo di alcune condizioni patologiche 21,22,23. L'ampia applicazione dell'imaging SHG nella ricerca oncologica, compresi gli studi sui tumori al seno, alle ovaie e alla pelle, ha evidenziato il suo ruolo cruciale sia nella ricerca di base che nelle potenziali applicazioni cliniche 24,25,26,27.

Diverse molecole esibiscono livelli distinti di energia vibrazionale, che inducono vari gradi di dispersione anelastica quando eccitati dalla luce incidente, un fenomeno caratterizzato per la prima volta da C. V. Raman nel 192828. Da allora l'effetto Raman è stato ampiamente utilizzato nella microscopia ottica per la rilevazione di composizioni molecolari e tissutali senza marcatura esogena. Sia lo Stimulated Raman Scattering (SRS) che il coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) eccitano le vibrazioni molecolari in modo coerente e sfruttano l'interazione non lineare della luce per produrre un segnale più forte rispetto alla convenzionale spettroscopia Raman spontanea. Il fenomeno SRS è stato segnalato per la prima volta nel 196229. Nel 2008, questo meccanismo è stato integrato nell'imaging multifotone tridimensionale, consentendo il rilevamento selettivo di sostanze chimiche in base alle variazioni di intensità nei fasci di Pump e Stokes dovute alle transizioni vibrazionali molecolari30. Questo metodo riduce al minimo l'interferenza di fondo non risonante, generando un segnale di intensità pulita che supera quello delle CARS. L'imaging SRS eccelle nel fornire immagini multiplex e iperspettrali, consentendo il rilevamento simultaneo di più legami chimici e consentendo la visualizzazione ad alta risoluzione della composizione molecolare in campioni con una notevole profondità di penetrazione. Sebbene sia una tecnica relativamente nuova, l'imaging SRS si è dimostrato efficace sia nella diagnostica clinica che nella ricerca metabolica, in vivo e in vitro 30,31,32,33,34,35,36. Ad esempio, la SRS può differenziare i tessuti infiltrati nel tumore cerebrale dalla corteccia e dalla sostanza bianca quantificando il rapporto lipidi/proteine, consentendo la delineazione dei margini tumorali in modo non invasivo e senza marcature37,38. Inoltre, le alterazioni metaboliche, spesso considerate segni distintivi di malattie legate all'invecchiamento e associate al cancro, possono essere valutate quantitativamente utilizzando la SRS ottenuta rilevando i legami carbonio-deuterio in campioni trattati con acqua pesante (D2O), consentendo la misurazione quantitativa della sintesi proteica, della lipogenesi e di altri processi metabolici macromolecolari 31,33,34,35,36. La capacità di tracciare i metaboliti con un'elevata risoluzione temporale e spaziale posiziona la SRS come uno strumento promettente per l'indagine e la diagnosi delle malattie, con un potenziale per applicazioni cliniche più ampie.

L'imaging multimodale è emerso come un approccio potente nella ricerca biomedica, integrando due o più modalità di imaging per ottenere una comprensione più completa di sistemi biologici complessi all'interno dello stesso campione. Nel 2018 è stata introdotta una tecnica di microscopia multiarmonica autofluorescenza senza marcatura (SLAM), che integra la fluorescenza a due fotoni (2PF), la fluorescenza a tre fotoni (3PF), l'SHG e la terza generazione armonica (THG)39. Questo approccio facilita la visualizzazione simultanea delle interazioni cellulari, dei processi dinamici e dei singoli componenti all'interno del microambiente tumorale. La microscopia SLAM offre una perturbazione minima e requisiti di potenza laser ridotti per il campione, consentendo la profilazione profonda dei tessuti e fornendo un metodo più sicuro per il monitoraggio intravitale40. Un'altra modalità multimodale, che combina la spettroscopia di fluorescenza intrinseca, la spettroscopia di riflettanza diffusa e la spettroscopia Raman, è stata sviluppata per il rilevamento del cancro in situ durante le procedure chirurgiche41. Inoltre, un sistema di endoscopia non lineare multimodale di recente progettazione, che integra CARS, SHG e fluorescenza a due fotoni (TPF), ha dimostrato la capacità di visualizzare campioni biologici con risoluzione spaziale sub-micronica e sub-cellulare42. La microscopia combinata 2PF e SRS è stata utilizzata in modo simile per l'imaging in vivo ad alta risoluzione di tessuti, cellule e organelli 42,43,44,45. Queste tecniche di imaging multimodale emergenti sfruttano i punti di forza delle singole modalità, portando a una migliore risoluzione, profondità di penetrazione ed efficienza di acquisizione delle immagini, mostrando così un notevole potenziale per applicazioni cliniche e chirurgiche.

Questo approccio multimodale è sempre più favorito rispetto all'imaging monomodale perché fornisce una gamma più ampia di misurazioni mitigando al contempo le limitazioni associate alle singole tecniche. Come discusso in precedenza, l'MPF misura la fluorescenza endogena per riflettere i cambiamenti metabolici, l'SHG può visualizzare strutture non centrosimmetriche come il collagene in campioni biologici e l'SRS rileva prevalentemente proteine e lipidi a causa dell'alta densità di legami chimici che generano segnali Raman distintivi in base alle loro modalità vibrazionali. Date le loro proprietà coerenti e il principio condiviso delle proprietà ottiche non lineari, queste modalità di imaging possono essere integrate in un'unica configurazione di microscopio utilizzando laser pulsati ultracorti, consentendo l'acquisizione di vari biomarcatori in regioni localizzate per fornire una visione più completa dei processi biologici44,45. Questo documento delinea un protocollo per l'implementazione di una piattaforma di imaging multimodale che integra MPF, SHG e SRS per applicazioni di ricerca biomedica.

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Protocollo

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1. Esperimenti di imaging multimodale label-free

NOTA: Questo protocollo si concentra sulla procedura di configurazione e acquisizione dell'imaging multimodale label-free.

  1. Configurazione del microscopio multimodale (Figura 1A) e calibrazione del sistema
    1. Riscalda il laser e attendi circa 15-20 minuti.
    2. Accendere le unità di controllo e i monitor nella seguente sequenza: Scatola di controllo | Controller con pannello a sfioramento | Adattatore CA per il telecomando laser principale Adattatore CA per il telecomando laser secondario.
    3. Accendere il rilevatore di fotodiodi Si e l'amplificatore di blocco.
    4. Configurare i raggi laser della pompa e il raggio Stokes. Configura il sistema laser con un raggio di pompa sintonizzabile da 780 nm a 990 nm, un'ampiezza dell'impulso di 5 - 6 ps e una frequenza di ripetizione di 80 MHz. Il raggio laser Stokes ha una lunghezza d'onda fissa di 1.031 nm con un impulso di 6 ps e una frequenza di ripetizione di 80 MHz . Assicurarsi che sia la pompa che i raggi Stokes siano a bassa potenza (almeno 20 mW) per essere visibili sulla piastra di allineamento.
    5. Posizionare una piastra di allineamento nel percorso ottico (subito dopo la scatola laser) per verificare la sovrapposizione spaziale delle pompe e dei raggi di Stokes e regolare lo specchio fino a quando entrambi i punti non si sovrappongono al centro della piastra di allineamento.
      NOTA: Sebbene le pompe e i raggi di Stokes siano approssimativamente sovrapposti, la regolazione fine della sovrapposizione spaziale di due raggi laser può ottenere il segnale SRS ottimale.
    6. Dopo la sovrapposizione spaziale, sintonizzarsi con il PSD (Position Sensitive Detector) facendo prima clic sul software di controllo OPO . Utilizzare il tasto esagonale per regolare con attenzione lo specchio ottico 1 (OM1) e osservare il display PSD per il cambio di posizione XY per mirare alla deviazione minima dal centro. Quindi, per effettuare regolazioni più precise, utilizzare il tasto esagonale sullo specchio ottico 2 (OM2) fino a quando l'indicatore di posizione non è centrato sul display PSD.
      NOTA: OM1 e OM2 sono due specchi nella testa OPO per regolare l'allineamento del laser.
    7. Infine, centrare il condensatore ruotando le due viti di centraggio del condensatore per spostare l'immagine del diaframma a iride al centro del campo visivo.
      NOTA: Il diaframma dell'iride di campo può limitare il diametro del raggio di luce che entra nell'obiettivo e quindi escludere la luce estranea, migliorando il contrasto dell'immagine.
  2. Fasi di acquisizione dell'imaging multimodale senza marcatura
    1. Applicare l'olio sul condensatore d'olio ad alta apertura numerica (1,4 NA) e montare il vetrino del microscopio sul condensatore oliato. Infine, posizionare una grossa goccia d'acqua sul vetrino del microscopio per l'obiettivo ad acqua 25x. Assicurarsi che il microscopio sia montato in modo sicuro e inamovibile, quindi regolare il tavolino z per regolare la messa a fuoco fino a quando l'immagine in campo chiaro del campione biologico può essere vista sotto l'obiettivo dell'acqua 25x.
    2. Inizia il processo di imaging nella sequenza corretta: MPF, SHG e SRS per evitare il fotosbiancamento, che influirà sulla qualità dell'immagine e sull'analisi precisa dell'MPF. Per passare rapidamente da MPF a SHG, passare dal raggio della pompa al raggio fisso di Stokes.
      NOTA: La regolazione del laser della pompa da 800 nm (autofluorescenza NADH e FAD) a 791,3 nm (spostamento CH3 Raman) può richiedere 1-2 minuti.
    3. Seleziona la risoluzione dell'immagine (512 x 512 pixel) e il tempo di permanenza adatto per ciascuna modalità. Utilizzare 8 μs/pixel per MPF e SHG con fotogrammi medi superiori a 3. Utilizzare 40 μs/pixel con fotogramma medio 2 per la modalità SRS.
      NOTA: Il fotogramma medio indica il numero di immagini di cui fare la media prima del salvataggio.
    4. Per acquisire l'autofluorescenza con MPF, spegnere il raggio laser di Stokes e regolare il laser della pompa a 800 nm per eccitare NADH e flavina. Installare il cubo filtrante FVOPT nel percorso della luce con 460 ± 10 nm e 515 ± 10 nm rispettivamente per il NADH e la flavina. La potenza del campione è quindi di circa 15 mW.
    5. Acquisisci il segnale della fibra di collagene usando SHG. Spegnere il raggio laser della pompa, utilizzare solo il raggio laser Stokes e impostare la potenza su 500 mW. Acquisire solo il canale relativo al filtro a 515 nm.
    6. Ottenere la distribuzione spaziale di proteine e lipidi utilizzando SRS. Mantieni accesi entrambi i raggi laser e regola la frequenza del raggio laser in modo che corrisponda alla modalità vibrazionale specifica per ciascuna molecola.
      NOTA: Tipicamente, 791,3 nm viene utilizzato per CH3, 797 nm viene utilizzato per CH2, 787 nm è per i lipidi insaturi e 794,6 è per i lipidi saturi. La potenza del campione è quindi di circa 40 mW.
    7. Per acquisire i set di dati dell'immagine iperspettrale SRS, aprire il software di controllo OPO per selezionare lo sweep, impostare l'intervallo di lunghezze d'onda da 780 nm a 806,5 nm e scegliere un numero di stack di almeno 60. Quindi, acquisisci lo stack di immagini iperspettrali.
      NOTA: Il set di dati risultante contiene 60 immagini, ognuna delle quali rappresenta la distribuzione spaziale a uno specifico spostamento Raman (da 2.700 cm-1 a 3.150 cm-1). Il tempo per l'acquisizione iperspettrale dipende dal campo visivo (FOV) dell'immagine e dal tempo di scansione, ma sarà approssimativamente compreso tra 5 minuti e 8 minuti per un'immagine 512 x 512. Per immagini più grandi, è necessario prestare attenzione a ridurre al minimo la durata sotto il laser per evitare fotodanni, che possono verificarsi dopo 2 ore (a seconda dello spessore del campione e delle dimensioni del FOV).
    8. Salva tutte le immagini delle stesse aree di interesse (ROI) nella stessa cartella. Il formato dell'immagine è il file .oir Olympus.

2. Analisi delle immagini

  1. Utilizzare il software di elaborazione delle immagini per aprire tutte le immagini raw salvate per assegnare il colore e aggiungere la barra della scala per la visualizzazione dell'immagine. Usalo anche per generare la maschera binaria di NADH e immagini degli acidi grassi di saturazione (SFA, 2.880 cm-1) per l'analisi del rapporto redox ottico e dell'insaturazione lipidica.
    NOTA: Assicurati che l'intensità della maschera abbia solo 0 e 1.
  2. Usa lo script python costruito in casa per eseguire qualsiasi analisi a valle (il codice è disponibile all'indirizzo https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    NOTA: questo script è progettato per elaborare più regioni di interesse (ROI) sia da campioni di controllo che da campioni di cancro. La funzione principale dello script richiede solo due input: i percorsi dei file per le cartelle di controllo e le cartelle delle immagini del cancro.
    1. Scorri le cartelle, abbinando le immagini con lo stesso nome di base (ad esempio, "roi_1_flavin.tif", "roi_1_nadh.tif", "roi1_mask.tif").
    2. Per ogni set di immagini corrispondenti, lasciare che lo script esegua l'analisi raziometrica e generi nuove immagini raziometriche in base a questi calcoli.
      Il rapporto redox ottico è calcolato come flavina / (NADH + flavina).
      L'insaturazione lipidica è calcolata come: USFA / (SFA + USFA) dove gli USFA rappresentano acidi grassi insaturi.
    3. Tutti i valori raziometrici delle immagini vengono quindi memorizzati in un DataFrame pandas per una facile manipolazione. Esegui l'ANOVA unidirezionale e usa matplotlib con styple "ggplot" o seaborn per eseguire il barplot o il boxplot per la quantificazione.
    4. Utilizzare le immagini da 2.930 cm-1 (CH3) e 2.850 cm-1 (CH2) per generare un'immagine sottratta (CH3 - CH2). Quindi, fondere l'immagine CH2 CH3 - CH2 nello spazio colore RGB con una LUT personalizzata che imita la colorazione H&E per generare l'immagine istologia digitale46.
  3. Dopo l'acquisizione di immagini SRS iperspettrali, utilizzare lo script python costruito in casa per eseguire il clustering k-means per segmentare le immagini in base alle somiglianze spettrali (il codice è disponibile all'indirizzo https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    1. Carica le pile di immagini .tiff con il pacchetto tifffile. Rimodellare lo stack di immagini iperspettrali SRS (x, y, spettri) in un array 2D (pixel, spettri).
    2. Utilizzare il pacchetto scikit-learn per distribuire l'algoritmo k-means in questa matrice 2D, con il numero definito di cluster.
    3. Rimodella le etichette del cluster risultanti riportandole alle dimensioni originali dell'immagine, creando una mappa di segmentazione.
    4. Assegna colori univoci a ciascun cluster, generando un'immagine in falsi colori che rappresenta diverse composizioni biochimiche all'interno del tessuto.
    5. Usa matplotlib per tracciare gli spettri di ogni cluster con il valore medio (linea continua) e la deviazione standard (area d'ombra)
    6. Seguire il protocollo del protocollo PRM-SRS (Penalized Reference Matching SRS) utilizzando MATLAB per creare il rilevamento spaziale del sottotipo lipidico senza etichetta con set di dati di immagini iperspettrali SRS47.
    7. Organizza le immagini e salvale in un formato .tif a 300 dpi.

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Risultati

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Le immagini in Figura 2 sono rappresentative dei risultati ottenuti seguendo il protocollo per l'acquisizione dell'autofluorescenza di FAD e NADH, nonché dei quattro canali SRS per proteine, lipidi totali, lipidi insaturi e lipidi saturi. Qui generiamo anche un'immagine pseudo-istologica come descritto nel protocollo attraverso la fusione dei colori RGB. L'acquisizione dei canali MPF e SRS fornisce i file di immagine che verranno successivamente utilizzati nell'analisi raziometrica. Un esemp...

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Discussione

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Questo sistema multimodale è una potente piattaforma di imaging per l'acquisizione di una visualizzazione olistica dell'ambiente molecolare dei campioni in un'ampia gamma di origini biologiche e condizioni patologiche. Il vantaggio di sfruttare diverse modalità label-free risiede nella capacità di acquisire informazioni complementari e indirizzare analiti specifici che altrimenti potrebbero essere difficili o impossibili in un'unica tecnica di imaging label-free. In particolare, le tre t...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo la dottoressa Gloria Pryhuber e i membri del suo team HuBMAP per aver fornito fette di tessuto polmonare umano. Ringraziamo il Dr. Kun Zhang per aver fornito tessuti cerebrali umani. Ringraziamo anche il Dr. Gen-Sheng Feng per aver fornito campioni di fegato di topo. Ringraziamo il supporto di NIHU54DK134301, NIH R01GM149976, NIH U01AI167892, NIH R01HL170107, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIH U54CA132378, UCSD Startup funds, Sloan Research Fellow Award e CZI DAF2023-328667 Award.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cubo filtro 460 nmOlympusOCT-ET 460/50M32
Filtro passa-bandaKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm TerminatorMini CircuitsSTRM-50
Alimentatore CCTopWard6302D
Supporto dicroicoThorlabsKM100CL
FIJI ImageJImageJ
Condensatore dell'olio ad alto NAOlympus6-U130
Thorlabs950 nm
Microscopio a scansione laser invertitoAmplificatore OlympusFV1200MPE
Lock-in ZurichInstruments
Sistema laser picoEmeraldFisica applicata e Elettronica, Inc.  Fascio pompa pulsato sincronizzato (sintonizzabile 720– 990&sp; lunghezza d'onda nm, 5– 6&sottilesp; Larghezza dell'impulso PS e 80  MHz frequenza di ripetizione) e Stokes (lunghezza d'onda a 1032  nm, 6&sottilesp; Larghezza dell'impulso PS e 80  MHz frequenza di ripetizione)
SI Fotodiodo DetectorHome Built
Touch Panel ControllerOlympus
VF-300 Compresstome Precisione
Filtro passa-corto ad alto diametro esterno

Riferimenti

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