Questo protocollo descrive come utilizzare il sistema omico di coltura a singola cellula microlitri-goccioline (cellula MISS) per eseguire l'isolamento, la coltivazione e il prelievo monoclonale microbico. La cella MISS raggiunge un flusso di lavoro integrato basato sulla tecnologia microfluidica delle gocce, che offre un'eccellente monodispersione delle gocce, un'elevata coltivazione parallela e un rilevamento della biomassa ad alto rendimento.
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Articolo metodologico
Coltivazione e prelievo monoclonale microbico automatizzato e ad alto rendimento con il sistema omico di coltura a microlitri di goccioline a cellula singola
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le colture batteriche pure sono essenziali per lo studio della cultura microbica. I metodi tradizionali basati su piastre solide, piastre a pozzetti e microreattori sono ostacolati da procedure macchinose e bassa produttività, che impediscono il rapido progresso della ricerca sulla culturromica microbica. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato con successo il sistema omico di coltura a microlitro di gocce di singola cellula (MISS cell), una piattaforma automatizzata ad alto rendimento che utilizza la tecnologia microfluidica delle goccioline per l'isolamento, la coltivazione e lo screening monoclonale microbico. Questo sistema è in grado di generare un gran numero di goccioline di singola cellula e di coltivare, vagliare e raccogliere colonie monoclonali in breve tempo, facilitando un processo integrato dall'isolamento microbico al prelievo. In questo protocollo, ne abbiamo dimostrato l'applicazione utilizzando come esempio l'isolamento e la coltivazione del microbiota intestinale umano e abbiamo confrontato l'efficienza dell'isolamento microbico, le prestazioni della coltura monoclonale e la produttività dello screening utilizzando il metodo di coltura su piastra solida. Il flusso di lavoro sperimentale era semplice e il consumo di reagenti era molto basso. Rispetto ai metodi di coltura su piastra solida, la cellula MISS potrebbe coltivare una maggiore diversità di specie di microbiota intestinale, offrendo un potenziale e un valore significativi per la ricerca culturomica microbica.
Introduzione
La culturromica microbica ha ampie applicazioni nella ricerca di microbi benefici nell'industria alimentare, nella diversità dei microbi ambientali, nello screening di nuovi composti antimicrobici e nel microbioma umano in relazione alla malattia 1,2,3,4. I metodi tradizionali, basati principalmente su piastre solide, piastre a pozzetti o microreattori per ottenere e prelevare colonie monoclonali, sono facili da utilizzare ma soffrono di una bassa produttività a causa delle loro molteplici fasi. Questa limitazione ostacola applicazioni come lo screening della mutagenesi microbica, gli studi di cultoromica microbica e la selezione di colonie ad alta produzione, che richiedono un ampio screening monoclonale.
Recentemente, sono stati progettati vari dispositivi di rilevamento e dispensazione a singola cellula per migliorare significativamente la velocità di elaborazione dei campioni microbici, riducendo al contempo la manodopera e minimizzando gli errori dovuti alla manipolazione manuale5. Tuttavia, questi strumenti in genere affrontano solo passaggi specifici all'interno dei metodi tradizionali, spesso richiedendo un'ampia integrazione delle apparecchiature, occupando uno spazio significativo e incorrendo in costi elevati. Pertanto, c'era l'urgente necessità di sviluppare una piattaforma di coltura e screening microbico a basso costo e universalmente applicabile per compensare le carenze sopra menzionate.
Nel nostro lavoro precedente, abbiamo sviluppato con successo una piattaforma di screening automatizzata ad alto rendimento, nota come Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell, di seguito denominata "sistema omico")6. Questa piattaforma utilizza la tecnologia microfluidica a goccioline, che promette di ottenere l'automazione e l'integrazione nell'isolamento, nella coltivazione e nel prelievo microbico 7,8,9,10. Il sistema Omics comprende diversi moduli chiave, tra cui un modulo di campionamento, un chip microfluidico, un sistema di rilevamento e raccolta delle gocce, che consente un efficiente isolamento, coltivazione, screening monoclonale e raccolta di singole cellule nella ricerca microbiologica. Abbiamo già utilizzato il sistema Omics per ottenere uno screening di mutagenesi ad alto rendimento di Corynebacterium glutamicum6.
Grazie all'automazione e alle capacità di screening ad alto rendimento del sistema Omics, si prevede che l'applicazione alla culturologia microbica consenta di ottenere rapidamente una grande quantità di dati microbici. In questo protocollo, abbiamo introdotto la procedura operativa dettagliata della cellula MISS, con l'isolamento e la coltivazione del microbiota intestinale umano come esempio per dimostrare il processo di isolamento, coltivazione, rilevamento monoclonale e screening microbico di singole cellule. Il funzionamento del sistema Omics è semplice e i ricercatori devono solo seguire le indicazioni del software per l'installazione sequenziale di microtubi e chip microfluidici per la generazione di goccioline, le impostazioni dei parametri e la preparazione del campione.
Nell'interfaccia operativa del software, il sistema Omics è suddiviso in tre funzioni principali: isolamento, coltivazione e screening. I ricercatori possono selezionare diverse fasi in base all'esperimento. Inoltre, durante la fase di screening delle goccioline, i ricercatori possono scegliere tra due modalità di rilevamento: segnale fluorescente o densità ottica. Il software fornisce una visualizzazione in tempo reale del processo di screening delle goccioline. Infine, i ricercatori hanno la flessibilità di configurare parametri come le condizioni di coltura, la lunghezza d'onda rilevata e il numero di pozzetti di raccolta in base alle loro specifiche esigenze sperimentali, e possono mettere in pausa lo strumento in qualsiasi momento per eseguire altre operazioni. La cella MISS è una piattaforma di screening monoclonale ad alto rendimento e rispettosa dei microbi, con un funzionamento semplice e un consumo minimo di reagenti.
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Protocollo
Tutte le procedure di studio sono conformi a tutte le norme etiche pertinenti. Le procedure sono state approvate dal Comitato Etico per la Scienza e la Tecnologia dell'Università Tsinghua. Per lo studio del microbiota intestinale umano, sono stati raccolti campioni di feci da un adulto sano senza condizioni mediche significative, che ha dato il consenso informato scritto.
1. Installazione dello strumento
- Collocare lo strumento del sistema Omics in un ambiente pulito o sterile (come una camera sterile o un banco anaerobico). Lo strumento è un dispositivo di precisione e, quando lo si posiziona nella struttura, considerare quanto segue:
- Mantenere lo strumento a pressione e temperatura normali.
- Tenere lo strumento lontano da forti campi elettrici, campi magnetici e fonti di radiazioni termiche.
- Assicurarsi che l'area di posizionamento dello strumento superi le dimensioni di 2.500 mm (P) x 1.500 mm (L) x 2.000 mm (A).
- Mantenere l'umidità ambientale dello strumento al di sotto del 60%.
2. Preparativi
- Accendere in sequenza il sistema Omics, il computer e il software operativo del sistema Omics.
- Installazione di microtubi per celle MISS e chip microfluidici per la generazione di goccioline:
- Aprire lo sportello della camera di generazione e coltivazione delle goccioline (Figura 1A) e rimuovere verticalmente il coperchio protettivo per il microtubo e il chip microfluidico per la generazione di goccioline. Utilizzare una siringa monouso per aggiungere 10 ml di acqua distillata sterile all'umidificatore all'interno della camera di coltivazione delle goccioline (Figura 1C) e reinstallare il coperchio protettivo per il microtubo e il chip microfluidico per la generazione di goccioline.
- Aprire la confezione sterile del microtubo e del chip microfluidico per la generazione di goccioline e posizionarlo verticalmente direttamente sopra la camera di coltivazione (Figura 1C).
- Nell'interfaccia del software, fare clic su Installazione (Figura 2A). A questo punto, viene visualizzata una finestra pop-up con il prompt Confermare la sostituzione del micro-tubo e del chip microfluidico per la generazione di goccioline? Fare clic su Sì per avviare l'installazione.
- Estrarre il dispositivo di rimozione delle bolle d'aria e fissarlo a testa in giù sul posizionamento del dispositivo di rimozione delle bolle d'aria nella camera di generazione e coltivazione delle goccioline. Fare attenzione a non premere i tubi di ingresso e uscita delle gocce del dispositivo di rimozione delle bolle d'aria (Figura 1E).
- Collegare il tubo di uscita delle goccioline del dispositivo di rimozione delle bolle d'aria al clampvalvola sottostante e lasciarlo passare attraverso il foro, che è diretto alla camera di rilevamento e raccolta delle gocce (Figura 1B).
- Aprire lo sportello della camera di rilevamento e raccolta delle gocce, inserire verticalmente il tubo di rilevamento, già collegato al tubo di uscita delle gocce, nella presa di rilevamento e assicurarsi che il tubo di rilevamento sia completamente inserito (Figura 1D).
NOTA: Quando si inserisce il tubo di rilevamento, inserirlo verticalmente senza alcuna piegatura sul tubo. - Serrare la vite che fissa il tubo di rilevamento in senso orario. Dopo aver verificato che la provetta di rilevamento sia completamente inserita e fissata, chiudere lo sportello della camera di rilevamento e raccolta delle goccioline.
- Dal micro-tubo e dal chip microfluidico per la generazione di goccioline, ci sono 10 tubi in silicone, ciascuno etichettato con un numero (L01-L10). Collegare ciascun tubo etichettato al corrispondente numerato clamp valvola (01-10) (Figura 1C).
- Collegare il connettore rapido dal micro-tubo e dal chip microfluidico per la generazione di goccioline alla porta corrispondente sul sistema Omics: da C1 a O1, da C2 a O2, da C4 a O4 e da CF a OF.
NOTA: L'installazione del chip microfluidico per la generazione di microtubi e goccioline è completa. Non è necessario collegare C3 a O3. - Dopo aver completato l'installazione del chip microfluidico per la generazione di microtubi e goccioline, viene visualizzata una finestra pop-up che richiede l'apertura della valvola di bloccaggio del tubo a gocce. Fare clic su OK quando l'installazione del chip microfluidico per la generazione di microtubi e goccioline è completata. Dopo essersi assicurati che tutti i tubi in silicone del microtubo e il chip microfluidico per la generazione di goccioline siano collegati alla valvola a morsetto corrispondente, fare clic su OK.
- Inizializzazione dello strumento
- Prima di eseguire l'inizializzazione, fare clic sull'interfaccia Impostazioni (Figura 2B) per configurare i parametri pertinenti: modalità di rilevamento (rilevamento basato su OD o fluorescenza; OD qui), temperatura di incubazione (37 °C) e tempo (30 giorni = 720 h), velocità dell'agitatore (20 giri/min), lunghezza d'onda di rivelazione OD (600 nm) e lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione della rivelazione di fluorescenza.
NOTA: I parametri utilizzati per l'isolamento e la coltivazione del microbiota intestinale umano in questo protocollo sono riportati tra parentesi. Quando si impostano i parametri, la temperatura di coltivazione deve essere compresa tra 5 °C e 50 °C. Quando si seleziona la modalità di rilevamento, la fibra ottica deve essere sostituita se la fibra sul modulo di rilevamento delle gocce non è la stessa (vedere il passaggio 2.3.2). Durante la configurazione dei parametri, il valore di riferimento della fase dell'olio (spettrale di base) viene identificato automaticamente dal software, eliminando la necessità di regolazioni manuali. - La sostituzione della fibra ottica rilevata
- Rimuovere la fibra rilevata dal supporto della fibra (svitare in senso antiorario) e allentare la vite di fissaggio della fibra sul modulo droplet (Figura 1D).
- Se la fibra ottica non verrà utilizzata, rimuoverla dal modulo, inserirla nel supporto della fibra e serrarla. Inserire la fibra rilevata nella porta di rilevamento e serrare la vite di fissaggio della fibra sul modulo. La sostituzione della fibra ottica è terminata.
- Passare all'interfaccia Home e fare clic su Inizializza per consentire al sistema Omics di eseguire un autocontrollo dei suoi componenti, tra cui la pompa di iniezione, le impostazioni di temperatura, il test di scarico del liquido di scarto, il modulo di screening e il modulo di rilevamento delle goccioline.
- Durante l'inizializzazione, eseguire il test di scarico del liquido di scarto dal modulo di rilevamento delle goccioline iniettando 1 ml di alcol al 75% nella porta del liquido di scarto e osservando se il liquido fuoriesce normalmente.
- Per il test del modulo di screening, posizionare una piastra a 96 pozzetti sul posizionamento della piastra e osservare se il movimento della piastra è normale.
- Prima di eseguire l'inizializzazione, fare clic sull'interfaccia Impostazioni (Figura 2B) per configurare i parametri pertinenti: modalità di rilevamento (rilevamento basato su OD o fluorescenza; OD qui), temperatura di incubazione (37 °C) e tempo (30 giorni = 720 h), velocità dell'agitatore (20 giri/min), lunghezza d'onda di rivelazione OD (600 nm) e lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione della rivelazione di fluorescenza.
3. Generazione di goccioline
- Raccolta ed elaborazione di campioni di microbiota intestinale umano
- Prepara un vaso da notte e contenitori per le feci, lavati le mani e indossa i guanti per raccogliere campioni di feci fresche.
NOTA: Quando si raccolgono campioni di feci, evitare il più possibile la contaminazione delle urine. È meglio urinare in anticipo e mettere le feci in un contenitore pulito e asciutto. - Raccogliere asetticamente la quantità appropriata di feci del segmento medio e sigillarla in crioviali sterilizzati (circa 3-5 g per fiala). Mettere immediatamente le fiale sul ghiaccio per la successiva aliquotazione ed etichettatura.
NOTA: Se il campione di feci è grande o non può essere raccolto immediatamente, deve essere raccolto entro 2 ore al massimo. - Nel banco anaerobico, utilizzare un tampone sterile o uno strumento di campionamento delle feci per raccogliere un campione del segmento intermedio.
NOTA: Lo strato superficiale delle feci contiene cellule della mucosa intestinale perse ed è soggetto a contaminazione esterna; dopo l'esposizione all'aria, parte del DNA microbico inizia a degradarsi. - Trasferire i campioni di feci raccolti in provette sterili da microcentrifuga da 2 ml o crioviali sterili, ciascuna contenente 0,5-2,0 g di feci. Preparare due aliquote per il congelamento per campione.
- Risospendere il campione di feci fresche in soluzione fisiologica sterile, con ogni 100 mg di feci diluite in 1 mL di soluzione. Mescola accuratamente le feci fino a quando non sono visibili particelle di grandi dimensioni.
- Dopo la sedimentazione naturale per 10 minuti, filtrare in sequenza il surnatante attraverso filtri a rete sterili con pori di 200 mesh (0,075 mm), 400 mesh (0,038 mm) e 800 mesh (0,018 mm) per rimuovere il cibo non digerito e il particolato più piccolo. Infine, raccogliere il filtrato in provette da centrifuga sterili.
- Prelevare 10 μl della sospensione fecale filtrata e determinare la concentrazione microbica utilizzando un emocitometro e un microscopio a fluorescenza invertita.
NOTA: Dopo aver filtrato il surnatante del campione fecale attraverso maglie di diverse dimensioni, rimangono alcune particelle fecali più piccole. Pertanto, quando si determina la concentrazione microbica, le particelle attive osservate al microscopio sono considerate microrganismi, il che consente solo un calcolo approssimativo della concentrazione microbica. - Trasferire la sospensione fecale in una provetta da centrifuga sterile da 1,5 ml ed etichettarla con la data, la concentrazione microbica e il nome del campione. Riservarne un po' per esperimenti successivi e conservare il resto a 4 °C come uso futuro.
NOTA: Registrare tempestivamente le informazioni sul campione (nome del campione, tempo di raccolta) per garantire che i campioni vengano raccolti contemporaneamente (considerando i cambiamenti del ritmo temporale microbico intestinale dei mammiferi). L'intera raccolta e l'elaborazione del campione devono essere effettuate in un ambiente anaerobico.
- Prepara un vaso da notte e contenitori per le feci, lavati le mani e indossa i guanti per raccogliere campioni di feci fresche.
- Preparazione per la sospensione fecale iniziale
- Preparare il terreno Brain Heart Broth (BHI) secondo il protocollo del produttore e sterilizzarlo in autoclave a 121 °C per 15 min.
- Prelevare la sospensione fecale dal passaggio 3.1.8 ed eseguire diluizioni seriali con terreno BHI per ottenere una concentrazione di ~50 cellule/mL.
NOTA: Per riempire il flacone del campione, preparare almeno 40 ml di sospensione fecale. - Assicurandosi che una piccola barra di agitazione magnetica si trovi sul fondo, versare la sospensione fecale diluita nel flacone del campione fino alla posizione di aggiunta del campione. Avvitare il tappo e serrarlo. Quindi, inserire il connettore rapido A nel connettore rapido B per completare il processo di caricamento del campione (Figura 3A).
- Posizionare il flacone del campione nella posizione designata e separare i connettori rapidi A e B dal flacone del campione. Collegare il connettore rapido A del flacone del campione alla porta O3 del sistema Omics e il connettore C3 del microtubo e del chip microfluidico per la generazione di goccioline al connettore rapido B. Chiudere lo sportello della camera di generazione e coltivazione delle goccioline (Figura 3B).
- Generazione di goccioline
- Selezionare il numero desiderato di tubi per gocce da generare sull'interfaccia principale del software (Figura 2A).
NOTA: Ogni ciclo può produrre fino a 10 tubi per goccioline, con ogni tubo che genera circa 5.000 goccioline. - Fare clic su Produci nell'interfaccia principale del software per avviare la generazione di goccioline a cella singola.
NOTA: Verificare se lo scarico della pompa del liquido di scarico funziona o meno. Durante la generazione di goccioline, ogni gocciolina ha un volume di 2,0 μl. Vedere la sezione di discussione per una descrizione della generazione di goccioline. - Attendere che il segnale acustico indichi che la generazione delle goccioline è terminata. Chiudere il morsetto sul connettore C3 (Figura 1E) e rimuovere il flacone del campione.
- Selezionare il numero desiderato di tubi per gocce da generare sull'interfaccia principale del software (Figura 2A).
4. Coltivazione di goccioline
- Seleziona lo stesso numero di tubo per goccioline come durante la generazione di goccioline nell'interfaccia principale del software, fai clic su Cultura, conferma il tempo e la temperatura di coltivazione e inizia il processo. Monitora la barra di avanzamento sull'interfaccia principale che mostra l'avanzamento della coltivazione e il tempo rimanente.
- Attendere che il segnale acustico indichi che la coltivazione delle goccioline è terminata. Se il tempo di coltivazione deve essere prolungato, regolare il tempo direttamente sull'interfaccia di impostazione .
5. Screening delle goccioline
- Premere il pulsante UV sul sistema Omics per accendere la luce ultravioletta (UV) (Figura 1A), irradiare la camera di rilevamento e raccolta delle goccioline per 30 minuti, quindi spegnere la luce UV.
NOTA: Prima di accendere la luce UV, assicurarsi che lo sportello della camera di rilevamento e raccolta delle goccioline sia chiuso. - In un banco super pulito, aprire tutte le piastre da 96 pozzetti utilizzate per raccogliere le goccioline e impilarle l'una sull'altra senza coperchi, numerandole in sequenza dal basso verso l'alto. Assicurarsi che la piastra del pozzetto superiore sia coperta con un coperchio.
NOTA: Ogni ciclo può ospitare fino a dieci piastre da 96 pozzetti e il numero di piastre dipende dal numero totale di goccioline. - Aprire lo sportello della camera di rilevamento e raccolta delle gocce, posizionare le piastre dei pozzetti nelle posizioni designate (Figura 1D), estrarre il coperchio dalla piastra del pozzetto superiore e chiudere lo sportello della camera.
- Accendere la luce UV sul sistema Omics per 30 minuti per eseguire la sterilizzazione secondaria.
- Installazione del dispositivo di rimozione delle bolle d'aria
- Rimuovere il dispositivo di rimozione delle bolle d'aria dalla sua posizione di posizionamento, svitare il tappo e rimuovere la vite a forma di farfalla dal tappo (Figura 3C).
- Versare 200 ml di olio per la rimozione delle bolle d'aria nel dispositivo di rimozione delle bolle d'aria, avvitare saldamente il flacone con il tappo del dispositivo di rimozione delle bolle d'aria sul sistema Omics, quindi fissare il dispositivo di rimozione capovolto sulla posizione del dispositivo di rimozione delle bolle d'aria. L'installazione del dispositivo di rimozione delle bolle d'aria è completa.
NOTA: Quando si fissa il dispositivo di rimozione delle bolle d'aria sulla posizione, assicurarsi che non fuoriesca olio. In caso di perdite, serrare il coperchio.
- Selezionare il tubo delle gocce per l'ordinamento nell'interfaccia principale , fare clic su Ordinamento, inserire il numero di piastre a pozzetti da raccogliere, quindi avviare il processo. Dopo l'inizio dello screening delle goccioline, osservare l'area di visualizzazione del processo, che mostra le misurazioni in tempo reale della densità ottica delle goccioline (OD) o dei valori di fluorescenza.
- Analizzare circa 20-30 goccioline per controllare il valore OD. Ad esempio, se la maggior parte di essi ha un valore OD di ~0,2, che corrisponde al valore OD delle goccioline vuote, in base alla distribuzione di Poisson, impostare la soglia OD inferiore su 0,5 e la soglia OD superiore su 4,0. Le goccioline all'interno di questo intervallo verranno raccolte automaticamente in piastre a 96 pozzetti (Figura 4A).
NOTA: Secondo la legge di Beer-Lambert, il valore OD delle goccioline vuote è determinato dalla composizione del terreno di coltura all'interno delle goccioline. In genere, la soglia OD inferiore è impostata 0,2-0,3 unità in più rispetto al valore OD delle goccioline vuote per garantire una chiara distinzione tra goccioline vuote e goccioline contenenti microrganismi. - Attendere che il segnale acustico indichi che lo screening e la raccolta delle goccioline sono terminati. Aprire lo sportello della camera di rilevamento e raccolta delle goccioline, posizionare il coperchio della piastra del pozzetto sulla piastra del pozzetto superiore, quindi estrarre tutte le piastre del pozzetto dalla camera insieme per eseguire il successivo sequenziamento e backup.
6. Esportazione dei dati e visualizzazione delle mappe di calore
- Fare clic su Esporta dati per salvare i dati del segnale delle goccioline raccolti (Figura 4A, B).
- Fare clic su Mappa termica, selezionare il file di dati di raccolta delle goccioline e osservare i valori OD delle goccioline raccolte nella micropiastra visualizzate dal software. Visualizzare questi valori di OD come una mappa di calore, in cui l'intensità del colore corrisponde alla distribuzione OD tra i pozzetti, fornendo una rappresentazione chiara e intuitiva dei valori di OD monoclonali raccolti (Figura 4A, C).
7. Pulizia della cella MISS
- Dopo aver completato l'esperimento, selezionare il tubo delle gocce da pulire e fare clic su Pulisci per avviare la pulizia dello strumento.
8. Backup monoclonale microbico e preparazione del campione di sequenziamento
- Preparazione del campione di sequenziamento
- Nel banco anaerobico, aggiungere 100 μl di terreno BHI a ciascun pozzetto della piastra di goccioline raccolta, mescolare bene mediante pipettaggio, quindi prelevare 10 μl da ciascun pozzetto e trasferire il tutto in una provetta sterile da 15 mL. Vortex per ottenere una sospensione microbica mista.
- Aggiungere 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato alla sospensione microbica mista, centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti, rimuovere il surnatante e immergere il pellet microbico in azoto liquido per un rapido congelamento. La preparazione del campione di sequenziamento è completa.
- Utilizzare metodi di sequenziamento dell'amplicone dell'rDNA 16S mirati al dominio V3 e V4 dell'rDNA 16S. I primer di sequenziamento specifici utilizzati sono i seguenti: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA e 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
- Crioconservazione del campione monoclonale microbico:
- Dopo aver raccolto 10 μl di campione da ciascun pozzetto nelle piastre di goccioline (dal passaggio 8.1.1), aggiungere 30 μl di glicerolo a ciascun pozzetto. Posizionare le piastre a una temperatura inferiore a -80 °C per la conservazione del ceppo microbico.
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Risultati
Si stima che il microbiota intestinale umano, che costituisce la comunità microbica predominante, ospiti circa 4 × 1013 microrganismi nell'intestino, mostrando il suo vasto numero e la sua complessa composizione11. In questo studio, abbiamo mirato a isolare e coltivare il microbiota intestinale e abbiamo utilizzato il metodo della piastra solida come controllo per dimostrare le prestazioni ad alto rendimento della cellula MISS.
In primo luogo, abbiamo utilizz...
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Discussione
Questo protocollo delinea il funzionamento della cellula MISS per l'isolamento, la coltivazione, il rilevamento e la raccolta monoclonale microbico automatizzati e ad alto rendimento. Rispetto ai metodi tradizionali con i quali solo il ~20%-30% del microbiota intestinale poteva essere isolato e coltivato 2,12, il numero di cloni monoclonali ottenuti utilizzando il sistema Omics era 1,97 volte superiore a quelli ottenuti da piastr...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dai progetti di ricerca e sviluppo in aree chiave della provincia del Guangdong (2024B1111130002), dai progetti di ricerca e sviluppo della provincia di Hebei (22375503D) e dal progetto di apertura del laboratorio di ingegneria di Anhui per l'allevamento molecolare di microbiologia industriale (sovvenzione ELMB-07).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra di Petri da 100 mm | Merck KGaA, Darmstadt, Germania | P5731-500EA | Per la preparazione di piastre solide |
| Contenitori per feci da 30 ml | Boen Healthcare Co., Ltd | 611101 | Per la raccolta dei campioni di feci |
| 37 ° C incubatore a temperatura costante | Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd. | LRH-150 | Coltivare la piastra solida nell'incubatore |
| 96 pozzetti Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates | Corning | 3599 | Per il rilevamento del movimento della piastra a pozzetti e la raccolta delle goccioline |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | Per la preparazione di piastre solide |
| Olio per la rimozione delle bolle d'aria | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MISS cell-S-oil | L'olio nel dispositivo di rimozione delle bolle d'aria durante la vagliatura delle goccioline |
| Dispositivo di rimozione delle bolle d'aria | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MISS cell-S | Escludere la fase gassosa tra le goccioline prima di eseguire il rilevamento e la raccolta delle goccioline |
| Banco anaerobico | Argon e azoto Space Equipment Business Department, città di Haiyu, città di Changshu | VGB-4CM | Per il funzionamento asettico e la sterilizzazione UV in condizioni anaerobiche |
| Autoclave | Puhexi Health and Medical Equipment Co., Ltd. | MLS-830L | Per la sterilizzazione in autoclave di terreni BHI, tubi EP e così via. |
| Brodo per infusione di cuore cerebrale (BHI) | Qingdao Parco industriale high-tech Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8297-1 | Componenti del mezzo BHI L'elenco degli ingredienti: 38,5 g/L di brodo BHI in acqua distillata |
| Spalmatore di cellule | Merck KGaA, Darmstadt, Germania | HS8151 | Inoculare la soluzione microbica sulla piastra solida |
| Provetta da centrifuga, 15 ml | Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd | HB53397 | Per la preparazione di soluzioni microbiche |
| Computer | Lenovo | E450 | Installazione software e controllo cellulare MISS |
| Cryovial | Thermo Fisher | 2.0 mL | Per la conservazione delle feci |
| Acqua distillata | Beijing Mreda Technology Co., Ltd. | M306444-100ml | Aggiungere all'umidificatore per mantenere l'umidità nella camera di coltivazione delle goccioline |
| Tubo EP | Thermo Fisher | 2,0 mL | Per la raccolta dei campioni di feci |
| Microscopio invertito fluorescente | Olympus Life Science (LS) | CKX53 | Controllare e calcolare la concentrazione microbica |
| Glicerolo | GENERAL-REAGENT | G66258A | Per la conservazione |
| dei ceppiEmocitometro | Acmec | AYA0810-1ea | Calcola la concentrazione microbica |
| KCl | Ambeed | A442876 | Componenti della soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione PBS)L'elenco degli ingredienti: 8 g/L NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 in acqua distillata |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Componenti della soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione PBS)L'elenco degli ingredienti: 8 g/L di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4 in acqua distillata |
| Filtro a rete | Anping Jiufeng Wire Mesh Manufacturing Co., Ltd | 200 maglie (0,075 mm), 400 maglie (0,038 mm), 800 maglie (0,018 mm) | Rimuovere il cibo non digerito e il particolato più piccolo dai campioni di feci |
| Chip microfluidico per la generazione di microtubi e goccioline | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MISC-B2 | Per la generazione di goccioline e l'incubazione di goccioline |
| Olio cellulare MISS | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MISS cell-BOS-B | La fase oleosa per la microfluidica delle goccioline |
| Software cellulare MISS | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | Cella MISS V3.2.4 | Esecuzione di operazioni sperimentali sullo strumento per celle MISS |
| Na2HPO4 | Solarbio | D7292 | Componenti della soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione PBS)L'elenco degli ingredienti: 8 g/L di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4 in acqua distillata |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Componenti della soluzione salina fisiologica L'elenco degli ingredienti: 9 g/L di NaCl in acqua distillata |
| Pipetta | eppendorf | 2.5 μ L, 10 μ L, 100μ L, 1000μ L | Per la manipolazione dei liquidi |
| Tubo in politetrafluoroetilene | Shenzhen WOER Materiale termorestringente Co., Ltd. | 3401000141 | Per l'incubazione di goccioline. Questo materiale era già incluso nel micro-tubo e nel chip microfluidico per la generazione di goccioline |
| Flacone campione | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | Flacone cellulare MISS | Campionamento della soluzione microbica |
| Sistema di coltura omiche a singola cellula Microlitro-goccioline (cellula MISS) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MISS cell-G3f | Esecuzione dell'isolamento, coltivazione, rilevamento e raccolta monoclonale microbico |
| Centrifuga Superspeed | Thermo Fisher | Sorvall Lynx 4000 | Preparare la soluzione microbica per il sequenziamento |
| Siringa | Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd | 10 ml | Aspirare l'acqua distillata e iniettarla nell'umidificatore nella camera di coltivazione delle goccioline |
| Frigorifero a bassissima temperatura | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | Per la conservazione delle deformazioni (-80 ° C) |
Riferimenti
- Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. The structure and function of aquatic microbial communities. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).
- Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes. Mil Med Res. 11 (1), 34(2024).
- Lattermann, C., Büchs, J. Microscale and miniscale fermentation and screening. Curr Opin Biotechnol. 35, 1-6 (2015).
- Huang, Y., et al. High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol. 41 (10), 1424-1433 (2023).
- Brehm-Stecher Byron, F., Johnson Eric, A. Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3), 538-559 (2004).
- Jian, X., et al. Single-cell microliter-droplet screening system (miss cell): An integrated platform for automated high-throughput microbial monoclonal cultivation and picking. Biotechnol Bioeng. 120 (3), 778-792 (2023).
- Hu, B., et al. One cell at a time: Droplet-based microbial cultivation, screening and sequencing. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 169-188 (2021).
- Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. J Mol Biol. 431 (23), 4569-4588 (2019).
- He, Z., Wu, H., Yan, X., Liu, W. Recent advances in droplet microfluidics for microbiology. Chinese Chemical Letters. 33 (4), 1729-1742 (2022).
- Kaminski, T. S., Garstecki, P. Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays. Chem Soc Rev. 46 (20), 6210-6226 (2017).
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Simrén, M., et al. Intestinal microbiota in functional bowel disorders: A rome foundation report. Gut. 62 (1), 159-176 (2013).
- Periyannan Rajeswari, P. K., Joensson, H. N., Andersson-Svahn, H. Droplet size influences division of mammalian cell factories in droplet microfluidic cultivation. Electrophoresis. 38 (2), 305-310 (2017).
- Jian, X., et al. Microbial microdroplet culture system (mmc): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnol Bioeng. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Baret, J. -C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Kubie, L. S. The solubility of O2, CO2, and N2 in mineral oil and the transfer of carbon dioxide from oil to air. J Biol Chem. 72 (2), 545-548 (1927).
- Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. J Mech Behav Biomed Mater. 126, 105024(2022).
- Yao, J., Lin, F., Kim, H. S., Park, J. The effect of oil viscosity on droplet generation rate and droplet size in a t-junction microfluidic droplet generator. Micromachines. 10 (12), 808(2019).
- Venkateshwarlu, A., Bharti, R. P. Effects of capillary number and flow rates on the hydrodynamics of droplet generation in two-phase cross-flow microfluidic systems. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 129, 64-79 (2021).
- Nekouei, M., Vanapalli, S. A. Volume-of-fluid simulations in microfluidic t-junction devices: Influence of viscosity ratio on droplet size. Physics of Fluids. 29, 032007(2017).
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