Articolo metodologico

Tradurre le attività di trasferimento di elettroni extracellulari con transistor elettrochimici organici

DOI:

10.3791/67928

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31 gennaio 2025

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1McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Austin, 3Microelectronics Research Center, The University of Texas at Austin, 4Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 5Simpson Querrey Institute, Northwestern University, 6Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 7Department of Biology, Stanford University, 8Department of Chemistry, University of Texas at Austin

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per l'utilizzo di transistor elettrochimici organici (OECT) per tradurre l'attività di trasferimento di elettroni extracellulari (EET) in Shewanella oneidensis in segnali elettrici. Il sistema ibrido OECT offre maggiore robustezza, sensibilità e potenziale per test rapidi e ad alta produttività, rendendolo uno strumento efficace per le misure EET.

Abstract

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Il trasferimento extracellulare di elettroni (EET) è un processo attraverso il quale alcuni microrganismi possono trasferire elettroni attraverso le loro membrane cellulari a accettori di elettroni esterni, collegando il metabolismo cellulare al loro ambiente. Mentre Geobacter e Shewanella sono stati i modelli principali per la ricerca EET, studi emergenti rivelano che le specie EET-attive sono anche associate alla fermentazione e al microbioma intestinale umano. Sfruttando la capacità dell'EET di collegare sistemi biologici ed elettronici, presentiamo un protocollo per l'utilizzo di transistor elettrochimici organici (OECT) per tradurre l'attività EET microbica in segnali elettrici facilmente rilevabili. Questo sistema consente l'uso di risposte cellulari a stimoli esterni per applicazioni di biorilevamento e bioinformatica. In particolare, abbiamo dimostrato che il dedrogaggio del canale del poli(3,4-etilendiossitiofene): poli(stirenesulfonato) (PEDOT: PSS) nell'OECT è guidato dall'EET cellulare di Shewanella oneidensis. Controllando trascrizionalmente il flusso di EET da parte di circuiti genetici, stabiliamo la capacità di biorilevamento di questo sistema ibrido OECT di rilevare stimoli chimici, come le molecole induttrici. Inoltre, introduciamo porte logiche booleane basate su plasmidi all'interno delle celle, consentendo loro di elaborare segnali ambientali e guidare le variazioni di corrente negli OECT, dimostrando ulteriormente il potenziale bioinformatico di questi dispositivi. Questo metodo fornisce una nuova interfaccia tra i sistemi biologici e l'elettronica, consentendo future applicazioni di screening, biorilevamento e bioinformatica ad alto rendimento.

Introduzione

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I dispositivi in grado di trasdurre e amplificare le attività biologiche e chimiche in segnali elettrici sono fondamentali in vari campi, come il rilevamento 1,2, il calcolo neuromorfico 3,4 e l'elettronica indossabile5. Tra questi, i transistor elettrochimici organici (OECT) sono emersi come interfacce eccezionali tra sistemi biologici e lettori elettronici grazie alla loro compatibilità con ambienti acquosi e basse tensioni operative 6,7. Gli OECT differiscono dall'elettronica convenzionale in quanto utilizzano ioni in un elettrolita per modulare la conducibilità di un canale organico, che accoppia il trasporto ionico ed elettronico per ottenere una transconduttanza eccezionale8. Queste caratteristiche rendono gli OECT ideali per interfacciare i sistemi biologici con l'elettronica, in quanto possono amplificare i segnali biologici deboli e tradurli in letture elettriche.

Gli OECT operano alterando lo stato di drogaggio di un canale conduttore misto ionico-elettronico attraverso la diffusione ionica, tipicamente controllata applicando una tensione all'elettrodo di gate. Tuttavia, le reazioni biologiche o redox possono anche modificare la conduttività del canale, consentendo agli OECT di rispondere a una varietà di stimoli chimici e biologici. La funzionalizzazione degli OECT con doppi strati lipidici, canali ionici o biomolecole consente loro di rilevare analiti specifici, rendendoli utili per applicazioni di rilevamento 9,10. Ad esempio, gli OECT sono stati integrati con enzimi redox-attivi come la glucosio ossidasi per trasferire direttamente gli elettroni al canale, regolando la sua conducibilità in risposta alla concentrazione di glucosio11. Sebbene tali configurazioni siano efficaci per il biorilevamento, sono limitate nella loro capacità computazionale a causa del comportamento relativamente semplice di singoli enzimi o proteine.

Al contrario, le cellule viventi, in particolare i batteri, offrono una piattaforma versatile in grado di eseguire calcoli complessi e robusti 4,12,13,14,15. I batteri elettroattivi come Shewanella oneidensis e Geobacter sulfurreducens hanno la capacità unica di trasferire elettroni attraverso le loro membrane cellulari in un processo noto come trasferimento di elettroni extracellulari (EET). In condizioni anaerobiche, questi batteri accoppiano i loro processi metabolici alla riduzione o all'ossidazione degli accettori di elettroni esterni, inclusi metalli, ossidi metallici e materiali sintetici come i polimeri conduttori16 e le nanoparticelle17 (Figura 1A). Questa capacità è stata sfruttata nelle celle a combustibile microbiche per la generazione di energia e offre il potenziale per applicazioni bioelettroniche più avanzate18,19. Inoltre, i progressi nella biologia sintetica hanno permesso una precisa manipolazione genetica dei batteri elettroattivi per controllare i percorsi EET. Ingegnerizzando circuiti genetici che regolano l'espressione dei geni correlati all'EET, i ricercatori possono modulare il flusso di elettroni in risposta a specifici segnali ambientali o operazioni di logica computazionale20,21. Questo controllo genetico sull'EET apre la strada alla creazione di sistemi bio-ibridi in cui i calcoli batterici sono direttamente interfacciati con dispositivi elettronici come gli OECT. Ad esempio, i circuiti genetici batterici potrebbero essere progettati per rispondere a combinazioni di input chimici, attivando o disattivando le vie EET e quindi modulando la conducibilità di un canale OECT. Ciò consentirebbe letture elettriche dirette dei calcoli batterici, bypassando la necessità di fluorescenti o altri reporter biologici tradizionali.

Recenti progressi hanno dimostrato il potenziale dell'accoppiamento degli OECT con batteri elettroattivi. Ad esempio, Méhes et al. hanno utilizzato S. oneidensis per monitorare l'attività EET in tempo reale con un OECT di tipo p, illustrando come il metabolismo batterico potrebbe essere monitorato elettricamente22. Sebbene questo lavoro evidenzi la possibilità di utilizzare gli OECT per rilevare l'attività batterica, il potenziale del sistema ibrido per il biorilevamento e il biocalcolo rimane inesplorato. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente sviluppato transistor ibridi che incorporano S. oneidensis geneticamente modificato in OECT23 di tipo p. I risultati hanno dimostrato che il canale OECT potrebbe essere dedrogato attraverso attività EET batteriche (Figura 1B). Per migliorare ulteriormente le capacità di biorilevamento e ottenere informazioni meccanicistiche sul processo di dedoping, abbiamo ingegnerizzato i ceppi di S. oneidensis con circuiti genetici che regolano il flusso di EET. Ciò si traduce in cambiamenti prevedibili dell'output OECT in risposta a segnali ambientali come le molecole induttrici. Inoltre, integrando la logica booleana in questi circuiti genetici, abbiamo permesso letture elettriche dirette di complessi calcoli batterici.

Qui presentiamo il protocollo completo per il funzionamento del transistor ibrido, che copre la fabbricazione del dispositivo, la preparazione della coltura cellulare, le procedure di misurazione e l'analisi dei dati. Inoltre, affrontiamo considerazioni chiave come la pulizia dei dispositivi, la riutilizzabilità e il potenziale di automazione nei test ad alto rendimento.

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Protocollo

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NOTA: Tutti i prodotti chimici sono stati utilizzati così come sono stati ricevuti senza ulteriore purificazione. Se non specificato, sono state utilizzate sostanze chimiche di grado analitico.

1. Fabbricazione di dispositivi OECT

NOTA: Gli OECT sono fabbricati su vetrini da microscopio al quarzo utilizzando tecniche di microfabbricazione standard adattate da lavori precedenti24. Come mostrato nella Figura 2A, otto dispositivi OECT sono disposti su un unico vetrino standard. Fogli pretagliati di polidimetilsilossano (PDMS) vengono posizionati sul vetrino per formare camere OECT e porte di accesso. Il polimero conduttore di tipo p poli(3,4-etilendiossiossiofene): poli(stirenesulfonato) (PEDOT: PSS) viene utilizzato per il canale OECT e l'elettrodo di gate, con dimensioni di 150 μm x 10 μm per il canale e 500 μm x 500 μm per la punta del gate (Figura 2B). Un riepilogo del processo di fabbricazione del canale OECT e di assemblaggio del dispositivo è fornito nella Figura 2C.

  1. Fabbricazione di elettrodi d'oro
    1. Pulire i vetrini di quarzo sciacquandoli con acetone, alcol isopropilico (IPA) e acqua deionizzata (DI). Asciugare con gas N2 .
    2. Eseguire la pulizia al plasma O2 con 50 sccm a 150 W per 120 s.
    3. Fotoresist (PR) Spin-coat AZ5209e a 2 stadi: il primo a 500 giri/min, 100 giri/min di accelerazione per 5 s, e il secondo a 2000 giri/min, 1000 giri/min di accelerazione per 45 s.
    4. Infornate a 90 °C per 150 s.
    5. Accendere l'allineatore a maschera (Suss MA6) e selezionare i-line (365 nm) come sorgente UV, impostare i parametri: tempo di esposizione a 3,5 s (13 W), distanza di allineamento a 15 μm, tipo WEC a Contatto. e il tipo di esposizione su Duro.
    6. Caricare la maschera litografica e il vetrino nell'allineatore, allineare il vetrino alla maschera, quindi eseguire l'esposizione iniziale.
    7. Cottura inversa a 110 °C per 180 secondi.
    8. Rimuovere la maschera litografica ed eseguire l'esposizione all'alluvione con i seguenti parametri: tempo di esposizione come 25 s (13 W), tipo di esposizione come Flood E.
    9. Sviluppa il PR con lo sviluppatore AZ 400K 1:4 pre-diluito dal produttore. Versare la quantità appropriata di sviluppatore in un piatto cristallizzante per immergere il vetrino e agitare costantemente il piatto con movimenti circolari per 45 s. Quindi, rimuovere immediatamente il vetrino e immergerlo in acqua deionizzata per 45 s, risciacquare con acqua deionizzata e asciugare con N2.
      NOTA: il processo può essere messo in pausa qui.
    10. Spostare i vetrini nell'evaporatore a fascio elettronico. Pompare a 2,7 x 10-4 Pa (2 x 10-6 T) o inferiore.
    11. Depositare lo strato adesivo Ti (10 nm) e Au (100 nm) in sequenza. La velocità di deposizione può variare a seconda dello specifico evaporatore utilizzato. Si consiglia una velocità di deposizione di 0,1 nm/s per ottenere un buon equilibrio tra qualità della deposizione e tempo di elaborazione.
    12. Rimuovere il metallo in eccesso immergendo i vetrini in acetone per una notte. Dopo l'immersione, utilizzare una pipetta per spruzzare flussi di acetone sulla superficie del vetrino per rimuovere il metallo in eccesso rimasto. I vetrini da un quarto ottenuti dopo i passaggi precedenti sono indicati come vetrini per elettrodi OECT.
      NOTA: In alternativa, utilizzare la sonicazione per aiutare a rimuovere il metallo in eccesso.
  2. PEDOT: Fabbricazione di canali PSS
    1. Pulire i vetrini degli elettrodi OECT sciacquandoli con acetone, alcool isopropilico e acqua deionizzata. Asciugare con gas N2 .
    2. Cuocere i vetrini per almeno 5 minuti a 160 °C. Lasciare raffreddare i vetrini prima della centrifuga.
    3. Spin-coat AZ5209e PR a 2 stadi: primo a 500 giri/min, 100 giri/s in accelerazione per 5 s seguito da 2000 giri/min, 1000 giri/min/s in accelerazione a 45 giri/min.
    4. Infornate a 90 °C per 150 s.
    5. Avviare l'esposizione iniziale con i-line in modalità contatto duro per 3,5 s a 13 W.
    6. Cuocere al contrario a 110 °C per 180 s.
    7. Eseguire l'esposizione all'allagamento per 25 s a 13 W.
    8. Sviluppa con lo sviluppatore AZ 400K 1:4 per 45 s con agitazione circolare costante della parabola. Quindi, immergere i vetrini in acqua deionizzata per 45 s, risciacquare con acqua deionizzata e asciugare con N2.
      NOTA: il processo può essere messo in pausa qui.
    9. Sonicare la dispersione PEDOT: PSS per 5 minuti facendo galleggiare la bottiglia su un bagno d'acqua DI riempito fino alla linea di riempimento del sonicatore. Filtrare la dispersione PEDOT: PSS con un filtro da 0,22 μm per rimuovere i grumi.
    10. Spin-coat PEDOT: PSS a 3500 giri/min con accelerazione a 3500 giri/s per 60 s. Asciugare a 90 °C per 15 min.
    11. Rimuovere l'eccesso di pellicola PEDOT:PSS immergendo i vetrini in acetone per 12 minuti, seguiti da 1 minuto di sonicazione.
    12. Sciacquare i vetrini con acetone e poi IPA e asciugare con N2.
    13. Eseguire il trattamento con glicole etilenico (EG) posizionando i vetrini sopra la piastra riscaldante a 90 °C, quindi far cadere una quantità di EG sufficiente a coprire tutto il PEDOT: PSS per 5 minuti. Risciacquare con acqua deionizzata e asciugare con N2. I vetrini da un quarto ottenuti dopo i passaggi precedenti sono indicati come vetrini OECT.
  3. Fabbricazione della camera del dispositivo PDMS
    1. Realizzare fogli PDMS mescolando la base e l'agente indurente in un rapporto 10:1. Versare la soluzione nello stampo fino a raggiungere uno spessore di 3 mm e degasare per 1 ora in una camera di degasaggio a 2 quarti collegata a una pompa a vuoto.
    2. Polimerizzare la miscela posizionando lo stampo su un banco livellato per 48 ore a temperatura ambiente per garantire superfici PDMS lisce. Coprire lo stampo per evitare la contaminazione da detriti presenti nell'aria.
    3. Ritagliare il PDMS con lame di rasoio e creare le camere del dispositivo e le porte di scambio del fluido con punzoni circolari con diametri rispettivamente di 5 mm e 1,5 mm. Assicurarsi che l'altezza del PDMS sia di 3 mm come controllato durante la colata in stampo (passaggio 1.3.1)

2. Preparazione dei terreni

  1. Autoclave 500 mL di acqua ultrapura, quattro aghi di erogazione in acciaio inossidabile, due tappi in gomma per palloni (per i palloni a fondo tondo da 250 mL), due palloni a fondo tondo da 250 mL e un flacone per terreni in vetro da 500 mL. Conservare l'acqua ultrapura sterile a 4 °C per un uso futuro.
  2. Preparare il 2x Shewanella basal medium (SBM) modificato con 2x Wolfe's Trace Mineral Mix 0,1% casamino acids secondo la Tabella 1. Filtrare: sterilizzare il mezzo sul fondo del supporto di vetro sterile (ottenuto nel passaggio 2.1) con un filtro per flaconi. Questo mezzo è indicato come 2x SBM++, dove ogni + indica l'aggiunta di Trace Mineral Mix e casamino acidi. Conservare a 4 °C per un uso futuro.
  3. Filtrare separatamente ciascuna delle seguenti sostanze chimiche sterili (filtro da 0,22 μm): 50 mL di fumarato di sodio 1 M in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL; 1 mL di 2,5 mg/mL di kanamicina (KAN), denominata 100x KAN in una provetta sterile per microcentrifuga. Allocare 1 mL di lattato di sodio sterile al 60% p/p (usato come ricevuto) in una provetta per microcentrifuga. Conservare tutte le soluzioni preparate a 4 °C.
  4. Preparare separatamente 1 mL delle seguenti sostanze chimiche in provette sterili per microcentrifuga: 100 mM di isopropil ß-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG), denominato 100x IPTG; 10 mM 3-ossoesanoil-omoserina lattone (OC6), indicato come 100x OC6; 1 mM di aniidrotetraciclina cloridrato (aTc), indicato come 100x aTc. Conservare a 4 °C per un uso futuro.
  5. Utilizzando i matracci sterilizzati, i cappucci di gomma e gli aghi preparati al punto 2.1, spurgare il brodo medio. Allocare 200 mL di 2X SBM++ sterile e acqua ultrapura in palloni separati da 250 mL a fondo tondo. Sigillare i palloni con tappi di gomma e inserire aghi di erogazione sterili per creare una configurazione di lavaggio del gas (ago di ingresso dell'aria immerso nel liquido; ago di uscita del gas sopra la superficie del liquido). Spurgare con N2 per 15 min.
  6. Trasferire l'acqua 2x SBM++ e ultrapura spurgata, il lattato, il fumarato di sodio 1 M, il 100x KAN, il 100x IPTG, il 100x OC6 e il 100x aTc nel vano portaoggetti per un ulteriore utilizzo con l'OECT.

3. Monitoraggio dell'EET cellulare con dispositivi OECT

NOTA: Per garantire l'anaerobicità, l'esperimento OECT viene condotto in una scatola a guanti senza controllo dell'umidità a temperatura ambiente.

  1. Giorno 1
    1. Sterilizzazione e preparazione del dispositivo
      1. Autoclavare in autoclave i vetrini OECT, i fogli PDMS e l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl (RE) in contenitori separati. Asciugare cuocendo a 80 °C. Portare i vetrini OECT autoclavati e l'Ag/AgCl RE nel vano portaoggetti.
      2. Desorb ha intrappolato l'ossigeno nei fogli PDMS sottoponendolo al vuoto nell'anticamera del cassetto portaoggetti per 4 ore. Assemblare il dispositivo OECT posizionando i fogli PDMS sopra le guide OECT nel vano portaoggetti.
      3. Iniettare 45 μl di terreno SBM appropriato in ciascuna camera OECT. Per la maggior parte degli esperimenti, utilizzare 1x SBM++ integrato con 20 mM di lattato. Ad esempio, preparare 1 mL di 1x SBM++ mescolando 500 μL di 2x SBM++, 497 μL di acqua ultrapura sterile e 2,85 μL di lattato di sodio al 60% p/p.
      4. Coprire le porte della camera OECT con fogli PDMS per evitare l'evaporazione e la contaminazione del fluido.
      5. Monitorare la corrente del canale OECT IDS con una tensione di canale costante VDS di -0,05 V e una tensione di gate VGS di 0,2 V fino a quando la corrente non si stabilizza. La selezione della tensione può variare a seconda del dispositivo OECT o dei campioni biologici. Utilizzare le stesse tensioni di polarizzazione continua per il gate e il canale durante tutta la misurazione. La stabilizzazione può richiedere da ore a pochi giorni, a seconda del livello di vuoto e della durata del desorbimento nell'anticamera.
    2. Colture cellulari
      1. Striare le cellule (conservate a -80 °C) su piastre di agar contenenti LB (per ceppi non portanti plasmidi) o LB con 25 μg/mL di kanamicina (per ceppi che ospitano plasmidi) e crescere aerobicamente per una notte a 30 °C20,23.
  2. Giorno 2
    1. Preparazione cellulare (colture aerobiche)
      1. Prelevare casualmente singole colonie dalle piastre di agar LB (ottenute al punto 3.1.2.1) in 2 mL di 1x SBM++ integrato con 20 mM di lattato in 15 mL di provette di coltura. Mantenere le celle per una notte a 30 °C e 250 giri/min di agitazione. Preparare 6 mL di terreno di crescita senza cellule come controllo abiotico che verrà utilizzato successivamente nel lavaggio cellulare.
    2. Preparazione cellulare (coltura anaerobica)
      1. Trasferire le piastre di agar LB contenenti i ceppi da testare nel glovebox.
      2. Prelevare casualmente singole colonie da piastre di agar LB in 1 mL di SBM appropriato integrato con 20 mM di lattato e 40 mM di fumarato in provette di coltura da 15 mL. Ad esempio, preparare 1 mL di terreno per il ceppo inducibile da IPTG che richiede 1 mM di IPTG e 25 μg/mL di KAN mescolando 500 μL di 2x SBM++, 437 μL di acqua ultrapura sterile, 2,85 μL di lattato di sodio al 60% p/p, 40 mM di 1 M di fumarato di sodio, 10 μL di 100 mM IPTG e 10 μL di 2,5 mg/mL di KAN.
      3. Mantenere le celle a 30 °C per 18 - 24 ore senza agitarle. Per garantire la comparabilità tra i batch di esperimenti, mantenere tempi di crescita coerenti.
  3. Giorno 3
    1. Misura elettrochimica OECT iniziale
      NOTA: Il tipo di caratterizzazione OECT varia da tipi statici, come la polarizzazione a tensione costante, a tipi dinamici, come il gate pulsasing. In questo caso, utilizziamo il test a gradini della tensione di gate per ottenere caratteristiche sia dinamiche che statiche. La riconfigurazione del collegamento elettrico tra gli OECT e lo strumento (in questo caso un potenziostato multicanale) è assistita da schede a circuito stampato multiplex manuali (MUX) personalizzate. È possibile sviluppare schede MUX automatizzate per la misurazione ad alto rendimento.
      1. Misurare la corrente del canale OECT IDS corrispondente al passaggio di tensione di gate da 0 V a 0,2 V con le impostazioni descritte di seguito (i nomi esatti possono variare a seconda dello strumento).
      2. Il canale 1 dello strumento misura la corrente del canale OECT IDS. Per questo, impostare il nome della tecnica: Amperometria veloce; Tempo di equilibratura: 1 s; Tensione di equilibratura: - 0,05 V; Tensione di polarizzazione: -0,05 V; Durata: 14 s; Intervallo di campionamento: 0,5 ms.
      3. Il canale 2 dello strumento controlla la tensione di gate OECT VGS. Per questo, imposta il nome della tecnica: Modalità mista; Tempo di condizione: 1 s; Tensione di condizione: 0 V; Modalità Stage 1: Costante E; Tensione di polarizzazione stadio 1: 0 V; Tempo di esecuzione della fase 1: 4 s; Modalità Stage 2: Costante E; Tensione di polarizzazione stadio 2: 0,2 V; Tempo di esecuzione della fase 2: 10 s; Intervallo di campionamento: 0,5 ms.
      4. Ripetere il test a gradini della tensione di gate (passaggi da 3.3.1.1 a 3.3.1.3) per tutti gli OECT. Questo passaggio può essere automatizzato per i test ad alta produttività.
      5. Applicare una tensione di canale costante VDS di -0,05 V e una tensione di gate VGS di 0,2 V a tutti gli OECT fino all'inoculazione. Assicurarsi che le tensioni di polarizzazione siano le stesse di quelle utilizzate durante la stabilizzazione del dispositivo (passaggio 3.1.1.5).
    2. Preparazione dell'inoculo (colture aerobiche)
      1. Triplo lavaggio delle cellule mediante centrifugazione a 1503 x g per 4 minuti e risospensione in 1 mL di terreno fresco utilizzato per la crescita cellulare (passaggio 3.2.1.1). Dopo l'ultima (3a) centrifuga, risospendere le cellule in 0,5 mL (o metà del volume di coltura originale) per ottenere una sospensione cellulare concentrata a OD600 di 1 - 3,5. Regolare di conseguenza il volume finale della sospensione.
      2. Trasferire la sospensione cellulare nel cassetto portaoggetti.
      3. Per ottenere l'inoculo, diluire le cellule a un OD600 previsto di 0,1 (o 10 volte l'OD600 dell'inoculazione). Il terreno di delirio ha la stessa costituzione del mezzo di crescita, ma preparalo fresco nel vano portaoggetti con le scorte di terreno spurgate. Ad esempio, se le cellule sono state coltivate aerobicamente in SBM++ integrate con lattato, preparare SBM++ fresco integrato con lattato nella scatola a guanti per la diluizione dell'inoculo.
      4. Arrestare il potenziostato. Iniettare 5 μl di inoculo nella camera OECT (contenente 45 μl di SBM appropriato) per ottenere una ODfinale di 600 di 0,01 nell'OECT. Coprire le porte della camera OECT con fogli PDMS per evitare l'evaporazione e la contaminazione del fluido.
    3. Preparazione dell'inoculo (colture anaerobiche)
      1. Per ottenere l'inoculo, diluire le colture cellulari di 10 volte. Usa un terreno di delirio che abbia la stessa costituzione del mezzo di crescita ma manchi del fumarato. Ad esempio, se le cellule sono state coltivate anaerobicamente in SBM++ integrate con lattato, fumarato, KAN e IPTG, preparare SBM++ fresco integrato con lattato, KAN e IPTG nella scatola a guanti per la diluizione dell'inoculo.
      2. Arrestare il potenziostato. Iniettare 5 μl di inoculo nella camera OECT (contenente 45 μl di SBM appropriata). Coprire le porte della camera OECT con fogli PDMS per evitare l'evaporazione e la contaminazione del fluido.
    4. Misurazione continua e punti temporali
      1. Applicare tensioni di polarizzazione costanti ai canali OECT (VDS = -0,05 V) e al gate (VGS = 0,2 V) durante l'esperimento, tranne durante le misurazioni del punto temporale quando il potenziostato è collegato a singoli OECT per la caratterizzazione.
      2. Eseguire l'esperimento per 24 ore dopo l'inoculazione. Considerare la misurazione prima dell'inoculazione (vedere il passaggio 3.3.1) come il punto temporale di 0 ore.
      3. Cambiamenti significativi nello stato di drogaggio del canale OECT si verificano tipicamente durante le prime 8 ore. Selezionare 5-7 punti temporali per le misurazioni durante questo periodo, seguiti da una misurazione tra le 12 e le 16 ore e il punto temporale finale al segno delle 24 ore. Esempi di punti temporali potrebbero includere immediatamente dopo l'inoculazione e a 1 ora, 2 ore, 3 ore, 4,5 ore, 6 ore, 8 ore, 18 ore e 24 ore dopo l'inoculazione.
      4. Per evitare misurazioni notturne, iniziare l'inoculazione (vedere i passaggi 3.3.2 o 3.3.3) all'inizio della giornata per adattarsi alle frequenti misurazioni del punto temporale durante le prime 8 ore.
      5. Ripetere il passaggio descritto in 3.3.1 per ogni misurazione del punto temporale.
  4. Giorno 4
    1. Misura della curva di trasferimento all'ultimo punto temporale (24 h)
      1. Inserire l'Ag/AgCl RE nella camera OECT ruotando delicatamente e spingendo il RE attraverso la porta di scambio del fluido.
      2. Misura le curve di trasferimento dell'OECT spostando la tensione di gate da -0,1 V a 0,6 V mentre monitora la corrente del canale IDS con polarizzazione costante VDS a -0,05 V. Misura i potenziali accurati dell'elettrodo di gate e sorgente rispetto all'Ag/AgCl RE.
      3. Configurare lo strumento come descritto di seguito (i nomi esatti possono variare a seconda dello strumento).
      4. Il canale 1 dello strumento misura la corrente del canale OECT IDS, utilizzare la seguente impostazione: Nome tecnica: Cronoamperometria (CA), Tempo di equilibratura: 5 s, Tensione di equilibratura: - 0,05 V, Tensione di polarizzazione: -0,05 V, Tempo di esecuzione: 35 s, Intervallo di campionamento: 0,09915 s.
      5. Il canale 2 dello strumento controlla la tensione di gate OECT VGS, utilizzare la seguente impostazione: Nome della tecnica: Linear Sweep Voltammetry (LSV), Tempo di equilibrio: 5 s, Tensione di equilibrio: - 0,1 V, Tensione iniziale: -0,1 V, Tensione finale: 0,6 V, Passo di tensione: 0,002 V, Velocità di scansione: 0,02 V/s.
      6. Il canale 3 dello strumento misura il potenziale di sorgente OECT VS rispetto ad Ag/AgCl RE, utilizzare la seguente impostazione: Nome della tecnica: Potenziometria a circuito aperto (OCP), Tempo di esecuzione: 40 s, Intervallo di campionamento: 0,09915 s.
      7. Il canale 4 dello strumento misura il potenziale di gate OECT VG rispetto ad Ag/AgCl RE, utilizzare la seguente impostazione: Nome della tecnica: Potenziometria a circuito aperto (OCP), Tempo di esecuzione: 40 s, Intervallo di campionamento: 0,09915 s.
      8. Ripetere la misurazione della curva di trasferimento per tutti gli OECT. Dopo ogni misurazione, sciacquare l'elettrodo di riferimento Ag/AgCl (RE) con etanolo al 70% e pulirlo con un nuovo asciugamano a basso contenuto di lanugine. L'Ag/AgCl RE può essere riutilizzato all'interno dello stesso gruppo di campioni per i triplicati, ma non deve essere riutilizzato tra gruppi di campioni diversi.

4. Analisi dei dati

  1. Estrazione dei dati
    1. Utilizza il codice MATLAB personalizzato per l'elaborazione dei dati per automatizzare l'estrazione e la registrazione dei dati dal software nativo dello strumento, riducendo significativamente i tempi di elaborazione. Gli script MATLAB sono disponibili nel Texas Data Repository (https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D).
  2. Elaborazione dati
    1. Adattare i dati della corrente del canale OECT IDS per ottenere le costanti di velocità k per ulteriori analisi e confronti (Figura 3). Per i campioni di cellule compatibili con EET, riteniamo che il singolo modello esponenziale abbia fornito l'adattamento migliore. Pertanto, abbiamo utilizzato il modello di decadimento esponenziale monofase nel software di analisi per adattare i dati della serie temporale IDS e ottenere la costante di velocità adattata k. Questi dati della serie temporale IDS possono essere il valore grezzo o normalizzati al punto temporale 0 h, poiché la costante di velocità k riflette la velocità di variazione anziché i valori assoluti.
    2. Ottenere l'IDS normalizzato dividendo i valori di IDS per il valore del punto temporale 0 h (IDS0), indicato come IDS/IDS0.
  3. Determinazione della costante di velocità k
    1. Aprire il software di analisi (Prism 10, GraphPad) e creare un nuovo progetto facendo clic su File > Nuovo > Nuovo file di progetto. Nella scheda Crea, scegli XY. Nella sezione Opzioni, impostare X su Numeri e Y su Invio e tracciare un singolo valore Y per ogni punto.
    2. Importare i dati IDS correnti del canale OECT nella tabella. Adattare i dati IDS al modello di decadimento esponenziale monofase facendo clic su Analizza nella scheda Analisi. Trova il metodo di regressione non lineare (adattamento della curva) nelle analisi XY. Assicurati di selezionare Tutti i set di dati che devono essere montati sulla destra, quindi fai clic su OK.
    3. Nella nuova finestra Parametri, selezionare Un modello di decadimento di fase nel gruppo Esponenziale, quindi fare clic su OK. L'equazione del modello è la seguente:
      Y=(Y0 - Plateau)*e-k*X + Plateau
      Dove: Y è la corrente IDS del canale OECT, T è il tempo, k è la costante di velocità.
    4. Una volta ottenuti i valori k, rivedere la qualità dell'adattamento controllando il valore R al quadrato per ogni adattamento. Un buon raccordo dovrebbe avere un R2 superiore a 0,95.
  4. Test t di Student a due code non accoppiato
    1. Per valutare la significatività statistica tra i gruppi campione, eseguire i test t di studenti a due code non accoppiati.
    2. Aprire il software di analisi e creare un nuovo progetto facendo clic su File > Nuovo > Nuovo file di progetto. Nella scheda Crea, scegli XY. Nella sezione Opzioni, impostare X su Numeri e Y su Immettere 3 valori replicati in sottocolonne affiancate.
    3. Importare i valori k della costante di velocità adattata nella tabella. Eseguire il test t facendo clic su Analizza nella scheda Analisi. Trova il metodo t-test (e test non parametrici) in Analisi delle colonne. Assicurati di selezionare due set di dati ogni volta, quindi fai clic su OK.
    4. Nel manuale di progettazione sperimentale, selezionare Non abbinato, Sì. Utilizzare il test parametrico e il test t non accoppiato. Si supponga che entrambe le popolazioni abbiano le stesse opzioni SD. I valori p verranno generati per ogni confronto. Nelle figure, i valori p sono rappresentati come segue: n.s.: p > 0,05 (non significativo), *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001, ****: p ≤ 0,0001.
    5. Ripetere i passaggi 4.4.3 -4.4.4 per tutti i set di dati pertinenti.

5. Pulizia e riutilizzabilità del dispositivo OECT

  1. Dopo l'esperimento, smontare il dispositivo e far bollire i vetrini OECT in acqua saponata (1:10, sapone: acqua deionizzata) per 15 minuti.
  2. Spostare rapidamente i vetrini in un becher contenente acqua deionizzata a temperatura ambiente e attendere 5 minuti che i vetrini si raffreddino. Sciacquare i vetrini con DI e asciugare con aria pulita.
  3. Misurare la resistenza del canale OECT con un multimetro. Se la resistenza del canale è entro il 400% del valore originale, il dispositivo può essere riutilizzato per l'esperimento dopo la sterilizzazione (Passaggio 3.1.1). Le guide OECT possono anche essere pulite utilizzando i seguenti passaggi e sono adatte per la fabbricazione di canali utilizzando il passaggio 1.2.
    ATTENZIONE: La soluzione di piranha è altamente corrosiva e può generare un calore significativo. Utilizzare sempre dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati, inclusi guanti, occhiali protettivi e camice da laboratorio. Maneggiare con estrema cura e rispettare le linee guida di sicurezza dell'istituto.
  4. Preparare la soluzione di piranha in una cappa ben ventilata. Aggiungere con cautela e lentamente il 30% (p/p) di perossido di idrogeno all'acido solforico al 98% in un rapporto 1:4 mescolando inclinando delicatamente il piatto di cristallizzazione avanti e indietro.
  5. Posizionare la capsula di cristallizzazione su una piastra calda riscaldata a 70 °C. Usa le pinzette per portare e immergere i vetrini nella soluzione di piranha per 1 minuto.
  6. Trasferire con cura i vetrini in un becher contenente acqua deionizzata e lasciarli riposare per almeno 1 minuto. Sciacquare accuratamente i vetrini con acqua deionizzata e asciugarli con aria.
  7. Smaltire la soluzione piranha secondo le linee guida istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici. Neutralizzare la soluzione di piranha aggiungendola lentamente a un becher contenente una miscela di acqua ghiacciata circa 4 volte il volume della soluzione. Aggiungere gradualmente un agente neutralizzante (ad es. 10 M NaOH) monitorando il pH con strisce reattive fino a quando non è neutro.

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Risultati

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Costante di velocità adattata k
La costante di velocità adattata k della corrente del canale OECT IDS funge da metrica affidabile per valutare l'attività EET del campione. Mentre le tensioni di polarizzazione di gate costanti influenzerebbero le costanti di velocità, scegliamo 0,2 V per garantire una polarizzazione positiva per incoraggiare il trasferimento di elettroni batterici, evitando al contempo il dedrogaggio rapido a tensioni di gate più elevate e fo...

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Discussione

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Confronto tra celle elettrochimiche (EC)
Uno dei principali vantaggi dell'adattamento della costante di velocità dalla corrente del canale OECT è che riduce al minimo la variazione del dispositivo concentrandosi sulla dinamica sottostante delle variazioni di IDS piuttosto che sull'uscita grezza. In combinazione con la capacità intrinseca di amplificazione del segnale degli OECT, questo approccio migliora la robustezza dei sistemi OECT ibridi rispetto alle t...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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I plasmidi di base per il circuito NAND sono stati generosamente forniti dal Voigt Lab tramite Addgene (#49375, #49376, #49377). Questa ricerca è stata finanziata dalla Welch Foundation (Grant F-1929, B.K.K.), dal National Institutes of Health con il numero di premio R35GM133640 (B.K.K.), da un premio NSF CAREER (1944334, B.K.K.) e dall'Air Force Office of Scientific Research con il numero di premio FA9550-20-1-0088 (B.K.K.). A.J.G. è stato sostenuto attraverso una National Science Foundation Graduate Research Fellowships (Program Award No. DGE-1610403). Gli autori riconoscono l'uso di strutture di ricerca condivise supportate in parte dal Texas Materials Institute, dal Center for Dynamics and Control of Materials: an NSF MRSEC (DMR-1720595) e dalla NSF National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (ECCS-1542159). Ringraziamo con gratitudine l'uso delle strutture all'interno del laboratorio di microscopia principale dell'Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas ad Austin.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-ossoesanoil-omoserina lattone Sigma-Aldrich
anidrotetraciclina cloridrato Casamino acidi VWR
 Apparecchiature
Glicole etilenicoSigma-Aldrichanidro 99,8%, 
Soluzione tampone HEPES VWR1 M in acqua, pH = 7,3
isopropil ß-D-1-tiogalattopiranoside Teknova
kanamicina solfato Growcells
Solfato di magnesio (II) eptaidrato VWR
PEDOT:PSS sospensione acquosa Heraeus Epurio LLCClevios PH1000
Fosfato di potassio bibasico Sigma-Aldrich
Fosfato di potassio monobasicoSigma-Aldrich
Potenziostat Vetrini microscopici al quarzo PalmSens BVMultiPalmSens4
 Valore dell'annuncio FQ-S-003
Vetrini al quarzo microscopici 
Cloruro di sodio VWR
DL-lattato di sodioTCI60% in acqua
Fumarato di sodio VWR98%
Acido solforico Sigma-Aldrich95,0%-98,0%
Elastomero siliconico bicomponente Scienze della microscopia elettronicaSylgard184
Miscela di minerali in tracce di Wolfe ATCC
VWR

Riferimenti

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