Articolo metodologico

Previsione e convalida della regolazione del danno dei podociti e del trattamento della malattia renale diabetica di Yinhuo Tang

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DOI:

10.3791/67939

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20 giugno 2025

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1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Utilizzando la farmacologia di rete e la validazione sperimentale, questo protocollo rivela il meccanismo d'azione di Yinhuo Tang (YHT) nel trattamento della malattia renale diabetica (DKD) e come YHT riduce il danno ai podociti nei topi DKD attraverso l'inibizione della via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB.

Abstract

La malattia renale diabetica (DKD) è una malattia renale cronica caratterizzata da proteinuria massiva e ridotta velocità di filtrazione glomerulare. La principale caratteristica patologica della DKD è la microangiopatia renale e ~40% dei pazienti diabetici svilupperà DKD. Le proteine CD2AP e WT-1 associate ai podociti svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento della normale funzione dei podociti e dell'integrità della barriera di filtrazione glomerulare. Quando la struttura o la funzione dei podociti viene interrotta - a causa di infiammazione, stress ossidativo o altri insulti patologici - il diaframma a fessura e il citoscheletro di actina vengono danneggiati, portando a un aumento della permeabilità della barriera di filtrazione glomerulare e con conseguente proteinuria. Yinhuo Tang (YHT) è una prescrizione della medicina tradizionale cinese che ha la funzione di ridurre la proteinuria e ritardare il deterioramento della funzione renale; tuttavia, il meccanismo della YHT nel trattamento della DKD non è chiaro. In questo articolo, basato sulla farmacologia di rete e su esperimenti su animali, abbiamo esaminato la glicemia, la funzionalità epatica, la funzione renale, i lipidi nel sangue, la patologia renale, i livelli di espressione delle proteine marcatrici dei podociti CD2AP e WT-1, nonché la via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB nei topi db/db dopo la somministrazione di YHT per 8 settimane. I nostri risultati mostrano che YHT riduce i livelli di espressione dei fattori infiammatori inibendo la via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB, riducendo così il danno ai podociti per svolgere un ruolo nel ritardare la progressione della DKD.

Introduzione

La malattia renale diabetica (DKD) è una complicanza grave e prevalente del diabete e rimane la principale causa di insufficienza renale allo stadio terminale a livello globale1. La malattia progredisce attraverso una serie di processi patologici complessi, come l'ingrossamento glomerulare, l'espansione mesangiale, la fibrosi tubulointerstiziale e l'eccessivo accumulo di componenti della matrice extracellulare 2,3. Nonostante i miglioramenti nella gestione del diabete, le terapie attuali mirano principalmente a controllare i livelli di glucosio nel sangue e la pressione sanguigna, che rallentano solo la progressione della DKD piuttosto che invertire i suoi cambiamenti patologici sottostanti. Ciò sottolinea l'urgente necessità di opzioni di trattamento più complete ed efficaci 4,5.

La medicina tradizionale cinese (MTC) è emersa come una promettente terapia alternativa nel trattamento di malattie croniche come la DKD 6,7,8. La MTC enfatizza un approccio terapeutico olistico, in grado di affrontare la natura complessa e multi-target della DKD. Tra le varie formulazioni di MTC, è stato dimostrato che lo Yinhuo Tang (YHT) possiede molteplici funzioni fisiologiche, come nutrire lo yin (per integrare il volume del sangue), tonificare il rene (per migliorare la funzione renale), eliminare il calore (per sopprimere l'infiammazione) e sottomettere lo yang (per abbassare la pressione sanguigna)9,10,11. Tuttavia, manca ancora una comprensione completa dei meccanismi con cui YHT allevia la DKD.

La proteina CD2AP correlata ai podociti è una proteina chiave nel podocita, cruciale per mantenere l'integrità della barriera di filtrazione, mentre WT-1 svolge un ruolo critico nello sviluppo renale e nella fibrosi 12,13,14,15,16. Pertanto, la normale funzione di queste due proteine è vitale per la normale funzione di filtrazione glomerulare. La letteratura esistente suggerisce che questi bersagli sono coinvolti nella progressione della DKD, e ipotizziamo che i componenti attivi di YHT possano interagire con questi bersagli per esercitare effetti terapeutici. Questo studio mira a confermare queste interazioni e a fornire informazioni più approfondite su come YHT modula le vie di malattia della DKD.

In questo studio, impieghiamo una combinazione di farmacologia di rete ed esperimenti sugli animali per esplorare i meccanismi terapeutici di YHT nella DKD. La farmacologia di rete, che integra strumenti bioinformatici per analizzare le complesse interazioni tra composti attivi e bersagli biologici, ci permette di esplorare la natura multi-target e multi-pathway dell'azione di YHT 17,18,19. I metodi tradizionali di scoperta di farmaci spesso enfatizzano gli interventi a bersaglio singolo. Al contrario, la farmacologia di rete funge da strumento predittivo che aiuta a identificare potenziali percorsi e bersagli molecolari, offrendo approfondimenti preliminari sui possibili meccanismi d'azione di terapie complesse. Sebbene non sostituisca le rigorose fasi sperimentali e normative necessarie per lo sviluppo di farmaci, la farmacologia di rete può guidare la generazione di ipotesi e semplificare la ricerca in fase iniziale20.

In definitiva, questo studio mira a colmare il divario tra la medicina tradizionale e quella moderna, fornendo prove scientifiche per l'integrazione della MTC nel trattamento della DKD. I risultati di questa ricerca possono aiutare a sviluppare strategie di trattamento più efficaci e sicure per la DKD, offrendo un'alternativa alle cure standard che sono spesso limitate dagli effetti collaterali. Delucidando i meccanismi molecolari della YHT e convalidando il suo potenziale terapeutico, speriamo di dimostrare l'ampia applicabilità della MTC nel trattamento della DKD.

Protocollo

Per questo studio sono stati selezionati un totale di trenta topi maschi di 6 settimane spontanei diabetici di tipo II (C57BL/Ksj db/db) e sei topi maschi di controllo non diabetici (db/m) con lo stesso background genetico. I topi sono stati ospitati per 2 settimane in un ambiente sterile di grado SPF presso l'Animal Experiment Center dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Changchun (numero di licenza: SYXK (JI) 2023-0014). Durante questo periodo, sono stati forniti loro una dieta di mantenimento regolare e acqua sterile. La glicemia a digiuno è stata misurata nei topi db/db all'inizio e alla fine del periodo di 2 settimane e solo quelli con risultati superiori a 11,1 mmol/L in entrambi i test sono stati inclusi nell'esperimento. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Changchun (numero ID: 2024147).

1. Preparazione del farmaco

  1. Preparazione di YHT (Tabella 1)
    1. Seleziona Rehmannia glutinosa (30 g), Ophiopogon japonicus (10 g), Morindae Officinalis Radix (10 g), Poria cocos (15 g) e Schisandra chinensis (6 g) e sciacqua le erbe con acqua per rimuovere impurità e polvere dalla superficie. Quindi, mescolare 71 g di erbe grezze con 710 ml di acqua distillata e immergere in vasi di ceramica per 60 minuti
    2. Dopo l'ebollizione a 100 °C, abbassare la temperatura del decotto a 80 °C per 60 minuti e poi filtrare la feccia attraverso due strati di garza medica. Conservare il liquido in frigorifero a 4 °C.
    3. Aggiungere 710 ml di acqua distillata alle feccia di cui sopra e ripetere l'ammollo dal passaggio 1.1.1 e dal passaggio 1.1.2 una volta; conservare il liquido in frigorifero a 4 °C.
    4. Mescolare i due liquidi medicinali di cui sopra dai passaggi 1.1.2 e 1.1.3 e metterli nella vaschetta del materiale del liofilizzatore sottovuoto. Avviare la pompa del vuoto per rimuovere l'aria dalla camera di liofilizzazione, impostare la temperatura a -40 °C e mantenerla per 6 ore per congelare l'acqua nella soluzione farmaceutica allo stato solido. Quindi, regolare la temperatura a -20 °C per 36 ore per sublimare l'acqua sotto forma di cristalli di ghiaccio in gas. Infine, impostare la temperatura a 40 °C, mantenerla per 24 ore per rimuovere l'umidità residua dalla soluzione farmacologica, spegnere il riscaldamento e la pompa del vuoto e rimuovere la polvere liofilizzata (polvere YHT).
    5. Pesare 0,4615 g, 0,923 g e 1,846 g di polvere YHT liofilizzata, sospendere in 1 mL di soluzione fisiologica e fare la sospensione di YHT con le concentrazioni di 0,4615 g/mL, 0,923 g/mL e 1,846 g/mL, rispettivamente.
  2. Preparazione del Valsartan
    1. Aggiungere valsartan (10,29 mg) in 50 ml di PEG300 e agitare bene per scioglierlo completamente.
    2. Aggiungere 50 mL di soluzione salina alla soluzione del passaggio 1.2.1 e agitare bene per omogeneizzare e ottenere una soluzione di valsartan con una concentrazione di 10,29 mg/mL.

2. Trattamenti farmacologici

NOTA: L'esperimento è stato diviso in sei gruppi: il gruppo di controllo normale (CON), il gruppo modello (MOD), il gruppo di controllo positivo valsartan (POS), il gruppo a basso dosaggio dell'YHT (YH-L), il gruppo a dose media dell'YHT (YH-M) e il gruppo ad alto dosaggio dell'YHT (YH-H). Gli esseri umani adulti hanno bisogno di 71 g di YHT al giorno. Secondo la formula di conversione della dose sperimentale di farmaco per topo e uomo, la dose giornaliera per il topo era di ~9,23 g/kg:

Dose sperimentale equivalente per topo (g/kg) = dose umana (g)/peso corporeo (70 kg) × 9,1

  1. Afferrare saldamente la parte posteriore dei topi con la mano non dominante in modo che la testa, il collo e il corpo siano in linea retta (per evitare di lottare) e posizionare l'ago da 1 ml di sonda in modo appropriato con un angolo simile alla curvatura fisiologica dell'esofago dei topi. Spingi l'ago della sonda attraverso l'angolo della bocca dei topi, premilo sulla lingua, premilo contro il palato e spingilo delicatamente verso l'interno nello stomaco.
  2. Spingere lentamente il farmaco usando l'indice della mano dominante e ritirare l'ago verticalmente per completare l'operazione di gavage.
    NOTA: La dose del farmaco è stata di 10 ml/kg per un totale di 4 settimane.
    1. Somministrare 10 ml∙kg-1∙day-1 di soluzione salina mediante sonda gastrica a topi CON e MOD.
    2. Somministrare 10,29 mg∙kg-1∙day-1 valsartan sospensione mediante sonda gastrica ai topi del gruppo POS.
    3. Somministrare le seguenti dosi di YHT per sonda gastrica a questi gruppi: 4,615 g∙kg-1∙die-1 al gruppo YH-L; 9,23 g∙kg-1∙giorno-1 al gruppo YH-M; 18,46 g∙kg-1∙giorno-1 al gruppo YH-H.

3. Valutazione dell'efficacia di YHT

  1. Rilevamento degli indici biochimici del sangue e delle urine
    1. Dopo 8 settimane di somministrazione continua del farmaco, raccogliere 24 ore di urina dai topi utilizzando una gabbia metabolica, centrifugare l'urina raccolta a 7.992 × g per 10 minuti, rimuovere il surnatante e misurare il livello di proteine urinarie utilizzando il kit per il test delle proteine urinarie.
    2. Afferrare la parte posteriore del mouse con la mano non dominante per fissare il mouse e utilizzare il mignolo e l'anulare della stessa mano non dominante per fissare la coda del mouse. Sterilizzare la punta della coda del topo con batuffoli di cotone a vapore di iodio. Con la mano dominante, tieni un ago per la raccolta del sangue per perforare rapidamente la punta della coda del topo, stringi dalla radice della coda del topo alla punta della coda e lascia cadere il sangue sulla carta del test della glicemia.
    3. Usando la mano non dominante, afferra la coda del topo, mentre assicuri l'area scapolare con il pollice e l'indice, assicurandoti che l'addome del topo sia rivolto verso l'alto. Con la mano dominante, tenere una siringa da 1 ml riempita con fenobarbital sodico. Inserire l'ago (3-5 mm di profondità) nella cavità addominale con un angolo di 30-45°, mirando alla regione tra l'ombelico e gli arti posteriori, con l'ago diretto verso la testa. Estrarre lentamente lo stantuffo della siringa per verificare la presenza di sangue; Se il sangue viene aspirato, riposizionare l'ago di conseguenza.
    4. Iniettare lentamente la soluzione di pentobarbital sodico per garantire una somministrazione uniforme e ritirare la siringa al termine dell'iniezione. Attendi 10 minuti, quindi con il forcipe nella mano dominante, pizzica delicatamente le dita degli arti posteriori del topo per verificare la risposta. Se si osserva ancora una risposta, somministrare una piccola dose aggiuntiva (10 mg/kg) secondo necessità.
      NOTA: Supponendo che un topo pesi 60 g e che la soluzione di fenobarbital sia all'1% p/v, 0,06 mL è la dose aggiuntiva da somministrare in caso di qualsiasi risposta.
    5. Usa le forbici per tagliare i baffi e i peli intorno agli occhi dei topi, usando la mano non dominante per premere la pelle intorno agli occhi da cui devono essere rimossi i bulbi oculari in modo che i bulbi oculari sporgano. Sterilizzare la pelle intorno ai bulbi oculari con etanolo, utilizzare una pinzetta per estrarre rapidamente i bulbi oculari in modo che il sangue goccioli nelle provette per microcentrifuga (1,5-2 mL), incubare le provette a temperatura ambiente per 10 minuti, centrifugare le provette per 10 minuti a 7.992 × g ed estrarre la soluzione surnatante.
    6. Misurare i livelli di espressione della creatinina sierica (Scr), dell'azoto ureico nel sangue (BUN), dell'albumina (ALB), dell'alanina aminotransferasi (ALT), dell'aspartato aminotransferasi (AST), dei trigliceridi (TG) e del colesterolo totale (TC) nel siero secondo le istruzioni del kit.
  2. Separazione dei tessuti renali
    1. Dopo il prelievo di sangue, fissare i topi sulla placca chirurgica in posizione supina, tagliare i peli della regione toracica anteriore dei topi, sterilizzare la regione toracica anteriore usando etanolo, tagliare la pelle addominale con le forbici e spingere da parte l'intestino tenue e crasso per esporre i reni.
    2. Rimuovere il tessuto renale di topo, utilizzare una pinza emostatica per separare bruscamente il periostio e posizionare il rene sinistro in un congelatore a -80 °C per la conservazione e il rene destro in una provetta da 20 ml contenente una soluzione di paraformaldeide al 4% per fissare il rene.
    3. Togliere i reni destri dalla formaldeide dopo 24 ore, sciacquare brevemente con acqua distillata per 5 minuti, disidratare con un gradiente di etanolo anidro (100% → 95% → 85% → 75%, 5 minuti ciascuno), rendere trasparenti con xilene a gradiente (2 x 10 minuti), immergerli in cera di paraffina e lasciare solidificare i blocchi di cera a temperatura ambiente21. Quindi, metterlo nel congelatore a -20 °C per una notte.
    4. Togliete il blocco di cera, affettatelo ad uno spessore di 3 μm, mettetelo in acqua per dispiegarlo, poi ripescatelo con un vetrino, e mettetelo in forno a temperatura costante a 40 °C per cuocere per 30 min e poi conservatelo per le successive analisi
  3. Analisi istopatologica renale
    1. Rimuovere il rene destro, eseguire la deceratura graduale dello xilene e la disidratazione con etanolo anidro come sopra (passaggio 3.2.3) e lavare con acqua distillata.
    2. Eseguire la colorazione secondo le istruzioni dei kit di colorazione ematossilina ed eosina (H&E), colorazione acido-Schiff periodica (PAS) e Masson.
    3. Eseguire nuovamente la disidratazione dell'etanolo anidro a gradiente e la trasparenza dello xilene come al punto 3.2.3.
    4. Dopo l'essiccazione a temperatura ambiente, montare le sezioni di tessuto sui vetrini con un vetrino coprioggetti utilizzando una gomma neutra come mezzo di montaggio. Osservare i vetrini e visualizzarli al microscopio ottico con un ingrandimento di 400x.
  4. Analisi immunoistochimica del tessuto renale
    1. Rimuovere il rene destro, decerare e disidratare le sezioni come descritto al punto 3.2.3, immergerle in 10 mM di soluzione tampone citrato di sodio (pH 6,0) e riscaldare (125 °C, 103 kPa) per 5 minuti per la riparazione dell'antigene. Dopo 10 minuti, rimuovere le sezioni, raffreddare a temperatura ambiente e lavarle 3 x 5 minuti in 1x PBS.
    2. Mettere le sezioni in una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti per bloccare la perossidasi endogena e lavare 3 x 5 minuti in PBS.
    3. Aggiungere il 10% di siero di capra goccia a goccia alle sezioni, assicurandosi che il siero di capra copra uniformemente l'intera sezione. Mettere le sezioni in una scatola umida, incubare a 37 °C per 30 minuti e lavare 3 x 5 minuti con PBS.
    4. Aggiungere gli anticorpi primari COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) goccia a goccia (vedere la Tabella dei materiali) e incubare in una scatola umida a 4 °C in frigorifero per una notte.
    5. Rimuovere la sezione, lavare con PBS 3 x 5 min, aggiungere l'anticorpo secondario (1:3.000) goccia per goccia, incubare a 37 °C per 60 min e lavare con PBS per 3 x 5 min.
    6. Aggiungere la soluzione di sviluppo del colore 3,3'-diaminobenzidina (DAB) per 10 minuti, lavare via la soluzione di sviluppo del colore con acqua distillata, incubare con 100 μL di ematossilina per 5 minuti a temperatura ambiente e risciacquare con acqua distillata per 5 minuti.
    7. Disidratare, trasparentizzare e sigillare come descritto nel passaggio 3.2.3 e raccogliere le immagini utilizzando un microscopio ottico.
  5. Analisi quantitativa del saggio di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR)
    1. Prendi ~100 mg di tessuto renale congelato in una provetta omogeneizzatore da 10 ml, macinalo accuratamente con un pestello fino a quando non c'è più massa tissutale evidente, quindi aggiungi 1 ml di reagente per l'estrazione dell'RNA per l'omogeneizzazione.
    2. Aggiungere 250 μl di cloroformio, agitare in un miscelatore a vortice per 10 s, incubare con ghiaccio per 5 min, centrifugare a 15,984 × g per 10 min a 4 °C e pipettare la fase acquosa superiore in una nuova provetta.
    3. Aggiungere 500 μl di isopropanolo alla fase acquosa, mescolare accuratamente con un miscelatore a vortice per 10 s e incubare la miscela con ghiaccio per 5 minuti. Successivamente, centrifugare a 15.984 × g per 10 min. Rimuovere con cautela il surnatante e lavare il pellet di RNA con 1 ml di etanolo al 75%. Dopo un breve vortice, centrifugare nuovamente a 15.984 × g per 10 min. Scartare l'etanolo e lasciare asciugare il pellet di RNA all'aria a temperatura ambiente.
    4. Aggiungere 30 μL di acqua di dietil pirocarbonato per sciogliere l'RNA e misurare l'assorbanza della soluzione di RNA a 260 nm e 280 nm utilizzando uno spettrofotometro per calcolare la concentrazione di RNA.
      NOTA: La purezza dell'RNA è valutata dal rapporto A260/A280 . Un rapporto ideale A260/A280 dovrebbe essere compreso tra 1,8 e 2,0, indicando una buona purezza dell'RNA. Se il rapporto è inferiore a 1,8, può suggerire la presenza di contaminazione da proteine o fenoli ed è necessaria un'ulteriore purificazione, come l'esecuzione di un'ulteriore estrazione fenolo-cloroformio o la precipitazione dell'etanolo per rimuovere i contaminanti.
    5. Miscelare 3 μg di RNA totale, 4 μL di 4 gDNA Wiper Mix e ddH2O privo di RNasi fino a un volume finale di 16 μL, centrifugare a 1.250 × g per 10 s e incubare a 42 °C per 2 min. Aggiungere 4 μl di trascrittasi inversa 5x a 16 μl della soluzione di cui sopra, centrifugare a 1.250 × g per 10 s. Eseguire il programma di trascrizione inversa a 50 °C (15 min) → 85 °C (5 s) → 4 °C (10 min). Conservare il cDNA sintetizzato a -20 °C.
    6. Estrarre la soluzione di cDNA dal congelatore ed eseguire la pre-denaturazione a 90 °C (10 min), seguita da 40 cicli di 94 °C (30 s) → 60 °C (30 s) → 72 °C (24 s), e infine lisare nell'ordine di 95 °C (15 s) → 60 °C (60 s) → 95 °C (350 s, 60 °C aumentare gradualmente a 95 °C a una velocità di 0,1 °C/s).
    7. Calcolare l'espressione relativa di WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB e IL-1β utilizzando il metodo 2-ΔΔCt basato sul valore Ct di ciascun campione con Gapdh come riferimento interno (ΔΔCt = valore Ct del gene bersaglio - valore Ct del gene di riferimento interno) (vedi Tabella 2).
  6. Analisi del saggio Western blot (WB)
    1. Prendi ~100 mg di tessuto renale congelato in una provetta omogeneizzatore da 10 ml, seguita da 500 μl di soluzione di lisi (inibitore della proteasi: inibitore della fosfatasi: RIPA= 1:1:100) e macinalo con un pestello a sufficienza fino a quando non c'è più massa tissutale evidente.
    2. Incubare la provetta con ghiaccio per 30 minuti, centrifugare a 15.984 × g per 10 minuti e aspirare il surnatante.
    3. Determinare la concentrazione proteica di ciascun campione utilizzando il test BCA. Sulla base delle concentrazioni misurate, pipettare quantità uguali di proteine totali (ad es. 30 μg) da ciascun gruppo in nuove provette e regolare il volume finale utilizzando PBS per garantire la coerenza. Quindi, aggiungi 5 tamponi per il caricamento delle proteine, fai bollire a 100 °C per 10 minuti, quindi rimuovi e raffredda a temperatura ambiente.
    4. Utilizzare l'elettroforesi su gel SDS-PAGE al 12,5% per separare le proteine. Innanzitutto, utilizzare 80 V per far passare lentamente il campione attraverso il gel di concentrazione, quindi regolare la tensione a 120 V fino a quando il campione non scorre sul fondo del gel di separazione e spegnere l'unità.
    5. Immergere la carta da filtro nel tampone di trasferimento della membrana, utilizzare una pinzetta per tenere un angolo della membrana PVDF e immergerla nel metanolo per attivarla. Rimuovere il gel, utilizzare una piastra di plastica per tagliare il gel concentrato e il fondo del gel di separazione, quindi, in base alla struttura a sandwich della carta da filtro/gel/membrana PVDF/carta da filtro per impostare il dispositivo di trasferimento della membrana (gel come polo negativo, membrana PVDF come polo positivo), posizionare la configurazione in un serbatoio di trasferimento a membrana riempito con tampone di trasferimento preraffreddato, circondarlo con cubetti di ghiaccio per mantenere una bassa temperatura, ed eseguire il trasferimento ad una corrente costante di 200 mA.
      NOTA: Decidi il tempo di trasferimento in base al peso molecolare della proteina (maggiore è il peso molecolare, maggiore è il tempo di trasferimento).
    6. Posizionare la membrana in PVDF nel tampone bloccante, agitare il tampone bloccante per 90 minuti a temperatura ambiente e lavare con TBST (50 mL di 20x TBS e 0,5 mL di Tween-20 per L di TBST) per 3 x 5 min.
    7. Utilizzando il diluente dell'anticorpo primario diluire l'anticorpo primario: WT-1 (1:1.000), CD2AP (1:1.000), P-PI3K (1:1.000), P-AKT (1:1.000), P-NF-κB (1:1.000) e IL-1β (1:1.000), aggiungere l'anticorpo primario sulla membrana in PVDF e incubare in una scatola umida in un frigorifero a 4 °C per una notte (vedi Tabella dei materiali).
    8. Togliere la membrana in PVDF dal frigorifero a 4 °C, lavare con TBST per 3 x 5 minuti, con il diluente per anticorpi secondari diluire l'anticorpo secondario (1:10000), aggiungere l'incubazione dell'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 60 minuti, lavare con TBST per 3 x 5 minuti, posizionare la membrana in PVDF nella termocamera a chemiluminescenza e aggiungere uniformemente il liquido luminescente ECL goccia per goccia (A: B = 1:1).

4. Analisi farmacologica di rete della YHT per il trattamento della DKD

  1. Screening dei principi attivi e dei target di YHT
    1. Determinare i principi attivi di Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Poria e Schisandra Chinensis utilizzando il database TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) e di Maitake dal database BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm). Impostare la biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e la somiglianza al farmaco (DL) ≥ 0,18 come criteri di screening per identificare i principi attivi.
    2. Effettuare ricerche nel database TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) per individuare gli obiettivi d'azione dei principi attivi dei suddetti MTC.
    3. De-enfatizzare gli obiettivi dei principi attivi di cui sopra e integrarli in un elenco per ulteriori analisi. Standardizzare i nomi dei bersagli utilizzando il database delle proteine Uniprot (https://www.uniprot.org).
  2. Costruzione della rete target dei principi attivi di YHT
    1. Importa i principi attivi e i relativi target nell'oftware: Costruisci la rete "principio attivo-target" selezionando File | Importazione | Rete e caricamento dei dati rilevanti.
    2. Eseguire l'analisi della topologia di rete accedendo a Strumenti | Analisi di rete | Analizza la rete per visualizzare le relazioni tra farmaci, principi attivi, bersagli e malattie. Nella visualizzazione di rete, i nodi rappresentano i principi attivi e gli spigoli rappresentano le interazioni tra i principi attivi e i target.
  3. Screening dei target correlati alla DKD
    1. Utilizzando la malattia renale diabetica come termine di ricerca e impostando la specie come umana, selezionare i bersagli correlati alla DKD dai seguenti database: database GeneCards (https://www.genecards.org); banca dati OMIM (http://www.omim.org); banca dati TTD (https://www.ttd.cn); Banca dati DrugBank (http://www.drugbank.ca); Database DisGeNET (http://www.disgenet.org).
    2. Dopo aver ottenuto i risultati dai cinque database, unirli in un foglio di calcolo e rimuovere i duplicati utilizzando la funzione Rimuovi duplicati nel menu Dati , assicurandosi che vengano conservati solo i nomi univoci delle destinazioni relative a DKD.
  4. Costruzione di PPI (interazione proteina-proteina) e screening di bersagli core
    1. Utilizza il software per fogli di calcolo per identificare gli obiettivi di intersezione di YHT e DKD inserendo l'elenco degli obiettivi YHT in una colonna e l'elenco degli obiettivi DKD in un'altra. Applicare la formattazione condizionale per evidenziare le voci comuni in entrambe le colonne, identificando così le destinazioni di intersezione.
    2. Apri il sito Web del database delle stringhe (https://cn.string-db.org/), seleziona Input | Incolla/Carica per importare in batch i dati e impostare la soglia Grado ≥ 1 per filtrare i target liberi (target senza interazioni) nella rete.
    3. Seleziona File | Importazione | Collegare in rete e importare i target di intersezione filtrati nel software per creare la visualizzazione finale.
    4. Passare ad Analisi di rete | Analizza la rete e filtra gli obiettivi principali di YHT-DKD in base al valore del grado.
  5. Analisi funzionale dell'ontologia genica (GO) e analisi dell'arricchimento del percorso dell'enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto (KEGG)
    1. Apri la piattaforma Metascape visitando http://metascape.org/gp/index.html, seleziona Avvia analisi per iniziare, incolla l'elenco dei target per YHT e DKD nella casella di input nella sezione Analisi personalizzata , imposta la specie su Homo sapiens dal menu a discesa, scegli Analisi personalizzata e imposta la soglia del valore P su <0,01 e fai clic su Invia per eseguire l'analisi.
    2. Dopo che i risultati sono stati restituiti da Metascape, vai su http://www.bioinformatics.com.cn/, seleziona Strumenti | termine GO di arricchimento, incolla i termini GO dai risultati e fai clic su Invia per generare grafici a bolle. Visualizza i primi 10 termini GO ordinandoli in base al valore P.
    3. Ordina i percorsi KEGG in base al valore P dai risultati dell'analisi Metascape. Vai allo stesso sito Web di microbiologia (http://www.bioinformatics.com.cn/), seleziona l'arricchimento del percorso go kegg, incolla i primi 10 percorsi KEGG selezionati e fai clic su Invia per visualizzare i diagrammi a bolle KEGG.

5. Analisi statistica

  1. Se i dati seguono una distribuzione normale e le varianze sono omogenee, utilizzare l'ANOVA unidirezionale. Se le varianze non sono omogenee, utilizzare il test T3 di Dunnett o un test t campione indipendente.
  2. Per i dati che non seguono una distribuzione normale, utilizzare il test della somma dei ranghi da metodi non parametrici.
  3. Considera P < 0,05 statisticamente significativo.

Risultati

Miglioramento della glicemia, della funzionalità epatica e renale e dei disturbi del metabolismo lipidico nei topi DKD
Dopo 8 settimane di somministrazione, dosi diverse di YHT hanno ridotto significativamente i livelli di glucosio nel sangue casuale, UTP, Scr e BUN nelle 24 ore, migliorando la funzionalità renale (Figura 1A-D); aumento del livello di ALB; ridotto i livelli di ALT e AST; miglioramento della funzionalità epatica (Figura 1E-G); ridotto i livelli di TC e TG; e ha migliorato la regolazione del metabolismo lipidico (Figura 1H, I). I risultati di cui sopra hanno indicato che YHT ha effetti protettivi sulla glicemia, sulla funzionalità epatica e renale e sulla regolazione dei lipidi.

Miglioramento del danno istopatologico renale nei topi DKD
Per verificare se la YHT potesse migliorare il danno renale nei topi DKD, l'entità del danno patologico nei tessuti renali è stata esaminata utilizzando la colorazione H&E, PAS e Masson, nonché l'IHC. La colorazione H&E e PAS ha rivelato atrofia glomerulare, allargamento della regione della tunica albuginea, rigonfiamento e distacco delle cellule epiteliali tubulari, infiltrazione di cellule infiammatorie interstiziali e evidente deposizione di glicogeno glomerulare nel gruppo MOD (Figura 2A, B). La colorazione di Masson ha mostrato un aumento significativo delle fibre di collagene blu nei reni del gruppo MOD rispetto al gruppo CON (Figura 2C, D). IHC ha mostrato che le percentuali di aree positive per COI-I e α-SMA erano significativamente più alte nel gruppo MOD rispetto al gruppo CON (Figura 2E-G). Al contrario, dopo l'uso di YHT e POS, l'atrofia glomerulare, l'allargamento della zona legata, il rigonfiamento e lo spargimento delle cellule epiteliali tubulari, il grado di infiltrazione di cellule infiammatorie interstiziali e la deposizione di glicogeno glomerulare sono stati significativamente alleviati; l'area delle fibre di collagene blu era significativamente ridotta; e le percentuali di aree positive per COI-I e α-SMA sono diminuite significativamente. I risultati di cui sopra hanno indicato che YHT potrebbe attenuare il danno patologico renale e la fibrosi renale nei topi DKD.

Attenuazione del danno da podociti nei topi DKD
Il danno alle cellule del piede nei topi DKD è stato osservato mediante IHC, PCR e WB. I risultati dell'IHC hanno mostrato che i livelli di espressione delle proteine marcatrici funzionali delle cellule del piede, CD2AP e WT-1, erano significativamente diminuiti nel gruppo MOD rispetto al gruppo CON, indicando che le cellule renali del piede erano danneggiate. Il trattamento con YHT ha aumentato i livelli di espressione di CD2AP e WT-1 e ha ridotto il danno alle cellule del piede (Figura 3A-C). I risultati della PCR e della WB hanno mostrato che i livelli relativi di mRNA e di espressione proteica delle proteine marcatrici funzionali delle cellule del piede, CD2AP e WT-1, erano significativamente diminuiti nel gruppo MOD rispetto al gruppo CON, e i livelli relativi di mRNA e di espressione proteica di CD2AP e WT-1 erano significativamente aumentati dopo il trattamento con YHT (Figura 3D-H). I risultati di cui sopra hanno indicato che YHT potrebbe attenuare il danno da podociti nei topi DKD.

Chiarimento dei potenziali bersagli e delle vie di segnalazione legate agli effetti della YHT sulla DKD tramite farmacologia di rete
I principi attivi di YHT (291) sono stati esaminati attraverso i database TCMSP e BATMAN-TCM, di cui 39 principi attivi soddisfacevano i criteri di OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18. I principi attivi sono stati ricercati nel database per identificare i loro bersagli e, dopo aver unito ed eliminato i valori duplicati, sono stati ottenuti un totale di 303 bersagli (Figura 4A). Dopo aver unito i risultati di cinque database, tra cui GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank e DisGeNET, e aver rimosso i valori duplicati, sono stati finalmente ottenuti 1.867 target relativi alla DKD. Successivamente, http://www.bioinformatics.com.cn/ è stato utilizzato per intersecare i principi attivi YHT sottoposti a screening con i target DKD, ottenendo 84 target intersecanti (Figura 4B). Questi 84 bersagli sono stati importati nel software Cytoscape per disegnare un diagramma di rete PPI e sono stati identificati potenziali bersagli chiave per il trattamento YHT della DKD, tra cui AKT, IL-1 β, CASP3, APOE e JUN (Figura 4C). L'analisi dell'arricchimento funzionale GO ha prodotto un totale di 1.246 item, indicando che YHT può esercitare effetti terapeutici sulla DKD regolando processi biologici come la risposta agli ormoni e le funzioni molecolari tra cui l'attività di omodimerizzazione delle proteine e l'attività dell'ossidoreduttasi, nonché componenti cellulari come zattere di membrana e microdomini di membrana (Figura 4D). Sono stati ottenuti un totale di 263 risultati di arricchimento KEGG, che coinvolgono principalmente la via di segnalazione AGE-RAGE nei complessi diabetici, la malattia epatica alcolica, la via lipidica e l'aterosclerosi. Sulla base del valore P, i primi 10 risultati sono stati selezionati per disegnare un grafico a bolle di visualizzazione KEGG (Figura 4E). La via di segnalazione AGE-RAGE è altamente arricchita nei complessi diabetici e diversi bersagli principali nel PPI, come PI3K, AKT e IL-1β, sono arricchiti in questa via. Pertanto, questa via di segnalazione è stata selezionata per la successiva convalida.

Attenuazione del danno dei podociti inibendo la via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB
I livelli di espressione di geni e proteine correlati alla via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB sono stati ulteriormente esaminati mediante PCR e WB. I risultati della PCR hanno mostrato che i livelli relativi di espressione dell'mRNA di Pi3k, Akt, Nf-κb e Il-1β nel gruppo MOD erano significativamente elevati rispetto al gruppo CON e diminuiti significativamente dopo la somministrazione di YHT (Figura 5A-D). I risultati della WB hanno mostrato che anche i livelli proteici relativi di P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB e IL-1β erano significativamente elevati nel gruppo MOD rispetto al gruppo CON, mentre erano significativamente diminuiti dopo la somministrazione di YHT (Figura 5E-I). Questi risultati hanno inoltre suggerito che YHT potrebbe inibire la via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB attenuando il danno da podociti nei topi DKD.

figure-results-1
Figura 1: Miglioramento della glicemia, delle funzioni epatiche e renali e dei disturbi del metabolismo lipidico nei topi DKD. Effetti di YHT su (A) glicemia casuale; (B-D) funzionalità renale, comprese proteine urinarie 24 ore su 24, creatinina ematica e azoto ureico; (E-G) funzionalità epatica, compresa l'albumina sierica, l'alanina aminotransferasi e l'aspartato aminotransferasi; e la regolazione del metabolismo lipidico (H,I), inclusi colesterolo totale e trigliceridi. I dati sono espressi come medie ± deviazioni standard di sei campioni indipendenti, confrontati con il gruppo bianco, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, e confrontati con il gruppo modello, #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, queste notazioni statistiche sono utilizzate in modo coerente in tutte le figure. Abbreviazioni: YHT = yinhuo Tang; DKD = malattia renale diabetica; ALB = albumina; ALT = alanina aminotransferasi; AST = aspartato aminotransferasi; TC = colesterolo totale; TG = trigliceridi; CON = gruppo di controllo; MOD = gruppo di modelli; POS = valsartan Gruppo di controllo positivo; YH-L = gruppo a basso dosaggio della YHT; YH-M = gruppo a dose media dell'YHT; YH-H = gruppo ad alto dosaggio della YHT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Miglioramento del danno istopatologico dei reni nei topi DKD. (A,B) Istologia renale mediante colorazione H&E e PAS (barra della scala = 20 μm); (C) colorazione di Masson per osservare il grado di fibrosi renale e (D) analisi semiquantitativa utilizzando il software ImageJ; (E-G) Analisi semiquantitativa dei livelli relativi di espressione di COI-I e α-SMA nei tessuti renali utilizzando i software IHC e ImageJ (barra della scala = 20 μm). Abbreviazioni: YHT = yinhuo Tang; DKD = malattia renale diabetica; H&E = colorazione con ematossilina ed eosina; PAS = Colorazione periodica acido-Schiff; COI-I = Collagene di tipo I; α-SMA = actina muscolare α-liscia; CON = gruppo di controllo; MOD = gruppo di modelli; POS = valsartan Gruppo di controllo positivo; YH-L = gruppo a basso dosaggio della YHT; YH-M = gruppo a dose media dell'YHT; YH-H = gruppo ad alto dosaggio della YHT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Attenuazione del danno da podociti nei topi DCD. (A-C) L'IHC ha rilevato i livelli di espressione relativi di CD2AP e WT-1 nei tessuti renali (barra della scala = 20 μm); (D,E) La PCR ha rilevato l'espressione relativa dell'mRNA di CD2AP e WT-1 nei tessuti renali e l'analisi semiquantitativa è stata eseguita utilizzando il software Image J; (F-H) WB ha rilevato i livelli relativi di espressione proteica di CD2AP e WT-1 nei tessuti renali e l'analisi semiquantitativa è stata eseguita utilizzando il software ImageJ. analisi quantitativa con il software Image J. Abbreviazioni: YHT = yinhuo Tang; DKD = malattia renale diabetica; IHC = immunoistochimica; WB = Western blotting; CD2AP = proteina associata a CD2; WT-1 = Tumore di Wilms 1; CON = gruppo di controllo; MOD = gruppo di modelli; POS = valsartan Gruppo di controllo positivo; YH-L = gruppo a basso dosaggio della YHT; YH-M = gruppo a dose media dell'YHT; YH-H = gruppo ad alto dosaggio della YHT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Analisi farmacologica di rete della YHT per il trattamento della DKD. (A) Grafico del principio attivo-bersaglio della malattia per il trattamento della DKD. (B) Diagramma di Venn dei bersagli intersecanti di YHT e DKD. Il colore arancione rappresenta il numero di target rilevanti per la DKD; il colore verde rappresenta il numero di bersagli terapeutici dei principi attivi YHT; e la parte intersecante rappresenta il numero di bersagli intersecanti (il numero di bersagli di YHT per DKD). (C) Diagramma di rete PPI dei bersagli intersecanti di YHT e DKD. (D) Analisi dell'arricchimento con OB dei 10 bersagli più importanti della YHT per il trattamento della DKD. (E) Analisi dell'arricchimento KEGG dei 10 bersagli più importanti per il trattamento YHT della DKD. Abbreviazioni: YHT = yinhuo Tang; DKD = malattia renale diabetica; PPI = Interazione proteina-proteina; GO = Ontologia genetica; KEGG = Enciclopedia di Kyoto dei geni e dei genomi; CON = gruppo di controllo; MOD = gruppo di modelli; POS = valsartan Gruppo di controllo positivo; YH-L = gruppo a basso dosaggio della YHT; YH-M = gruppo a dose media dell'YHT; YH-H = gruppo ad alto dosaggio della YHT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Attenuazione del danno dei podociti inibendo la via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB. (A-D) PCR per rilevare l'espressione relativa dell'mRNA di Pi3k, Akt, Nf-κb e Il-1β nei tessuti renali. (E-I) WB per rilevare i livelli relativi di espressione proteica di P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB e IL-1β nei tessuti renali e l'analisi semiquantitativa è stata eseguita utilizzando il software ImageJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione dello Yinhuo Tang. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Dettagli dei primer qRT-PCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Uno dei passaggi critici di questo protocollo è l'uso della farmacologia di rete per identificare i componenti attivi di YHT e prevedere le loro interazioni con bersagli correlati alla DKD. Questa fase prevede l'analisi di dati biologici su larga scala utilizzando strumenti bioinformatici come database (ad esempio, TCMSP, DrugBank e GeneCards) per mappare i percorsi molecolari e le potenziali reti biologiche interessate da YHT. Questa previsione è stata seguita da una validazione sperimentale attraverso modelli animali di DKD, dove sono stati testati gli effetti ipotizzati di YHT su questi percorsi. L'integrazione delle previsioni computazionali con i dati è un aspetto cruciale del nostro approccio, in quanto migliora l'affidabilità dei nostri risultati e colma il divario tra le previsioni teoriche e i risultati pratici. Inoltre, l'uso di modelli animali è un altro passo fondamentale per convalidare gli effetti terapeutici dell'YHT. La DKD negli animali imita da vicino la progressione della malattia umana, consentendo una valutazione efficace dell'impatto della YHT sia sul danno glomerulare che sulla fibrosi renale. Il monitoraggio meticoloso dei marcatori di funzionalità renale come Scr, BUN e proteinuria, insieme alle valutazioni istopatologiche, è essenziale per valutare l'efficacia terapeutica di YHT.

Sebbene il nostro protocollo combini potenti metodi computazionali e sperimentali, ci sono diverse limitazioni. In primo luogo, l'approccio della farmacologia di rete si basa in larga misura sui dati disponibili nei database pubblici e potrebbero esserci distorsioni o informazioni mancanti riguardo a determinati componenti delle vie correlate a YHT o DKD. Anche se abbiamo incrociato più database per mitigare questo problema, alcune interazioni rilevanti potrebbero ancora essere trascurate. In secondo luogo, questo studio ha esplorato solo il meccanismo di YHT nel ridurre il danno ai podociti a livello animale da esperimento, e sono necessari esperimenti cellulari e studi clinici su grandi campioni per convalidare i risultati sperimentali. Infine, la farmacologia di rete ha dimostrato che il trattamento della DKD con YHT era anche associato alla malattia epatica alcolica, al metabolismo lipidico e all'aterosclerosi e alla regolazione della lipolisi negli adipociti. Questo studio ha solo verificato se la modulazione della via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB da parte di YHT potesse ritardare la progressione della DKD; I risultati necessitano di ulteriori approfondimenti.

La via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB è un'importante via di segnalazione intracellulare coinvolta nella regolazione di una varietà di processi biologici come la crescita cellulare, la proliferazione, la sopravvivenza e le risposte infiammatorie22. Gli studi hanno dimostrato che svolge un ruolo importante nella progressione del danno dei pedicolociti23,24. NF-κB è un importante componente a valle della via PI3K/Akt e partecipa alla trasmissione di una varietà di segnali intracellulari e all'espressione di più geni. L'inibizione della via di segnalazione PI3K/AKT porta alla degradazione della proteina inibitoria di NF-κB IκB, che a sua volta porta alla fosforilazione di NF-κB e al suo ingresso nel nucleo, e alla produzione di una varietà di chemochine e fattori infiammatori, portando al danno dei podociti e alla fibrosi interstiziale renale25. Alcuni studi hanno dimostrato che l'inibizione dell'attivazione della via di segnalazione PI3K/AKT/NF-κB può sopprimere efficacemente le risposte infiammatorie e la fibrosi renale, ritardando così la progressione della DKD26.

Gli studi hanno dimostrato che i disturbi del metabolismo lipidico svolgono un ruolo significativo nell'insorgenza e nella progressione della DKD27,28. I pazienti con DKD mostrano spesso un metabolismo lipidico anormale, inclusi livelli elevati di LDL, TG e accumulo di acidi grassi. Queste anomalie sono strettamente correlate a cambiamenti patologici come la glomerulosclerosi e la fibrosi tubulointerstiziale29,30. La ricerca indica che i disturbi del metabolismo lipidico possono promuovere la progressione della DKD attraverso molteplici vie di segnalazione31,32. In primo luogo, la via di segnalazione mTOR è una via chiave nella regolazione del metabolismo dei lipidi; La sua iperattivazione porta a lesioni podocitarie e proteinuria33,34. Un ambiente ricco di grassi può promuovere l'accumulo di lipidi attraverso l'asse PI3K/AKT/mTOR, inducendo l'apoptosi dei podociti e, infine, esacerbando il deterioramento della funzione renale 35,36,37. In secondo luogo, la proteina chinasi attivata dall'AMP (AMPK), un regolatore critico del metabolismo energetico cellulare, protegge il rene dai disturbi metabolici promuovendo l'ossidazione degli acidi grassi, inibendo la sintesi lipidica e riducendo la lipotossicità 38,39,40. L'inattivazione dell'AMPK è considerata un meccanismo importante nella progressione della DKD. Gli attivatori dell'AMPK, come la metformina, hanno mostrato significativi effetti renoprotettivi e rappresentano un promettente bersaglio terapeutico per la DKD41.

Infine, gli studi hanno dimostrato che i recettori attivati dal proliferatore dei perossisomi α/γ (PPARα/γ) svolgono un ruolo essenziale nella regolazione del metabolismo lipidico e della DKD42,43. L'attivazione di PPARα promuove l'ossidazione degli acidi grassi e riduce l'accumulo di lipidi nel rene, mentre PPARγ migliora la sensibilità all'insulina ed esercita effetti antinfiammatori44,45. Gli agonisti PPAR, come i fibrati, hanno mostrato potenziali benefici clinici nel ridurre la proteinuria nei pazienti con DKD46. In conclusione, i disturbi del metabolismo lipidico influenzano la progressione patologica della DKD attraverso molteplici vie di segnalazione. Le interazioni tra queste vie formano una complessa rete patologica. Prendere di mira il metabolismo lipidico potrebbe fornire nuove strategie terapeutiche per la DKD.

La famiglia delle caspasi (CASP), una famiglia di proteasi specifiche della cisteina, è un gruppo di proteasi che si trovano ampiamente nelle cellule e sono principalmente coinvolte nella regolazione dell'apoptosi e delle risposte infiammatorie47,48. I membri della famiglia CASP condividono somiglianze strutturali e di solito esistono come zimogeni, che vengono attivati attraverso una cascata di reazioni, innescando così l'apoptosi, la piroptosi e altri processi di morte cellulare programmati49. Tra questi, CASP3, un membro della famiglia delle caspasi (CASP) con una struttura conservata tipicamente presente come zimogeno, è una proteasi chiave nella fase di esecuzione dell'apoptosi che catalizza la scissione di specifiche proteine cellulari, svolgendo così un ruolo critico nella regolazione della normale crescita cellulare e nel mantenimento dell'omeostasi interna 50,51. La caspasi-8 agisce come iniziatore delle cascate apoptotiche e partecipa alla modulazione delle risposte infiammatorie attraverso l'attivazione di NPK, che è un fattore chiave nella regolazione della crescita cellulare. La caspasi-8 agisce come iniziatore della cascata apoptotica e partecipa anche alla regolazione della risposta infiammatoria attivando vescicole infiammatorie come NLRP1 e NLRP3, innescando così la piroptosi cellulare52. Sulla base dell'importante ruolo della via di segnalazione CASP nel mediare l'apoptosi e la piroptosi nelle cellule peduncolate, sono necessarie ulteriori esplorazioni approfondite sulla relazione tra YHT, CASP3/8, cellule peduncolate e DKD in futuro.

Rispetto agli approcci convenzionali di scoperta di farmaci che in genere enfatizzano meccanismi a bersaglio singolo ben definiti per la chiarezza e la prevedibilità normativa, la nostra strategia basata sulla farmacologia di rete consente un'esplorazione sistematica delle interazioni multi-target inerenti alle formulazioni TCM come YHT. Se da un lato questa complessità riflette la natura olistica della MTC e la sua potenziale portata terapeutica, dall'altro sottolinea anche la sfida degli effetti non intenzionali fuori bersaglio, che richiedono un'attenta convalida e interpretazione. Considerando la natura multi-target e multi-pathway dell'azione di YHT, forniamo una comprensione più olistica dei suoi effetti terapeutici nel trattamento della DKD. Inoltre, la farmacologia di rete consente la previsione di potenziali interazioni farmacologiche ed effetti collaterali, che è fondamentale per garantire la sicurezza e l'efficacia delle terapie multicomponente. Gli attuali trattamenti per la DKD si concentrano in gran parte sulla gestione dei sintomi o sul rallentamento della progressione, piuttosto che sull'affrontare i meccanismi sottostanti della malattia. Integrando i moderni strumenti bioinformatici con la convalida sperimentale, questo studio sottolinea l'importanza della biologia dei sistemi nel migliorare l'efficacia della MTC, in particolare nelle malattie croniche come la DKD.

Guardando al futuro, questa tecnica è molto promettente per espandere l'ambito della farmacologia di rete nella ricerca sulla MTC, in particolare nel trattamento di malattie complesse come la DKD. Il nostro approccio potrebbe essere applicato per esplorare altre formule di MTC o singole erbe per il loro potenziale terapeutico nel trattamento di malattie renali, malattie cardiovascolari e disturbi metabolici. Inoltre, questa metodologia potrebbe essere estesa per studiare il riposizionamento dei farmaci identificando nuovi usi per i farmaci esistenti nel trattamento della DKD. Un'altra potenziale applicazione del nostro approccio risiede nella medicina personalizzata. Incorporando dati specifici del paziente, la farmacologia di rete potrebbe essere utilizzata per personalizzare le strategie di trattamento della MTC in base ai profili molecolari individuali, migliorando l'efficacia del trattamento e riducendo al minimo gli effetti avversi.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione provinciale per le scienze naturali di Jilin (n. 20210101201JC).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etanolo anidroNational Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Animal Experiment CenterChangchun University of Traditional Chinese MedicineSYXK (JI) 2023-0014
Database BATMAN-TCMhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm--
Kit di analisi delle proteine BCASolarbioPC0020
Tampone di bloccoBeyotimeP0023B
Pentole in ceramicaMideaMD-DG30E103
Sistema di imaging a chemiluminescenzaHangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
CloroformioCina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10006818
Cytoscape 3.8.0 software----
Kit di reagenti DABServicebioG1212-200T
topi db/dbNanjing Junke Biological limited companySCXK (Su) 2020-009
ECL substrato soluzioneaffinitàKF8003
Pentola elettrica per bagnomaria a temperatura costanteFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
Alimentatore per strumento di elettroforesiPechino Longfang Technology Co., LtdLF-600S
Omogeneizzatore di vetroSolarbioYA0852
Vetrino Nantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
Capra Anti-Coniglio IgG HRP (anticorpo secondario)AffinitàS00011:3000 per IHC, 1:10000 per WB
EmatossilinaWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
Centrifuga refrigerata ad alta velocità Hunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix per qPCR (+gDNA wiper)VAZYMER223-01
Agitatore orizzontaleJiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
Sistema di imagingNikonNikon DS-U3
Agitatore di riscaldamento magnetico digitale intelligenteHangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E +
IsopropanoloCina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd80109218
marcatore (20-120KD)GenScriptM00521
Kit di colorazione MassonBASOBA4079B
Garza medicaJianerkang Medical--
Metascape piattaformahttp://metascape.org/gp/index.html--
MethanolThermo67-56-1
Microbiology websitehttp://www.bioinformatics.com.cn/--
microscopioNikonECLIPSE Ci
forno a microondeGalanz Forno a microonde Electrical Appliance Co., LtdP70D20TL-P4
Macinatore di tessuti multicampioneShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-24L
Bilancia elettronica analitica multifunzionaleChangzhou Lucky Electronic Equipment Game CompanyFA1204
Resina neutraWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
Siero di capra normaleSolarbioSL038
fornoShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
Centrifuga palmareWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
Kit di colorazione PASBASOBA4114B
Affettatrice patologicaShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
Strumento PCRHangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
Pistola per pipetteDragonKE0003087/KA0056573
Tampone di diluizione dell'anticorpo primarioBeyotimeP0023A
Complesso inibitore della proteina fosfatasiMeilunbioMB12707-1
Membrana PVDF (0,22 μ m)SolarbioISEQ00010
Diluente rapido per anticorpi primari/secondariSolarbioA1811
Coniglio anti-CD2APAffinitàDF22981:200 per IHC, 1:1000 per WB
Coniglio anti-COI-IAffinitàDF121491:200 per IHC, 1:1000 per WB
Coniglio anti-IL-1βAffinitàAF51031:1000 per WB
Coniglio anti-P-AKTAffinitàAF00161:1000 per WB
Coniglio anti-P-NF-Κ bAffinitàAF32191:1000 per WB
Coniglio anti-P-PI3KAffinitàAF32421:1000 per WB
Coniglio anti-WT-1AffinitàDF63311:200 per IHC, 1:1000 per WB
Coniglio anti-&alfa;-SMAAffinitàAF10321:200 per IHC, 1:1000 per WB
Coniglio anti-β-Affinità di actinaAF70181:1000 per WB
Sistema di PCR in tempo realeABIQuantStudio 6
RIPA Lisi TamponeMeilunbioMA0151
ddH2O senza RNasiSolarbioR1600
Anticorpo secondario Diluizione TamponeBeyotimeP0023D
Vetrino e vetro di coperturaJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
SPSS 26.0 software----
Sito web del database delle stringhe  https://cn.string-db.org/--
Strumento per acqua super puraZhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus DNA PolimerasiTIANGENET105-02
TCMSP database https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php--
Smerigliatrice per tessutiBella pareteMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd30189328
Spettrofotometro visibile UV ultra microHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
Database di proteine Uniprothttps://www.uniprot.org--
Microscopio ottico verticaleKit perNikon Nikon Eclipse CI
Nanjing Jiancheng Bioengineering Research InstituteC035-2
liofilizzatore sottovuotoNingbo Xinzhi Biotechnology Co.A01-1-NA0959
Serbatoio per elettroforesi verticalePechino 61 Fabbrica di strumentiDYCZ-24DN
Miscelatore a vorticeWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdMX-F
Western Blocking BufferSolarbioSW3010
xileneCina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10023418
YihongFornitore verificato - Wuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdE8090
China il test delle proteine urinarie

Riferimenti

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