Utilizzo delle librerie di visione artificiale per semplificare la quantificazione dei nuclei

Summary

Questo articolo descrive i metodi passo dopo passo per automatizzare la quantificazione dei nuclei basata su immagini utilizzando un programma eseguibile open source convalidato in una gamma di densità cellulari. Questo programma fornisce un'alternativa che affronta le barriere relative ai costi, all'accessibilità per gli utenti con competenze tecnologiche limitate e alla convalida specifica dell'applicazione che può limitare l'utilità delle tecnologie esistenti.

Abstract

I saggi su cellule vive e le analisi cellulari basate su immagini richiedono la normalizzazione dei dati per un'interpretazione accurata. Un metodo comunemente usato consiste nel colorare e quantificare i nuclei, seguito dalla normalizzazione dei dati per il conteggio dei nuclei. Questo conteggio dei nuclei è spesso espresso come conteggio delle cellule per le cellule uninucleate. Sebbene la quantificazione manuale possa essere laboriosa e dispendiosa in termini di tempo, i metodi automatizzati disponibili potrebbero non essere preferiti da tutti gli utenti, potrebbero non essere convalidati per questa specifica applicazione o potrebbero essere proibitivi in termini di costi. Qui, forniamo istruzioni dettagliate per acquisire immagini quantificabili di nuclei colorati con colorazioni di DNA fluorescenti e successivamente quantificare i nuclei utilizzando un programma software di conteggio automatico degli oggetti sviluppato utilizzando librerie di visione artificiale Python. Convalidiamo anche questo programma in una gamma di densità cellulari. Sebbene il tempo esatto per l'esecuzione del programma vari in base al numero di immagini e all'hardware del computer, questo programma consolida le ore di lavoro contando i nuclei in secondi per l'esecuzione del programma. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato utilizzando immagini di cellule fissate e colorate, anche le immagini di nuclei colorati in cellule vive e le applicazioni di immunofluorescenza possono essere quantificate utilizzando questo programma. In definitiva, questo programma fornisce un'opzione che non richiede un alto grado di competenza tecnologica ed è un'alternativa convalidata e open source per aiutare i biologi cellulari e molecolari a semplificare i loro flussi di lavoro, automatizzando il compito noioso e dispendioso in termini di tempo della quantificazione dei nuclei.

Introduction

Gli esperimenti funzionali e basati su immagini sono fondamentali per comprendere l'impatto dei trattamenti sperimentali sulla biochimica e sulla fisiologia dell'intera cellula. Una valida interpretazione dei dati provenienti da esperimenti di biologia cellulare dipende dall'accuratezza e dalla riproducibilità del protocollo sperimentale, compresa la normalizzazione dei dati. Ad esempio, le analisi del consumo di ossigeno e dei tassi di acidificazione extracellulare in cellule vive al basale e dopo il trattamento con farmaci specifici consentono di valutare vari aspetti del metabolismo energetico ^1,2....

Protocol

NOTA: i file supplementari sono disponibili al seguente link https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Acquisizione e salvataggio di immagini mediante microscopia a fluorescenza

1. Preparare campioni di cellule o tessuti da sottoporre a visualizzazioni, compresa la colorazione con il colorante di DNA desiderato. Per ottenere le immagini qui utilizzate, i mioblasti C2C12 (CRL-1772, American Type Culture Collection) sono stati coltivati in piastre a 6 pozzetti per 48-72 ore in condizioni di coltura standard (5% CO₂, 37 °C, umidificate), con o senza 50 mM di EtOH⁶, e fis....

Results

Ogni esecuzione di immagini batch produce: 1) un insieme di file immagine con contorni applicati che mostrano i contorni dei nuclei identificati (Figura 5) e 2) un file di .csv (foglio di calcolo) che collega i nomi dei file immagine e i conteggi associati. La visualizzazione dei contorni consentirà all'utente di valutare visivamente la qualità del conteggio. In particolare, le immagini ottenute secondo la sezione 1 dovrebbero avere tutti (o quasi tutti) i nu.......

Discussion

Il nostro programma di quantificazione dei nuclei presenta diversi vantaggi rispetto alle opzioni esistenti: richiede solo competenze tecnologiche minime, è convalidato per il compito specifico di quantificazione dei nuclei ed è open-source; Quest'ultimo supera gli ostacoli legati ai costi. In definitiva, questo programma fornisce ai biologi cellulari e molecolari un'opzione aggiuntiva per quantificare in modo rapido e accurato i nuclei nelle immagini acquisite utilizzando la microscopia.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer con accesso al file dei risultati dal metodo 2 o 3	:		vedere il passaggio 2.6 (per il metodo 2) o il passaggio 3.3.9 o 3.4.9 (per il metodo 3)
Computer con accesso a Internet, browser moderno,			esempio Google Chrome
Computer con accesso a Internet, browser moderno e sistema operativo Windows	Varia	Varia	Per Mac, Linux o altri sistemi operativi, utilizzare il metodo 3
Computer con software per l'acquisizione delle immagini	Zeiss	AxioVision	Altro software è accettabile; deve essere compatibile con il microscopio a fluorescenza
Posizione del file per l'output (foglio di calcolo dei risultati e contorni dell'immagine)	-		Può essere una nuova cartella vuota
Microscopio a fluorescenza	Zeiss	Axiovert 200M	Altri microscopi a fluorescenza sono accettabili; deve essere dotato di cubi filtro appropriati, obiettivo desiderato e fotocamera
Cartella contenente tutte le immagini da quantificare	-	-	Vedere il passaggio 1.12
Python versione 3.10 o superiore		Python-Disponibile	per il download gratuito e l'installazione su https://www.python.org/downloads/
Campioni da riprodurre	:		fissati o vivi, colorati o controcolorati con coloranti fluorescenti per DNA
Software per fogli di calcolo	Microsoft	Excel	È accettabile anche un software per fogli di calcolo simile