Articolo metodologico

Deplezione rapida dei macrofagi renali utilizzando lo strumento di ablazione cellulare CD59/intermedisina umana

890 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/67957

⸱

9 maggio 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comparative Pathology, Tulane National Primate Research Center, 2Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Qui si riporta un protocollo per l'ablazione selettiva dei macrofagi renali per studiarne la rigenerazione utilizzando lo strumento di ablazione cellulare umana CD59/intermedisina. Questo metodo è applicabile anche per studiare la funzione e la rigenerazione delle altre popolazioni cellulari nei reni, nel fegato e nel tessuto adiposo.

Abstract

I macrofagi renali (RM) sono essenziali per la salute dei reni, orchestrando la sorveglianza immunitaria, l'omeostasi dei tessuti e le risposte alle lesioni. In precedenza, abbiamo riportato l'uso di uno strumento di ablazione cellulare umana CD59 (hCD59)/intermedilisina (ILY) per studiare il destino, la dinamica e le nicchie distinte delle RM di origine midollare o embrionale. Le RM originano dai macrofagi derivati dal sacco vitellino, dai monociti epatici fetali e dai monociti derivati dal midollo osseo e si mantengono in età adulta attraverso la proliferazione locale e il reclutamento di monociti circolanti. Qui, riportiamo un protocollo dettagliato per l'ablazione selettiva di RM per studiare la loro rigenerazione, che include 1) generazione e caratterizzazione dell'espressione Cre-inducibile di hCD59 in RM di topo, 2) purificazione di ILY e caratterizzazione dell'attività di IJLY, 3) induzione dell'espressione di hCD59 su RM in topi composti e 4) caratterizzazione della rigenerazione dopo ablazione di RM mediata da ILY. ILY esaurisce specificamente e rapidamente le RM nei topi composti, con un'efficiente ablazione dei macrofagi entro 1 giorno dalla somministrazione di IJLY. La rigenerazione dei macrofagi renali è iniziata entro il giorno 3 dopo l'ablazione, con un recupero di ~88% entro il giorno 7. Questo modello offre un potente strumento per lo studio della biologia dei macrofagi e può essere utilizzato per l'ablazione selettiva di altre popolazioni cellulari nei reni, nel fegato e nei tessuti adiposi per studiarne la funzione e la rigenerazione.

Introduzione

I macrofagi renali (RM) sono cellule immunitarie essenziali che mantengono l'omeostasi renale, regolano le risposte immunitarie e promuovono la riparazione dei tessuti dopo una lesione. Svolgono una varietà di funzioni, tra cui la fagocitosi, la presentazione dell'antigene e l'orchestrazione delle risposte infiammatorie e antinfiammatorie 1,2,3. A seconda dell'ambiente locale, le RM possono polarizzarsi in fenotipi pro-infiammatori (M1) o anti-infiammatori (M2), esacerbando le lesioni o facilitando la guarigione 4,5,6. La disregolazione delle RM è stata implicata nell'insorgenza e nella progressione del danno renale acuto (AKI) e della malattia renale cronica (CKD), rendendole attori fondamentali nella salute e nella patologia renale 7,8. Le RM derivano da varie fonti, tra cui i macrofagi derivati dal sacco vitellino durante l'embriogenesi, i monociti epatici fetali e i monociti derivati dal midollo osseo in età adulta. Le RM si espandono e maturano in parallelo con la crescita renale postnatale, originando principalmente dai monociti epatici fetali prima della nascita, con l'automantenimento durante l'età adulta integrata da monociti periferici9. Negli adulti, i monociti circolanti vengono reclutati nel rene da segnali omeostatici o di lesione, differenziandosi in macrofagi sotto influenze microambientali locali. Il mantenimento della RM è sostenuto dalla proliferazione locale e dal rifornimento periodico dai monociti circolanti 9,10,11,12.

In precedenza abbiamo dimostrato l'uso del sistema di ablazione cellulare umana CD59 (hCD59)/intermedilisina (ILY) come strumento13,14 per studiare i distinti destini, le dinamiche e le nicchie microambientali delle RM derivate dal midollo osseo o da origini embrionali9. ILY lisa selettivamente le cellule umane in pochi secondi formando pori nelle membrane cellulari mirate15. Questa specificità deriva dall'esclusiva affinità di legame di ILY per il CD59 umano (hCD59), senza alcuna interazione o effetto litico su cellule di altre specie prive di questo recettore15. Sulla base di questo concetto, abbiamo progettato uno strumento che consente l'ablazione rapida, condizionale e mirata di cellule umane che esprimono CD59 in modelli murini transgenici attraverso l'applicazione di intermedilisina (ILY)14. Per facilitare l'uso di questo strumento, abbiamo sviluppato un modello di ablazione cellulare condizionale e mirata generando topi knockin STOP-CD59 floxati (ihCD59), in cui l'espressione di CD59 umano avviene solo dopo la ricombinazione mediata daCre13. In precedenza, è stato riscontrato il gene CX3CR1cre-EFP espresso esclusivamente su CD11bintF480hi, definito come macrofagi renali9. Pertanto, abbiamo utilizzato le linee CX3CR1CreER2+/+  per incrociare con topi ihCD59 per esprimere hCD59 sui macrofagi renali. Abbiamo generato con successo topi composti con il genotipo ihCD59+/-/CX3CR1CreER+/-9 (+/-, +/+ e -/- indicano rispettivamente i topi transgenici omozigoti, emizigoti e non portatori). Somministrazione di tamoxifene in topi composti ihCD59+/-/CX3CR1CreER+/- marcati condizionatamente e marcati RM dall'espressione di hCD599. A seguito della deplezione della nicchia di RM attraverso il trattamento con IJLY, i monociti periferici si sono prontamente differenziati in RM derivati dal midollo osseo, ripopolando efficacemente la nicchia come precedentemente descritto in9. Questa rigenerazione è stata criticamente dipendente dall'asse di segnalazione CX3CR1/CX3CL1, sottolineando il suo ruolo essenziale sia nel mantenimento che nel ripristino della popolazione RM9. Abbiamo anche dimostrato che, a causa delle loro distinte capacità glicolitiche, le RM di origine embrionale hanno una maggiore capacità di eliminare i complessi immunitari e sono più sensibili alle sfide immunitarie rispetto alle RM derivate dal midollo osseo9.

Presentiamo un protocollo dettagliato per l'ablazione selettiva delle RM per studiare la loro rigenerazione utilizzando l'ablazione cellulare rapida mediata da Cre-inducibile da hCD59 (ihCD59) dopo somministrazione di ILY. L'iniezione di ILY ha causato l'ablazione mirata di RM che esprimono condizionatamente e specificamente hCD59 in topi composti CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- . Dopo l'ablazione, abbiamo monitorato i cambiamenti dinamici dei macrofagi utilizzando la citometria a flusso e abbiamo riscontrato una rapida deplezione dei macrofagi seguita dalla rigenerazione delle RM. ILY ricombinante è stato espresso in cellule BL21 (DE3) di E. coli e purificato mediante cromatografia di affinità nichel-NTA. La purezza e la funzionalità dell'ILY ricombinante sono state confermate da SDS-PAGE, spettrofotometria e un test di emolisi, dimostrando la sua caratteristica attività di citolisina colesterolo-dipendente. Abbiamo usato ILY per esaurire le RM nei topi, ottenendo un'efficiente ablazione dei macrofagi entro 1 giorno dalla somministrazione di ILI. La rigenerazione dei macrofagi renali è iniziata il giorno 3 dopo l'ablazione, con un recupero del ~85% entro il giorno 7. I dati suggeriscono che la rigenerazione è guidata principalmente dal reclutamento dei monociti. Questo modello offre un potente strumento per lo studio della biologia dei macrofagi e ha un potenziale terapeutico per la manipolazione mirata delle popolazioni di macrofagi nelle malattie renali. Lo strumento di ablazione cellulare ihCD59/ILY può essere utilizzato per studiare la funzione cellulare e la rigenerazione nei reni, nel fegato, nel tessuto adiposo e in altri organi.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

I protocolli di studio sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Tulane University, School of Medicine (numero di protocollo 1482). I topi sperimentali, Cx3cr1CreER+/+ e ihCD59+/+, di età compresa tra 10 e 12 settimane e con un peso di 25-30 g, sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) presso la struttura per animali dell'università. Tutte le procedure che prevedono l'isolamento dei reni sono state condotte in un ambiente sterile, con i ricercatori che indossavano guanti e maschere facciali per prevenire la contaminazione. I dettagli relativi ai reagenti e alle attrezzature utilizzate nello studio sono disponibili nella tabella dei materiali.

1. Preparazione degli animali

  1. Ottieni CX3CR1CreER+/+topi dal Laboratorio Jackson. Ospita i topi presso la Tulane University School of Medicine (SOM) in una struttura specifica priva di agenti patogeni (SPF). Mantenere gli animali sotto un ciclo luce/buio di 12 ore con condizioni ambientali controllate.
  2. Utilizzare topi ihCD59+/+ precedentemente generati con un background genetico C57BL/6 per l'allevamento. Incrociare topi omozigoti CX3CR1CreER+/+ (carenti nell'espressione di CX3CR1) con topi ihCD59+/- per produrre i seguenti genotipi di prole: CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/-e CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/-.
  3. Assicurarsi che i topi eterozigoti CX3CR1CreER+/- mantengano l'espressione funzionale di CX3CR1, mentre i topi omozigoti CX3CR1CreER+/+ siano carenti di CX3CR1 mediante analisi di citometria a flusso con anticorpo anti-CX3CR19.

2. Produzione di ILY (derivata da14,15 )

  1. Giorno 0
    1. Recuperare il ceppola congelata del ceppo batterico ILY BL21-DE3-RIPL che trasporta sequenze ILY marcate con His-A nel plasmide pTrcHis-A (Figura supplementare 1) conservato a -80 °C. Inoculare 10 μL del brodo batterico in 40 μL di terreno di brodo di Luria (LB) contenente ampicillina a una concentrazione di 1 μg/mL.
    2. Distribuire la miscela inoculata su una piastra di agar LB integrata con ampicillina (1 μg/mL). Incubare la piastra per una notte a 37 °C in un incubatore batterico.
  2. Giorno 1
    1. Seleziona sei colonie individuali dalla piastra di agar LB. Inoculare ogni colonia in 3,5 ml di terreno LB contenente ampicillina. Incubare le colture per una notte a 37 °C.
  3. Giorno 2
    1. Trasferire ogni coltura starter da 3,5 mL in 250 mL di terreno LB integrato con ampicillina. Incubare le colture a 37 °C per 3 ore agitando a 230 x g per consentire la crescita batterica.
    2. Dopo 3 ore, aggiungere isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) da una soluzione madre 1 M (conservata a -20 °C) a una diluizione 1:1000 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM. Continuare l'incubazione per altre 4 ore per indurre l'espressione proteica.
    3. Pesare una bottiglia da centrifuga vuota e registrare il peso. Trasferire circa 250 mL della coltura indotta nel flacone da centrifuga.
    4. Pellettare le celle centrifugando a 10.000 x g per 15 min a 4 °C. Scartare il surnatante, quindi pesare il flacone contenente il pellet. Calcolare il peso del pellet sottraendo il peso della bottiglia vuota dal peso totale dopo la centrifugazione.
    5. Conservare il pellet batterico a -20 °C per la successiva estrazione e purificazione di ILY.
  4. Giorno 3 : Estrazione e purificazione di ILY
    1. Preparare il tampone di lisi combinando 30 ml di reagente per l'estrazione di proteine Bug Buster con 30 μl di nucleasi benzonasi (1200 unità Kunitz) e 0,9 μl di lisozima (10.000 unità di attività enzimatica) in una provetta da centrifuga da 50 mL.
    2. Mescolare delicatamente la soluzione per garantire che il tampone di lisi sia omogeneo. Aggiungere il tampone di lisi preparato al pellet batterico (2-5 g). Agitare accuratamente la miscela per 30-60 s per risospendere completamente le cellule batteriche.
    3. Dividere la soluzione risospesa in parti uguali tra due provette da centrifuga da 50 mL. Mettere le provette sul ghiaccio e incubare per 30-90 minuti. Durante l'incubazione, agitare delicatamente le provette utilizzando un agitatore orbitale e agitare brevemente ogni 5-10 minuti per 10-15 s per migliorare la lisi cellulare.
    4. Dopo l'incubazione, centrifugare i lisati a 4.900 x g per 30 minuti a 4 °C.
    5. Lavare accuratamente la colonna con acqua di rubinetto utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml per rimuovere la resina residua dall'uso precedente.
    6. Sciacquare la colonna con etanolo al 70% per sanificarla. Lavare la colonna 2x-3x con ddH2O freddo per rimuovere eventuali residui di etanolo. Posizionare la colonna nel supporto.
    7. Aggiungere 6-10 mL di ddH2O freddo per lavare ulteriormente ed equilibrare la colonna per la purificazione. Aggiungere circa 3 mL di perle di resina alla colonna. Collegare la colonnina ad una pompa peristaltica impostata su una velocità di 30.
    8. Aggiungere 10 ml di ddH2O freddo per sospendere completamente la resina e prepararla per il legame proteico. Lavare le perle di resina con 15 ml di 1x tampone di ricarica per preparare la resina al legame proteico.
    9. Raccogliere il surnatante di lisato batterico dopo la centrifugazione in una provetta nuova, assicurandosi che il pellet venga scartato. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro da 0,45 μm con una siringa per rimuovere eventuali detriti cellulari rimanenti.
    10. Far passare 20-25 mL di lisato batterico filtrato attraverso la colonna in tre cicli separati. Dopo ogni passaggio, raccogliere 20 μl di flusso ed etichettarlo come P.E. per la successiva misurazione della densità ottica (OD).
    11. Lavare la colonna con 20-30 mL di tampone legante per rimuovere le proteine non legate. Lavare la colonna con 20-30 ml di Wash Buffer. Raccogliere 20 μl della frazione di lavaggio per la misurazione OD.
    12. Eluire la proteina legata aggiungendo 10-20 ml di tampone di eluizione. Iniziare a raccogliere l'eluizione dopo 3-4 minuti utilizzando provette da microcentrifuga. Raccogliere circa 1 ml per provetta, riempiendo 15-17 provette.
    13. Misurare l'assorbanza di ciascuna frazione di eluizione in A280 utilizzando uno spettrofotometro. Utilizzare il buffer di eluizione come spazio vuoto durante le letture A280. Raccogliere le provette con assorbanza notevolmente aumentata all'A280 poiché contengono la proteina ILY marcata con His, che si trova tipicamente nelle frazioni intorno alla provetta 13.
    14. Conservare le frazioni di eluizione (o le provette) contenenti la proteina ILY a 4 °C. Procedere con ulteriori passaggi entro il giorno successivo per garantire una stabilità ottimale delle proteine.
      NOTA: Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio o a 4 °C, ove possibile, per mantenere l'integrità delle proteine.
  5. Giorno 4: Rimozione dell'endotossina dall'eluizione
    1. Sciacquare la colonna di resina per la rimozione delle endotossine con 6-10 ml di acqua ultrapura. Premere delicatamente la colonna per regolare il flusso.
    2. Sciacquare la colonna con 10 ml di soluzione desossicolato di sodio all'1% (appena preparata o non più vecchia di 1 mese) per rimuovere le endotossine legate. Sciacquare nuovamente la colonna con 6-10 ml di acqua ultrapura per rimuovere eventuali residui di detersivo.
    3. Applicare il campione proteico preparato sulla colonna di resina. Incubare il campione nella colonna per 1 ora a temperatura ambiente (RT) per consentire un legame ottimale delle endotossine.
    4. Raccogli la frazione di flusso iniziale. Aggiungere ddH2O alla colonna per un'ulteriore eluizione e raccogliere le frazioni eluite in circa 10 provette (1 mL per provetta).
    5. Conservare la colonna di resina in etanolo al 25% a 4 °C per un uso futuro. Misurare la densità ottica (O.D.) dei campioni di proteine eluite per quantificare la resa. Aspettatevi di recuperare circa il 50%-70% delle proteine totali dal primo lotto di eluizione.
  6. Giorno 5-6: Dialisi
    1. Preparare 2 L di tampone per dialisi in autoclave 1600 mL di acqua distillata e deionizzata (ddH2O). Aggiungere 200 ml di 10x PBS, 200 ml di glicerolo e 3,5115 g di MES (acido 2-(N-morfolino) etansolfonico) all'acqua sterilizzata in autoclave.
    2. Mescolare la miscela con un'ancoretta magnetica fino a quando tutti i reagenti non sono completamente sciolti. Conservare il tampone risultante a 4 °C.
    3. Aggiungere le frazioni di eluizione immagazzinate al kit di dialisi, quindi rimuovere l'aria dal kit di dialisi con un ago. Dializzare la soluzione proteica utilizzando il kit per dialisi per 24 ore a 4 °C con una velocità di agitazione impostata a circa 2.
    4. Configurare il kit per dialisi in modo che sia completamente immerso nel tampone. Sostituire il tampone per dialisi nel kit per dialisi con un tampone per dialisi fresco in un contenitore da 2 L il giorno successivo. Continuare la dialisi per altre 24 ore.
    5. Trasferire con cura l'intera soluzione, compresi i precipitati bianchi, in una provetta sterile per preservare la proteina ILY, che può aggregarsi. Concentrare la proteina ILY utilizzando un'unità di filtro centrifuga, seguendo le istruzioni del produttore per la centrifugazione.
    6. Aliquotare la proteina ILY concentrata in porzioni da 200 μl in provette sterili. Etichettare ogni tubo con la data e il nome. Conservare le aliquote a -80 °C per un uso futuro in saggi di elettroforesi su gel ed emolisi.

3. Caratterizzazione ILY mediante elettroforesi SDS-PAGE

  1. Preparare il buffer di esecuzione MOPS SDS (1x) diluendo il buffer di corsa (20x) con ddH2O.
  2. Preparare il tampone del campione in una cappa aspirante mescolando 90 μl di tampone di caricamento 6x con 10 μl di β-mercaptoetanolo (β-ME). Mescolare accuratamente la soluzione per garantire una completa omogeneizzazione.
  3. Combinare il campione preparato con il tampone di caricamento per ottenere un volume finale di 30 μl. Scongelare i campioni e agitarli energicamente per garantire una miscelazione completa.
  4. Riscaldare i campioni a 95 °C per 5 minuti per denaturare le proteine. Caricare i campioni su un gel SDS-PAGE al 4%-20%. Eseguire l'elettroforesi a una tensione costante di 80 V per 90 minuti.
  5. Aprire con cautela la cassetta del gel e immergere il gel in ddH2O per 5 min. Ripetere la fase di lavaggio 2 volte utilizzando uno shaker.
  6. Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Lavare il gel per 30 minuti in ddH2O. Sostituire l'acqua con ddH2O fresco e incubare il gel su uno shaker per un periodo che va dalla notte a 3 giorni per la completa decolorazione.
  7. Acquisire un'immagine del gel colorato utilizzando una fotocamera (Figura 1A). Analizza il gel utilizzando il software ImageJ per valutazioni quantitative e qualitative.

4. Dosaggio emolitico per attività ILY

  1. Scongelare completamente i campioni di ILY (Intermedilysin) conservati a temperatura ambiente. Agitare accuratamente i campioni scongelati per garantire l'omogeneità, poiché ILY può aggregarsi durante lo scongelamento.
  2. Impostare una piastra a 96 pozzetti per diluizioni seriali. Aggiungere 160 μl della soluzione madre ILY (26,7 ng/μl) al primo pozzetto. Aggiungere 80 μl di 1x PBS a ciascuno dei pozzetti successivi nella stessa riga o colonna.
  3. Trasferire 80 μl della soluzione ILY dal primo pozzetto al secondo pozzetto. Miscelare accuratamente pipettando su e giù per assicurarsi che la soluzione sia omogenea. Trasferire 80 μl dal secondo al terzo pozzetto e mescolare accuratamente.
  4. Ripetere questo processo per ogni pozzetto, trasferendo 80 μl dal pozzetto precedente al successivo fino a preparare il numero di diluizioni desiderato. Dopo aver trasferito 80 μl nell'ultimo pozzetto, scartare 80 μl da quel pozzetto per garantire volumi costanti in tutta la piastra.

5. Preparazione dei globuli rossi umani (RBC)

  1. Aspirare 1-2 ml di sangue umano fresco in una provetta contenente un anticoagulante, come l'EDTA. Centrifugare il sangue a temperatura ambiente a 3.000 x g per 5 minuti.
  2. Scartare il surnatante e lavare il pellet di globuli rossi umani con PBS 2x-3x fino a quando il surnatante non è limpido. Diluire i globuli rossi umani lavati aggiungendo 10 μl di globuli rossi a 900 μl di 1x PBS per ottenere una diluizione 1:100.
  3. Aggiungere 10 μl di globuli rossi umani diluiti in ciascun pozzetto. Aggiungere 30 μl della soluzione ILY diluita in serie dalla piastra di diluizione a ciascun pozzetto. Aggiungere 160 μl di 1x PBS per portare il volume finale a 200 μl per pozzetto (concentrazione iniziale: 4 ng/μl).
  4. Aggiungere 10 μl di globuli rossi umani diluiti ai pozzetti di controllo. Aggiungere 190 μL di acqua o 1x PBS ai pozzetti di controllo per i controlli negativi. Mescolate i piatti picchiettandoli delicatamente.
  5. Incubare le piastre a 37 °C per 30 minuti per consentire l'emolisi. Centrifugare le piastre a 3.000 x g per 5 minuti per pellettare eventuali globuli rossi umani intatti.
  6. Trasferire con cautela 100 μl di surnatante da ciascun pozzetto a una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Misurare l'assorbanza dei surnatanti a 405 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
  7. Calcolare l'attività emolitica di ILY confrontando i valori di assorbanza dei campioni con quelli del controllo16.

6. Trattamento con tamoxifene, esaurimento RM e rigenerazione

  1. Preriscaldare l'olio di mais a 42 °C. Sciogliere 100 mg di tamoxifene in 5 mL di olio di mais preriscaldato per preparare una soluzione madre con una concentrazione di 20 mg/mL.
  2. Somministrare tamoxifene per via intraperitoneale (i.p.) a topi maschi CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- di età compresa tra 10 μg/g di peso corporeo alla dose di 100 μg/g di peso corporeo. Ripetere l'iniezione di tamoxifene per 3 giorni consecutivi.
  3. Attendere 15 giorni dopo l'ultima iniezione di tamoxifene per consentire l'espressione di hCD59 mediata da Cre.
  4. Iniettare una singola dose di intermedilisina (ILY) per via endovenosa nei topi CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/- e nei controlli della cucciolata CX3CR1CreER+/-/ihCD59-/- alla dose di 120 ng/g di peso corporeo.
  5. Monitorare e confermare l'ablazione RM e la successiva rigenerazione eseguendo la citometria a flusso a 1, 3 e 7 giorni dopo la somministrazione di ILY17.

7. Eutanasia del topo

  1. Collocare l'animale in una camera appropriata ed esporlo all'isoflurano in conformità con i protocolli IACUC. Verificare l'anestesia controllando l'assenza di riflessi, come il riflesso di ritiro del pedale.
  2. Una volta che il topo è completamente anestetizzato e non risponde, eseguire la lussazione cervicale per garantire l'eutanasia. Confermare l'eutanasia verificando l'assenza di riflessi, come il riflesso di ritiro del pedale.
  3. Praticare un'incisione sulla linea mediana di circa 2 cm sull'addome utilizzando un bisturi sterile e ritrarre delicatamente la pelle per esporre la cavità toracica. Apri la gabbia toracica lungo lo sterno usando le forbici chirurgiche a punta smussata per esporre il cuore.
  4. Inserire un ago 21G-23G nel ventricolo sinistro. Iniziare la perfusione con 10-20 ml di PBS freddo per eliminare il sangue.
  5. Tagliare l'atrio destro per consentire al sangue di defluire dalla circolazione. Continua la perfusione fino a quando i reni appaiono pallidi, indicando un'efficace eliminazione del sangue.
  6. Individua i reni contro la parete dorsale del corpo. Separa delicatamente i reni dai tessuti circostanti usando una pinza e delle forbici. Asportare le capsule renali e mettere immediatamente i reni in PBS freddo per prevenire la degradazione.

8. Digestione dei reni

  1. Preparare il cocktail di enzimi digestivi mescolando 9 ml di HBSS (senza Ca/Mg), 1 ml di collagenasi IV (5 mg/mL) e 20 μL di DNasi I (10 mg/mL). Preparare la soluzione enzimatica fresca e tenerla in ghiaccio fino al momento dell'uso.
  2. Tritare i reni in piccoli frammenti (idealmente ≤ 1 mm) utilizzando forbici sterili in una capsula di Petri contenente 5 ml di HBSS. Trasferire i frammenti di tessuto renale in provette da 15 mL contenenti 10 mL della soluzione enzimatica preparata.
  3. Incubare le provette a 37 °C per 30 minuti con una leggera agitazione per dissociare il tessuto. Triturare delicatamente il tessuto utilizzando una pipetta o uno stantuffo della siringa per dissociare ulteriormente i grumi cellulari.
  4. Rimuovere i detriti tissutali facendo passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Centrifugare la sospensione cellulare a 650 x g per 10 minuti a 18 °C.
  5. Decantare accuratamente il tampone dopo la centrifugazione. Risospendere il pellet in 5 mL di tampone di lisi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi.
  6. Lavare le cellule con PBS per rimuovere il tampone di lisi. Mantenere la sospensione a cella singola risultante sul ghiaccio fino a nuovo utilizzo.

9. Centrifugazione in gradiente di densità

  1. Per arricchire le cellule ematopoietiche, risospendere il pellet cellulare del lavaggio precedente in 10 mL di soluzione con gradiente di densità al 30%. Stratificare accuratamente la soluzione su 3 mL di soluzione con gradiente di densità al 70% in una provetta da centrifuga.
  2. Centrifugare la pendenza a 500 x g per 30 minuti senza frenare. Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura lo strato di interfase tra le soluzioni al 30% e al 70%; Questo strato contiene le singole cellule arricchite.
  3. Lavare le cellule raccolte 2 volte con 10 mL di PBS centrifugando a 500 x g per 10 minuti ogni volta. Risospendere il pellet cellulare finale in 1 mL di tampone FACS (1x PBS con 2% FBS) in una provetta da 1,5 mL.
  4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro al microscopio a campo chiaro. Regolare la concentrazione delle cellule su 2 x 106 cellule/mL.

10. Colorazione con citometria a flusso, acquisizione

  1. Regolare la concentrazione cellulare da sospensioni di singole cellule preparate da tessuto renale di topo a 2-3 x 106 cellule/mL per l'analisi citofluorimetrica.
  2. Pellettare le cellule in provette da 1,5 mL centrifugando a 650 x g per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone FACS.
  3. Aggiungere l'anticorpo anti-CD16/32 a una diluizione 1:200 per bloccare il legame non specifico del recettore Fc. Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente.
  4. Utilizzare il colorante Aqua Live/Dead per distinguere le cellule vive da quelle morte, seguendo le istruzioni del produttore.
  5. Colorare le cellule con anticorpi pre-coniugati a una diluizione 1:100, tra cui CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE e F4/80-BV605. Aggiungere il cocktail di anticorpi alla sospensione cellulare.
  6. Incubare il campione per 30 minuti a 4 °C al buio per proteggere i fluorofori dal fotosbiancamento. Lavare le cellule colorate 2 volte con tampone FACS (PBS con siero fetale bovino al 2%) centrifugando a 650 x g per 5 minuti.
  7. Fissare le cellule in paraformaldeide (PFA) all'1% per 30 minuti su ghiaccio. Lavare le celle fisse 2 volte con tampone FACS per rimuovere il PFA residuo.
  8. Acquisire cellule colorate e fissate utilizzando un citometro a flusso. Analizza i dati utilizzando il software.
  9. Identificare i macrofagi e le microglia residenti nei reni e in altri tessuti utilizzando i marcatori CD45, CD11b e F4/80 come descritto in9 .
  10. Eseguire il gating iniziale per selezionare le celle vive in base ai profili FSC (Direct Scatter) e SSC (Side Scatter). Elimina i doppietti impostando l'area di dispersione diretta (FSC-A) rispetto all'altezza di dispersione diretta (FSC-H). Escludere le cellule morte utilizzando il colorante di vitalità LIVE/DEAD.
  11. Arricchisce le cellule immunitarie controllando le popolazioni CD45+. Definire i macrofagi residenti nei reni come cellule CD11b+F4/80++ all'interno della popolazione CD45+, come mostrato nella strategia di gating (Figura 2A).
  12. Definire le popolazioni di microglia come cellule CD11b+CD45iⁿt (Figura 2B). Eseguire l'acquisizione dei dati sul citometro a flusso. Condurre l'analisi finale utilizzando il software per completare lo studio citofluorimetrico.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La purificazione dell'ILY ricombinante His-Tag ha seguito lo stesso protocollo precedentemente descritto in14. ILY è stato espresso con successo in cellule BL21(DE3) di E. coli , trasformate con un plasmide codificante il gene ILY da Streptococcus intermedius. Dopo l'induzione con IPTG, era evidente una sovraespressione della proteina bersaglio. Dopo l'espressione, l'ILY è stato purificato mediante cromatografia di affinità nichel-NTA, sfruttando un His-tag C-terminale per il leg...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

L'espressione, la purificazione e la validazione funzionale di ILY ricombinante con tag His-taged in questo studio hanno seguito un protocollo ben consolidato15. Tuttavia, il processo prevedeva diversi passaggi critici che garantivano un'elevata resa proteica, purezza e attività biologica. L'induzione di cellule BL21 (DE3) di E. coli con IPTG è stata ottimizzata per bilanciare i livelli di espressione proteica riducendo al...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo manoscritto. Nessun conflitto di interessi, comprese le affiliazioni finanziarie, non finanziarie, professionali o personali, ha influenzato la progettazione, la conduzione, l'interpretazione o la presentazione dello studio.

Ringraziamenti

Estendiamo la nostra gratitudine ai membri passati e attuali del Qin Lab per il loro contributo allo sviluppo e al perfezionamento dei protocolli utilizzati in questo studio. Ringraziamo anche il gruppo del Dr. R. K. Tweten presso l'Health Sciences Center dell'Università dell'Oklahoma per aver generosamente fornito il plasmide ricombinante ILY, che è stato determinante in questa ricerca. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) attraverso la sovvenzione NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) e R21OD024931 (X.Q.).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,45 & micro; m filtro per siringheMilliporeSLHVR33RS
4-15% Gel proteici senza macchie TGXBio-Rad4568084
Buffer di caricamento 6XPescatore50-103-6570
70% EtanoloWWR Scienze della Vita64-17-5
ACK (Cloruro di Ammonio-Potassio) Tampone LisantiGibcoA1049201
Perle in resina AffinityMillipore69670
Soluzione di ampicillina sodicaRicerca ZymoA1001-5
Anti-CD11b-PE-Cy7 (Clone M1/70)Invitrogen25-0112-82
Anti-CD16/32 (Fcγ RIII/II, Clone 93)eBioscience48-0161-80
Anti-CD45-e450 (Clone 30-F11)eBioscience48-0451-82
Anti-F4/80-BV605 (clone BM8)BioLegend 123133
Anti-hCD59-PE (Clone OV9A2)Invitrogen12-0596-42
Colorante Aqua Live/DeadInvitrogen      L34957A
Perline (resina)Millipore69670
Benzonasi NucleasiMillipore70664-10KUN
Reagente per l'estrazione di proteine BugBusterMillipore70584-4
Centrifuga per microprovetteEppendorf5424
Centrifuga per provetteTermo Scientifico75-001-241
Collagenasi tipo IVSocietà biochimica WorthingtonLS004188
Olio di maisSigma AldrichVisualizzazione del materiale C8267
Desossiribonucleasi (DNAsi) ISocietà biochimica WorthingtonLS002007
Colonna di resina Detoxi-GelMillipore69670
DPBS (Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato)Corning21-031-CV
Provette EDTABD365974
FBS (Siero fetale bovino)Gibco10082-139
GliceroloPescatoreBP229-1
HBSS (Hank' s Soluzione salina ballanced)Gibco24020117
IPTG (isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside) Millipore-Sigma206-703-0
IsofluranoVET uno502017
LB media
LSRCcitometro a flusso a flusso a frottolaBD Bioscienze
MES [acido 2-(N-morfinolino) etansolfonico]Pescatore50-488-796
MOPS [acido 3-(N-morfinolino) propansolfonico]Pescatore50-213-522
Mezzi di gradiente di densità PercollCitiva17089101
Pompa peristalticaFisher ScientificoFuori produzione ora, usa un'alternativa
PFA (Paraformaldeide)Termo ScientificoI28800
Colonna di depurazioneMilliporeUFC900308
Soluzione rLysozymeNovagenCodice 20C71110
Bagno d'acqua tremante Termo ScientificoTSSB15
Kit per dialisi Slide-A-LyzerTermo66107
Desossicolato di sodioPescatoreBP349-100Appena fatto o da meno di un mese
Filtro cellulare sterile (40 μ m)Fisher Scientifico22-363-547
TamoxifeneSigma Aldrich6734
Filtro ultra centrifugoMilliporeUFC900308
Acqua ultrapuraTermo10977-015
Miscelatore a vorticeFisher Scientifico2215365
β-ME (β-mercaptoetanolo)PescatoreBP176-100

Riferimenti

  1. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  2. Nelson, P. J., et al. The renal mononuclear phagocytic system. J Am Soc Nephrol. 23 (2), 194-203 (2012).
  3. Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
  4. Islamuddin, M., Qin, X. Renal macrophages and NLRP3 inflammasomes in kidney diseases and therapeutics. Cell Death Discov. 10 (1), 229(2024).
  5. Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  6. Mily, A., et al. Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. J Vis Exp. (163), e61807(2020).
  7. Huen, S. C., Cantley, L. G. Macrophages in Renal Injury and Repair. Annu Rev Physiol. 79, 449-469 (2017).
  8. Tang, P. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. Macrophages: versatile players in renal inflammation and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 15 (3), 144-158 (2019).
  9. Liu, F., et al. Distinct fate, dynamics and niches of renal macrophages of bone marrow or embryonic origins. Nat Commun. 11 (1), 2280(2020).
  10. Chew, C., et al. Kidney resident macrophages have distinct subsets and multifunctional roles. Matrix Biol. 127, 23-37 (2024).
  11. Cheung, M. D., et al. Resident macrophage subpopulations occupy distinct microenvironments in the kidney. JCI Insight. 7 (20), 161078(2022).
  12. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  13. Feng, D., et al. Cre-inducible human CD59 mediates rapid cell ablation after intermedilysin administration. J Clin Invest. 126 (6), 2321-2333 (2016).
  14. Hu, W., et al. Rapid conditional targeted ablation of cells expressing human CD59 in transgenic mice by intermedilysin. Nat Med. 14 (1), 98-103 (2008).
  15. Giddings, K. S., Zhao, J., Sims, P. J., Tweten, R. K. Human CD59 is a receptor for the cholesterol-dependent cytolysin intermedilysin. Nat Struct Mol Biol. 11 (12), 1173-1178 (2004).
  16. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  17. Cao, Q., Harris, D. C., Wang, Y. Macrophages in kidney injury, inflammation, and fibrosis. Physiology. 30 (3), 183-194 (2015).
  18. Li, G., et al. The role of macrophages in fibrosis of chronic kidney disease. Biomed Pharmacother. 177, 117079(2024).
  19. Liu, F., et al. Versatile cell ablation tools and their applications to study loss of cell functions. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4725-4743 (2019).
  20. Yashchenko, A., et al. Cx3cr1 kidney resident macrophage heterogeneity. Front Immunol. 14, 1082078(2023).
  21. Duffield, J. S. Macrophages and immunologic inflammation of the kidney. Semin Nephrol. 30 (3), 234-254 (2010).
  22. Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22 (2), 317-326 (2011).
  23. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  24. Guo, C., et al. Crosstalk between proximal tubular epithelial cells and other interstitial cells in tubulointerstitial fibrosis after renal injury. Front Endocrinol. 14, 1256375(2023).
  25. Guillot, A., et al. Bile acid-activated macrophages promote biliary epithelial cell proliferation through integrin αvβ6 upregulation following liver injury. J Clin Invest. 131 (9), 132305(2021).
  26. Kim, S. J., et al. Adipocyte Death Preferentially Induces Liver Injury and Inflammation Through the Activation of Chemokine (C-C Motif) Receptor 2-Positive Macrophages and Lipolysis. Hepatology. 69 (5), 1965-1982 (2019).
  27. Saxena, V., et al. Generation of Atp6v1g3-Cre mice for investigation of intercalated cells and the collecting duct. Am J Physiol Renal Physiol. 325 (6), F770-F778 (2023).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Ablazione dei macrofagistrumento Intermedilisinasorveglianza immunitaria renalereclutamento dei monociticitometria a flussomicroscopia intravitalecentrifugazione a gradiente di densitmarcatore F4 80

Articoli correlati