Articolo metodologico

Rilevamento basato sulla fluorescenza dell'attività della nucleasi FEN1 e screening di inibitori di piccole molecole

DOI:

10.3791/67968

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27 giugno 2025

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1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un saggio biochimico gel shift per misurare l'attività di FEN1 (Flap Endonuclease 1) e lo sviluppo di inibitori.

Abstract

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FEN1 (Flap Endonuclease 1) è una nucleasi chiave del DNA coinvolta nella replicazione del DNA e nella riparazione dei danni, svolgendo un ruolo cruciale nel mantenimento della stabilità genomica. Livelli elevati di attività di FEN1 sono strettamente associati allo sviluppo di vari tumori, rendendo FEN1 un biomarcatore riconosciuto e un bersaglio farmacologico per i tumori del polmone, della mammella e della prostata. I metodi convenzionali di marcatura con radioisotopi per rilevare l'attività della nucleasi FEN1 presentano sfide in termini di praticità e sicurezza. In questo studio, un substrato di frammento di DNA con una struttura a lembo è stato sintetizzato in vitro. Questo substrato è marcato con un fluoroforo all'estremità 5' del lembo, che consente alla nucleasi FEN1 di riconoscere e scindere in modo specifico il sito designato. L'attività di FEN1 è stata quindi determinata rilevando il segnale del fluoroforo dopo l'elettroforesi su gel. Questo metodo consente una valutazione rapida ed efficace dell'attività della nucleasi FEN1 e lo screening dei suoi inibitori. Fornisce un approccio sensibile e specifico per l'analisi dell'attività di FEN1 e la valutazione dell'efficacia degli inibitori di piccole molecole. Inoltre, contribuisce in modo significativo alla ricerca sulla riparazione dei danni al DNA e sullo sviluppo del cancro, offrendo una nuova strategia per la ricerca clinica sui meccanismi delle malattie e l'individuazione di sostanze genotossiche.

Introduzione

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La replicazione del DNA non è sempre impeccabile e può essere interrotta da fattori interni ed esterni. Di conseguenza, i meccanismi di replicazione del DNA e di riparazione dei danni sono vitali per la sopravvivenza cellulare e la stabilità del genoma. In questo processo, l'endonucleasi umana FEN1 (Flap Endonuclease 1), una nucleasi del DNA, svolge un ruolo cruciale 1,2,3.

FEN1 è principalmente coinvolto nella replicazione del DNA ed è indispensabile per la maturazione dei frammenti di Okazaki sul filamento ritardato 4,5. Ciò garantisce l'efficiente progressione della replicazione del DNA e la riparazione accurata del DNA danneggiato. Tuttavia, aumenti anomali dei livelli di FEN1 sono stati strettamente collegati allo sviluppo di vari tipi di cancro 6,7, comeil cancro ai polmoni e al seno. Pertanto, FEN1 non è solo essenziale per la replicazione e la riparazione del DNA, ma ha anche raccolto un'attenzione significativa come biomarcatore per la diagnosi del cancro e un potenziale bersaglio terapeutico 8,9. Il rilevamento dell'attività di FEN1 è essenziale per la diagnosi precoce dei tumori e per far progredire la ricerca sulle terapie mirate.

Data l'importanza del FEN1 e la necessità di studiare la sua attività per la diagnosi precoce del cancro e lo sviluppo di terapie mirate, l'obiettivo principale del metodo sviluppato in questo esperimento era quello di misurare in modo accurato ed efficiente l'attività della nucleasi FEN1. Questo metodo mira a fornire una piattaforma affidabile per lo screening di inibitori di piccole molecole che hanno come bersaglio FEN1. Raggiungendo questi obiettivi, lo studio cerca di contribuire a una migliore comprensione del ruolo del FEN1 nel cancro e di facilitare la scoperta di nuove strategie terapeutiche.

Esistono numerose tecniche per rilevare l'attività della nucleasi FEN1, ognuna con caratteristiche, principi, vantaggi, limitazioni e scenari applicabili distinti. Ad esempio, l'elettroforesi su gel e i metodi di separazione del substrato basati su HPLC forniscono risultati intuitivi, ma comportano procedure complesse e una bassa produttività10,11. I saggi di polarizzazione a fluorescenza (FP) incontrano sfide nella valutazione dell'attività di FEN1 a causa dell'interferenza dell'autofluorescenza composta o della diffusione della luce, che influisce sui segnali FP. Sebbene le strategie di contro-screening possano escludere parzialmente i falsi positivi, circa il 15% dei composti attivi primari viene ancora identificato in modo errato a causa di interferenze tecniche12. L'uso combinato di coppie donatore/quencher di fluorescenza (ad esempio, TAMRA/BHQ-2) e la chemiluminescenza AlphaScreen presenta degli svantaggi, come l'elevato costo di sintesi di substrati fluorescenti complessi a triplo lembo, che ne limitano particolarmente l'utilità nello screening su larga scala. Inoltre, la struttura a doppio lembo dei substrati può ostacolare il legame ottimale con FEN1, riducendo l'efficienza della scissione enzimatica e compromettendo la sensibilità di rivelazione. Inoltre, questo approccio si basa fortemente su strumenti specializzati (ad esempio, ViewLux, EnVision), limitandone l'adozione in laboratori con risorse limitate 13,14,15. I metodi di rilevamento fluorescenti basati su nanosonde di DNA a forma di manubrio a doppio lembo funzionalizzate con nanocluster d'argento (DNA-AgNC) soffrono di variabilità da lotto a lotto a causa della loro dipendenza da fasi di ricottura precise e nucleazione in situ, ostacolando la riproducibilità e la scalabilità. I costi elevati e le procedure lunghe ne limitano ulteriormente l'applicazione pratica16.

In questo articolo, viene sviluppato un test basato sulla marcatura a fluorescenza per affrontare le attuali limitazioni tecniche e soddisfare la crescente domanda di metodi più sicuri e accessibili all'utente per lo studio dell'attività di FEN1. Questa tecnica sfrutta la specificità e l'elevata sensibilità del rilevamento della fluorescenza, nonché la capacità di ingegnerizzare substrati di DNA con strutture definite che possono essere riconosciute e tagliate da FEN1 (Figura 1). Questo metodo semplifica le procedure sperimentali mantenendo un'elevata accuratezza nella valutazione dell'attività della nucleasi FEN1. Rispetto alla tradizionale elettroforesi su gel e alle tecniche basate su HPLC, offre un funzionamento semplificato e tempi di consegna più rapidi. A differenza dei saggi di polarizzazione della fluorescenza, questo approccio consente un rapido screening qualitativo dei composti, stabilendo una strategia efficiente per la valutazione enzimatica preliminare.

Questo metodo è adatto per studiare l'attività della nucleasi FEN1 in ambienti di laboratorio in cui l'accesso ai materiali radioattivi è limitato. È anche adatto per lo screening di un gran numero di inibitori di piccole molecole in un tempo relativamente breve, soprattutto quando sono richieste un'elevata sensibilità e specificità. Tuttavia, non è ideale per gli studi che richiedono una quantificazione assoluta con precisione molto elevata o per i laboratori che non dispongono di apparecchiature di rilevamento della fluorescenza di base e di competenze nell'analisi dei segnali di fluorescenza. Per gli studi incentrati su applicazioni in vivo , in cui il comportamento di FEN1 può essere influenzato da fattori biologici complessi non replicati negli attuali disegni di saggi in vitro , potrebbero essere necessari ulteriori perfezionamenti o metodi alternativi.

Questo test di fluorescenza è altamente sensibile e specifico, fornendo uno strumento sicuro, conveniente ed efficace per studiare l'attività di FEN1 e sviluppare i suoi inibitori.

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Protocollo

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I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Purificazione dell'espressione proteica FEN1

  1. Purificazione delle proteine
    1. Rimuovere lo stock batterico contenente il plasmide bersaglio (vedi Tabella dei materiali) da -80 °C. Scongelare a temperatura ambiente e inoculare 200 μl dalle provette per microcentrifuga congelate da 1,5 mL in un terreno da 20 mL LB contenente 50 μg/mL di kanamicina utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl.
      NOTA: Il ceppo è E. coli BL21(DE3)-FEN1.
    2. Incubare a 37 °C agitando a 160 rpm per 12 h.
    3. Trasferire la sospensione batterica in un pallone di Erlenmeyer da 200 mL contenente terreno LB integrato con 50 μg/mL di kanamicina. Continuare l'incubazione a 37 °C con agitazione a 160 rpm per 2-3 h.
    4. Quando l'OD600 della coltura raggiunge circa 0,6, aggiungere 2 mL di IPTG (concentrazione finale: 1 mM). Continuare l'incubazione a 25 °C, 160 giri/min per 10 ore.
    5. Trasferire la coltura indotta in una provetta da centrifuga da 50 mL pre-pesata. Centrifugare a 4 °C e 2500 × g per 15 min. Scartare il surnatante. Pesare il tubo contenente pellet e sottrarre il peso del tubo vuoto per calcolare la massa del pellet.
    6. Aggiungere 7 mL di tampone di lisi per grammo di pellet di cellule umide. Utilizzare una pipetta per risospendere completamente il pellet pipettandolo su e giù.
      NOTA: Il tampone di lisi (10 mL in totale) contiene 20 mM di Tris-HCl, 250 mM di NaCl, 2% di Triton X-100 e ddH2O. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante per garantire una manipolazione sicura dei reagenti chimici.
    7. Trasferire la sospensione batterica nel tampone di lisi in un congelatore a -80 °C e congelare per una notte. Il giorno successivo, scongelare la sospensione su un agitatore a 4 °C per 1 ora per migliorare l'efficienza della lisi.
    8. Lisi le cellule utilizzando gli ultrasuoni al 75% della potenza per 45 minuti. Centrifugare il lisato a 12.000 × g per 20 minuti a 4 °C per separare il surnatante dal pellet.
      NOTA: Se il lisato rimane torbido, aumentare il volume del tampone di lisi o ripetere i cicli di congelamento-scongelamento. Può anche essere aggiunto un inibitore della nucleasi per preservare l'integrità della proteina e prevenire la degradazione.
    9. Applicare il surnatante chiarificato lungo la parete di un tubo contenente resina per la purificazione delle proteine preparata. Lavare con 10 ml di tampone di eluizione per rimuovere le proteine non specificamente legate.
      NOTA: Il tampone di eluizione contiene 20 mM di Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM di NaCl, 2% di Triton X-100, 200 mM di imidazolo e acqua distillata.
    10. Eluire la proteina FEN1 aggiungendo 5 mL di tampone di eluizione lungo la parete interna della provetta.
  2. Identificazione di proteine bersaglio mediante colorazione rapida coomassie blu brillante
    1. Preparare i gel SDS-PAGE utilizzando il 12% di gel separatore e il 5% di gel impilabile in base alla dimensione prevista di FEN1.
    2. Mescolare il campione di proteina target e lo standard BSA con un tampone del campione al 5× in un rapporto 1:4. Scaldare il composto a 95 °C per 5 minuti per denaturare completamente le proteine.
    3. Caricare 20 μl di campioni di proteine standard BSA e denaturate in pozzetti separati del gel SDS-PAGE.
    4. Collegare l'apparecchio per elettroforesi. Impostare la tensione a 90 V e far funzionare per 1 ora e 40 minuti.
    5. Dopo l'elettroforesi, trasferire il gel in un contenitore per la colorazione. Sciacquare con acqua deionizzata, quindi aggiungere 30 ml di soluzione disinfettante per proteine e colorare per 25 minuti. Recuperare la soluzione colorante, sciacquare il gel con 20 ml di acqua deionizzata e decolorare per una notte su uno shaker orizzontale.
    6. Dopo la decolorazione, posizionare il gel su una piastra di plastica trasparente e osservare le bande proteiche sotto la luce bianca.
      NOTA: Se le bande sono deboli o la concentrazione proteica è bassa, concentrare il campione utilizzando provette per ultrafiltrazione. Questo passaggio rimuove il solvente in eccesso e le piccole molecole, migliorando la concentrazione proteica e garantendo un'analisi accurata negli esperimenti successivi.

2. Preparazione del substrato di DNA marcato con FEN1 TAMBRA

  1. Preparazione del substrato di DNA marcato con TAMBRA
    1. Progettare filamenti di oligonucleotidi di DNA in base all'attività di scissione specifica di FEN1, facendo riferimento ai metodi pubblicati17 (vedi Tabella 1). L'estremità 5′ della sequenza D1 viene modificata con un'etichetta TAMRA fluorescente.
    2. Aggiungere oligonucleotidi di DNA a filamento singolo miscelati a 10 μL di tampone di ricottura nei seguenti volumi: 5 μL di D1 (10 pmol/μL), 10 μL di T1 (10 pmol/μL) e 7,5 μL di U2 (10 pmol/μL). Aggiungere acqua deionizzata per portare il volume totale a 50 μl.
      NOTA: Il tampone di ricottura contiene 100 mM di Tris-HCl (pH 7,5) e 10 mM di MgCl2.
    3. Scaldare la miscela di reazione in un bagno metallico a 100 °C per 1 min, quindi trasferirla immediatamente a 72 °C per 10 min18.
      NOTA: Il substrato finale del DNA è lungo 80 nucleotidi. L'elevata temperatura iniziale (100 °C) garantisce la denaturazione, mentre la temperatura di ricottura (72 °C) favorisce un accoppiamento accurato dei trefoli.
    4. Spegnere la fonte di calore e lasciare raffreddare gradualmente la soluzione a temperatura ambiente, formando il substrato completo di DNA a doppio filamento.
  2. Saggio del substrato del DNA marcato con TAMBRA
    1. Preparare un gel di poliacrilammide denaturante al 12% mescolando 4,8 ml di acrilammide al 30% (29:1), 4,32 ml di urea 6 M, 2,4 ml di 5× TBE, 50 μl di APS al 10%, 5 μl di TEMED e 0,48 ml di acqua deionizzata. Mescolare accuratamente per preparare il gel.
    2. Mettere il gel in forno a 37 °C per 30 minuti a solidificare.
    3. Per la rilevazione, pipettare 2 μl del substrato di DNA sintetizzato in 18 μl di acqua distillata e aggiungere 7,7 μl di tampone di arresto.
    4. Come riferimento, pipettare 2 μl di D1 marcato TAMBRA in 18 μl di acqua distillata e aggiungere 7,7 μl di tampone stop.
    5. Caricare 20 μl di ciascun campione preparato sul gel ed eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE per analizzare la formazione del substrato di DNA.

3. Saggio dell'attività nucleasica della FEN1

  1. Saggio dell'attività enzimatica FEN1
    1. Preparare 20 μl di miscela di reazione combinando 2 μl di substrato di DNA con la nucleasi FEN1 nel tampone di reazione.
      NOTA: Il tampone di reazione è costituito da 100 mM di Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM di MgCl2, 2 mM di DTT, 0,2 mg/mL di BSA e acqua deionizzata.
    2. Incubare la miscela di reazione a 37 °C in un bagno di metallo per 15 minuti.
    3. Terminare la reazione aggiungendo 20 μl di tampone di terminazione 2×.
    4. Caricare 20 μl del campione reagito su un gel di poliacrilammide denaturante al 12% pre-preparato ed eseguire l'elettroforesi a 100 V per 60 minuti.
    5. Dopo l'elettroforesi, visualizzare i risultati utilizzando un sistema di imaging a fluorescenza (percorso 600).

4. Screening di inibitori di piccole molecole della nucleasi FEN1

  1. Screening di inibitori di piccole molecole
    1. Utilizzare una pipetta per trasferire 2 μl di dimetilsolfossido (DMSO) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Aggiungere 2 μl di nucleasi FEN1 e 10 μl di tampone di reazione 2× alla provetta.
    3. Mescolare accuratamente e incubare la miscela con ghiaccio per 10 minuti.
    4. Aggiungere 2 μL di substrato di DNA e 4 μL di acqua deionizzata, quindi mescolare accuratamente per portare il volume totale di reazione a 20 μL.
    5. Preparare una diluizione operativa dell'inibitore della nucleasi FEN1, FEN1-IN-4, eseguendo una diluizione seriale doppia di una soluzione madre 1 M in DMSO.
    6. Pipettare 2 μL di nucleasi FEN1 (0,03 μg/μL) e 2 μL di inibitore FEN1-IN-4 diluito in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 10 μl di tampone di reazione 2× e 4 μl di acqua deionizzata. Mescolare delicatamente e incubare con ghiaccio per 10 minuti per garantire un'interazione sufficiente tra l'inibitore e l'enzima.
    7. Aggiungere 2 μl di substrato di DNA alla provetta per formare una miscela di reazione finale da 20 μl.
    8. Incubare la reazione a 37 °C in un bagno metallico per 15 minuti.
    9. Terminare la reazione aggiungendo 20 μl di tampone di terminazione 2×.

5. Valutazione della potenza inibitoria dell'inibitore di piccole molecole FEN1--IN-4

  1. Utilizzare una micropipetta per prelevare 10 μl di tampone di reazione 2× e aggiungerlo a una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Aggiungere 2 μL di nucleasi FEN1 a una concentrazione di 0,03 μg/μL, nonché 2 μL di inibitore FEN1-IN-4 a diverse concentrazioni.
    NOTA: Gradienti di concentrazione multipli devono essere stabiliti in base ai requisiti sperimentali.
  3. Aggiungere 4 μL di acqua deionizzata e mescolare accuratamente la soluzione. Posizionare la provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio e incubare per 10 minuti.
  4. Aggiungere 2 μl di substrato di DNA a doppio filamento alla provetta per formare un sistema di reazione da 20 μl.
  5. Immergere la provetta EP in un bagno metallico a 37 °C per 15 minuti.
  6. Al termine della reazione, aggiungere 20 μl di tampone di arresto al 2× alla miscela di reazione per terminare la reazione.
  7. Osservare i risultati utilizzando un dispositivo di imaging a fluorescenza e tracciare la curva IC50 19.
    NOTA: La quantificazione dell'intensità della fluorescenza è stata eseguita utilizzando Fiji/ImageJ20, seguita dall'analisi statistica e dalla visualizzazione con il software di grafica e analisi21.

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Risultati

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Come mostrato nella Figura 2A, il reagente di colorazione si lega alla proteina, facendo apparire la proteina come una banda blu sul gel. La prima corsia contiene la proteina marcata utilizzata come riferimento per il peso molecolare, in cui la banda proteica standard BSA corrisponde a un peso molecolare di 70 kDa, e la banda proteica dell'acido nucleico FEN1 corrisponde a un peso molecolare di 45 kDa. I risultati sperimentali hanno mostrato che la nucleasi FEN1 appariva come una banda chiar...

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Discussione

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Il saggio dell'attività nucleasica della FEN1 e lo screening degli inibitori di piccole molecole sono fondamentali per la ricerca sulla riparazione dei danni al DNA e sullo sviluppo del cancro. Rispetto alle tradizionali tecniche di radiomarcatura, il metodo attuale offre un'alternativa economica, efficiente, facile da usare e più sicura. Inoltre, a differenza dei saggi FEN1 basati su burst di fluorescenza, questo approccio fornisce una visualizzazione più intuitiva della scissione del s...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal team di ricerca innovativa dell'istituto di istruzione superiore di Jiangsu per la scienza e la tecnologia (2021), dal programma del Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center (2023), dal programma tecnologico chiave dei progetti tecnologici per il sostentamento del popolo di Suzhou (SYWD2024099), dal progetto del laboratorio chiave statale di medicina e protezione dalle radiazioni, dall'Università di Soochow (GZK12023013), dai programmi del Suzhou Vocational Health College (SZWZYTD202201, SZWZYTD202205) e il progetto Qing-Lan della provincia di Jiangsu in Cina (2021, 2022).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 M Tris-HCLBeyotimeST774
30% Acr-Bis (29:1)BeyotimeST003-500ml
5M NaclBeyotimeST347
BeyoBlue PlusBeyotimeP0003S
BL21(DE3)-FEN1VazymeC504-F1
BSABeyotimeP0007
Agitatore decoloranteKylin-CampanaTS-100
DL-ditiotreitoloBeyotimeST041
Incubatrice per bagno seccoRUICHENGDH200
Apparecchio per elettroforesiBei jing Liuyi BiotecnologiaDDY-6D
FEN1-IN-4BersaglioMOLT8545
IPTGTakaba9030
Granita di KanamicinaBiosharpBS152
Centrifuga da laboratorioTermoSL 16R
LB BrodoDistretto di SolarbioL8291
Ni-NTA La Sua Resina Legante7SE BIOTECNOLOGIEPANF001-001C
Odissea FCODISSEALI-COR
PAGINA SDSBeyotimeP0015L
Trizione-x-100ShyuanyeS15022

Riferimenti

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