Il flusso di lavoro ottimizzato per lo sbiancamento iterativo estende l'imaging multiplex di campioni clinici altamente autofluorescenti

Summary

L'implementazione di una tecnica di fotoirradiazione versatile e a basso costo con il metodo IBEX manuale consente un imaging ottimale del tessuto umano con una significativa autofluorescenza nativa. Questo protocollo descrive in dettaglio come ottenere immagini multiplexate di vetrini interi da campioni clinici archiviati utilizzando un microscopio invertito, reagenti ampiamente disponibili e software open source per l'allineamento e l'elaborazione delle immagini.

Abstract

La prevalenza della malattia polmonare dovuta a micobatteri non tubercolari (NTM) è in aumento a livello globale. Sebbene la malattia polmonare indotta da NTM si presenti spesso con bronchiectasie, noduli polmonari e malattia cavitaria, la risposta dell'ospite associata a questi distinti modelli di danno polmonare non è stata ben caratterizzata in situ. Abbiamo cercato di valutare i meccanismi della patologia indotta da NTM eseguendo un'analisi fenotipica approfondita delle popolazioni di cellule immunitarie nel tessuto polmonare di individui con malattia NTM rispetto a un gold standard di infiammazione granulomatosa, malattia polmonare tubercolare (TB).

I blocchi polmonari fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) di pazienti con NTM disseminata, NTM polmonare o TBC polmonare sono stati sezionati e colorati seguendo una versione modificata del metodo di imaging IBEX (Iterative Bleaching Extends multi-pleXity). L'ottimizzazione del metodo IBEX è stata inizialmente necessaria per affrontare la significativa fluorescenza endogena delle sezioni polmonari dovuta all'elevata densità di collagene, elastina ed eritrociti nativi del tessuto polmonare che è peggiorata dalla conservazione della FFPE e dall'età dei blocchi FFPE. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio un protocollo di fotoirradiazione e un metodo di recupero dell'antigene modificato che riduce l'autofluorescenza dei campioni clinicamente archiviati.

Inoltre, forniamo indicazioni sulla progettazione di pannelli di anticorpi, comprese le sfide comuni come la reattività crociata, la perdita di epitopi a seguito di fotoirradiazione, la sovrapposizione spettrale tra fluorofori adiacenti e il basso rapporto segnale/rumore per determinati target. Per facilitare l'imaging efficiente di intere sezioni di tessuto polmonare, i vetrini sono stati ripresi con un microscopio a campo largo e post-elaborati con software open source per migliorare la qualità dell'immagine. Insieme, questo flusso di lavoro risponde a un'esigenza critica documentando come ottenere immagini altamente multiplexate e ad alta risoluzione di vetrini interi da campioni complessi utilizzando strumentazione e reagenti ampiamente disponibili. Oltre all'imaging quantitativo di campioni clinici, queste tecniche possono essere applicate a diversi tipi di campioni per superare le fonti di fluorescenza sia endogene che esogene.

Introduction

La tubercolosi (TBC) è una delle principali cause di morte, con circa 1,3 milioni di persone che muoiono^{ogni anno a} causa dell'infezione da TBC. Sebbene non sia letale come la tubercolosi, negli ultimi anni c'è stato un aumento significativo delle infezioni polmonari e della conseguente malattia causata da micobatteri non tubercolari (NTM)². A livello tissutale, la risposta immunitaria dell'ospite all'infezione polmonare da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è stata ben studiata e comprende la formazione di granulomi, aggregati eterogenei di linfociti, cellule dendritiche, macrofa....

Protocol

Le sezioni di tessuto polmonare archiviate per l'autopsia e la resezione chirurgica sono state raccolte secondo il protocollo 09-H-0172 (NCT00943514), Storia naturale delle bronchiectasie, presso il Laboratorio di Patologia del National Institutes of Health Clinical Center. Questo protocollo è stato approvato dall'IRB e i partecipanti hanno fornito il consenso informato.

1. Recupero automatizzato dell'antigene

NOTA: La deparaffinazione e il recupero dell'antigene sono stati eseguiti utilizzando una piattaforma di colorazione di ricerca automatizzata (Figura....

Results

La progettazione di un pannello di imaging multiplex basato su anticorpi richiede tempo, impegno e risorse significativi¹². Queste sfide sono particolarmente evidenti quando si progetta un pannello per campioni FFPE archiviati da tessuti altamente autofluorescenti, come descritto qui (Figura 1). Per superare queste sfide, abbiamo prima identificato i fluorofori più luminosi compatibili con il nostro protocollo di inattivazione del colorante (Tabella 1.......

Discussion

La patologia polmonare clinica da tubercolosi polmonare è caratterizzata da infiammazione granulomatosa necrotizzante. La patologia polmonare NTM si verifica principalmente in due popolazioni di pazienti distinte con due modelli patologici separati: danno polmonare isolato caratterizzato da infiammazione granulomatosa con obliterazione bronchiolare e formazione di cavità in individui immunocompetenti, o malattia nodulare diffusa che colpisce i polmoni e altri organi in individui immunode.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,3% Tritone-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Soluzione per il blocco del buffer
1% BSA	Sigma-Aldrich	Codice: A4503	Soluzione per il blocco del buffer
1% Blocco BD Fc umano	BD Bioscienze	564220	Blocco Fc necessario per il blocco del buffer
Lampada LED da 150 W	Amazzone	B07VH3CVSF	Sorgente luminosa a LED per fotoirraggiamento tissutale
1x PBS	Gibco	10010-023	Soluzione per il blocco delle fasi di tampone e lavaggio
Contenitore di stoccaggio da 20 galloni	Amazzone	B001B1C4G0	Contenitore per il processo di fotoirraggiamento
Lampada LED RGBW da 40 W	Amazzone	B08QFPJSMD	Sorgente luminosa RGB per fotoirraggiamento tissutale
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Alfa-actina muscolare liscia DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Kit di blocco Avidin/Biotina	Abcam	ab64212	Soluzione bloccante di avidina e biotina
BD Cytofix/Cytoperm	BD Bioscienze	554714	Soluzione di fissaggio
Soluzione di decera BOND	Leica Biosystems	NC0221076	Soluzione di deparaffinazione
Soluzione per il recupero degli epitopi BOND 1	Leica Biosystems	NC0235529	Soluzione di recupero dell'epitopo a base di citrato pH 6 (ER1)
Soluzione per il recupero degli epitopi BOND 2	Leica Biosystems	NC0235530	Soluzione per il recupero di epitopi a base di EDTA a pH 9 (ER2)
Sistema di rilevamento BOND Research	Leica Biosystems	NC0396648	Reagente di colorazione per ricerca automatizzato
Coloratore di ricerca BOND RX	Leica Biosystems	NA	Piattaforma automatizzata di colorazione per la ricerca
Soluzione di lavaggio BOND	Leica Biosystems	NC0221077	Tampone di lavaggio
CD15	BD Bioscienze	Codice 347420/AB_400298	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientifico	50-0202-82/AB_11150959	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD4 Alexa Fluor 488	R& Sistemi D	FAB8165G/AB_2728839	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD45 Ficoeritrina (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE/NA	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD68 iFluor 594	Caprico Biotecnologie	1064135/AB_2892745	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-capra IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientifico	A32814/AB_2762838	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-topo IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientifico	A32787/ AB_2762830	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-topo IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020/AB_2340844	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-coniglio IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientifico	A32794/AB_2762834	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Sistema di colorazione EasyDip	Rifornimento per nuovi arrivati	5300KIT	Sistema di colorazione dei vetrini
Fluoromount-G	Thermo Fisher Scientifico	00-4958-02	Supporti di montaggio
Hoechst	Biozio	40046	Colorazione nucleare per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Convertitore di file Imaris x64 10.2.0	Imaris Oxford Strumenti		Convertitore di file gratuito
ImarisViewer software x64 10.2.0	Imaris Oxford Strumenti		Software gratuito per l'elaborazione delle immagini
Penna ImmEdge	Laboratori Vector	H-4000	Penna barriera idrofobica
Boroidruro di litio (1 grammo)	Prodotti chimici STREM	93-0397	Sostanza chimica per l'inattivazione del colorante, acquistare piccole aliquote di questa sostanza chimica (1 grammo)
Biotina Lumican	R& Sistemi D	BAF2846	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Occhiali Micro Cover	VWR	48393-241	Coperture per vetrini
Pan-citocheratina Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750/AB_2868569	Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Sistema a microonde PELCO BioWave Pro	Ted Pella Inc	36500-230	Microonde scientifico non riscaldante
PELCO SteadyTemp Pro	Ted Pella Inc	50062	Controllo della temperatura completamente automatizzato per microonde scientifiche
SimpleITK	Software open source		Software di registrazione ed elaborazione dei canali
Streptavidina Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientifico	Episodio 11227	Reagente di marcatura per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Microscopio a campo largo	Leica Microsystems	NA	Leica Microsystems THUNDER imager con sorgente luminosa LED8 e software LAS X (3.7.1.21655). Per l'imaging a fluorescenza, è stato utilizzato un filtro quad-band personalizzato con ruota portafiltri esterna (PN: 11536075) con due filtri a banda singola aggiuntivi (PN: 8118215) per visualizzare sette canali di colorante per passaggio. Le linee di eccitazione, dicroica ed emissione del filtro sono (1) cubo Quad-Band: dicroico a 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, senza filtri di eccitazione o di emissione; (2) ruota portafiltri esterna posizione 1: 434/32, posizione 2: 520/40, posizione 3: 585/20, posizione 4: 720/60, posizione 5: passante; (3) 1 banda singola— 585/22 eccitazione, 594 dicroica, 625/30 emissione; (4) banda singola 2— 635/20 eccitazione, 647 dicroica, 667/30 emissione.
Zeiss Detergente per lenti ottiche	Amazzone	B00GPVQVCO	Detergente per lenti per obiettivi per microscopi
Anticorpi
Ag85B	Abcam	ab43019	IgG policlonali di coniglio, ciclo 1
Alfa-actina muscolare liscia DyLight 755	Novus Biologicals	NBP2-345221R	1A4/asm-1, ciclo 1
CD4 Alexa Fluor 488	R& Sistemi D	FAB8165G	IgG policlonali di capra, ciclo 1
CD8 Alexa Fluor 647	BioLeggenda	372906	C8/144B, ciclo 1
CD68 iFluor 594	Caprico Biotecnologie	1064135	KP1, ciclo 1
Asino anti-capra IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientifico	Codice A32814	Asino policlonale, ciclo 1
Asino anti-topo IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A32787	Asino policlonale, ciclo 1
Asino anti-coniglio IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Scientifico	Codice: A32794	Asino policlonale, ciclo 1
Hoechst	Biozio	40046	Marcatura nucleare, ciclo 1
CD15	BD Bioscienze	347420	MMA, ciclo 2
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientifico	50-0202-82	L26, ciclo 2
CD45 Ficoeritrina (PE)	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	2B11 + PD7/26, ciclo 2
Asino anti-topo IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020	Asino policlonale, ciclo 2
Biotina Lumican	R& Sistemi D	BAF2846	IgG policlonali di capra, ciclo 2
Pan-citocheratina Alexa Fluor 750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	AE-1/AE-3, ciclo 2
Streptavidina Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientifico	Episodio 11227	N/D, ciclo 2
Hoechst	Biozio	40046	ciclo 2
Soluzioni
Blocking Buffer (Ciclo 1)
Tritone-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	0,3% in volume
BSA	Sigma-Aldrich	Codice: A4503	1% in volume
Blocco Fc BD umano	BD Bioscienze	564220	1% in volume
1x PBS	Gibco	10010-023	97,7% in volume
Soluzione colorante per anticorpi primari #1 (Ciclo 1)
Buffer di blocco (ciclo 1)	Vedi sopra		Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
Hoechst	Biozio	40046	1:5000
CD8 AF647	BioLeggenda	372906	1:10
Soluzione colorante con anticorpi primari #2 (Ciclo 1)
Buffer di blocco (ciclo 1)	Vedi sopra		Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
CD4  AF488	R& Sistemi D	FAB8165G	1:10
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	1:100
Soluzione colorante con anticorpi secondari #1 (Ciclo 1)
Buffer di blocco (ciclo 1)	Vedi sopra		Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
Asino Anti-Capra AF Plus 488	Thermo Fisher Scientifico	A32814/AB_2762838	1:100
Asino anti-Coniglio AF Plus 555	Thermo Fisher Scientifico	A32794/AB_2762834	1:100
Asino anti-Topo AF Plus 647	Thermo Fisher Scientifico	A32787/AB_2762830	1:50
Soluzione colorante per anticorpi primari #3 (Ciclo 1)
Buffer di blocco (ciclo 1)	Vedi sopra		Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
CD68 iF594	Caprico Biotecnologie	1064135	1:10
a-SMA DL755	Novus Biologicals	NBP2-345221R/NA	1:30
Tampone di blocco senza BSA (ciclo 2)
Tritone-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	0,3% in volume
Blocco Fc BD umano	BD Bioscienze	564220	1% in volume
1x PBS	Gibco	10010-023	98,7% in volume
Soluzione colorante con anticorpi primari #4 (ciclo 2)
Buffer di blocco senza BSA (ciclo 2)	Vedi sopra		Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
CD15	BD Bioscienze	347420	1:30
Biotina Lumican	R& Sistemi D	BAF2846	1:100
CD45 PE	Novus Biologicals	NBP2-34528PE	1:20
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Scientifico	50-0202-82	1:10
Pan-citocheratina AF750	Novus Biologicals	NBP2-33200AF750	1:10
Soluzione di colorazione anticorpale secondaria #2 (Ciclo 2)
Buffer di blocco senza BSA (ciclo 2)	Vedi sopra		Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
Asino anti-Topo IgM AF488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020/AB_2340844	1:100
Strepavidina AF594	Thermo Fisher Scientifico	Episodio 11227	1:200