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Articolo metodologico

Il flusso di lavoro ottimizzato per lo sbiancamento iterativo estende l'imaging multiplex di campioni clinici altamente autofluorescenti

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DOI:

10.3791/67980

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11 luglio 2025

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1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

L'implementazione di una tecnica di fotoirradiazione versatile e a basso costo con il metodo IBEX manuale consente un imaging ottimale del tessuto umano con una significativa autofluorescenza nativa. Questo protocollo descrive in dettaglio come ottenere immagini multiplexate di vetrini interi da campioni clinici archiviati utilizzando un microscopio invertito, reagenti ampiamente disponibili e software open source per l'allineamento e l'elaborazione delle immagini.

Abstract

La prevalenza della malattia polmonare dovuta a micobatteri non tubercolari (NTM) è in aumento a livello globale. Sebbene la malattia polmonare indotta da NTM si presenti spesso con bronchiectasie, noduli polmonari e malattia cavitaria, la risposta dell'ospite associata a questi distinti modelli di danno polmonare non è stata ben caratterizzata in situ. Abbiamo cercato di valutare i meccanismi della patologia indotta da NTM eseguendo un'analisi fenotipica approfondita delle popolazioni di cellule immunitarie nel tessuto polmonare di individui con malattia NTM rispetto a un gold standard di infiammazione granulomatosa, malattia polmonare tubercolare (TB).

I blocchi polmonari fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) di pazienti con NTM disseminata, NTM polmonare o TBC polmonare sono stati sezionati e colorati seguendo una versione modificata del metodo di imaging IBEX (Iterative Bleaching Extends multi-pleXity). L'ottimizzazione del metodo IBEX è stata inizialmente necessaria per affrontare la significativa fluorescenza endogena delle sezioni polmonari dovuta all'elevata densità di collagene, elastina ed eritrociti nativi del tessuto polmonare che è peggiorata dalla conservazione della FFPE e dall'età dei blocchi FFPE. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio un protocollo di fotoirradiazione e un metodo di recupero dell'antigene modificato che riduce l'autofluorescenza dei campioni clinicamente archiviati.

Inoltre, forniamo indicazioni sulla progettazione di pannelli di anticorpi, comprese le sfide comuni come la reattività crociata, la perdita di epitopi a seguito di fotoirradiazione, la sovrapposizione spettrale tra fluorofori adiacenti e il basso rapporto segnale/rumore per determinati target. Per facilitare l'imaging efficiente di intere sezioni di tessuto polmonare, i vetrini sono stati ripresi con un microscopio a campo largo e post-elaborati con software open source per migliorare la qualità dell'immagine. Insieme, questo flusso di lavoro risponde a un'esigenza critica documentando come ottenere immagini altamente multiplexate e ad alta risoluzione di vetrini interi da campioni complessi utilizzando strumentazione e reagenti ampiamente disponibili. Oltre all'imaging quantitativo di campioni clinici, queste tecniche possono essere applicate a diversi tipi di campioni per superare le fonti di fluorescenza sia endogene che esogene.

Introduzione

La tubercolosi (TBC) è una delle principali cause di morte, con circa 1,3 milioni di persone che muoionoogni anno a causa dell'infezione da TBC. Sebbene non sia letale come la tubercolosi, negli ultimi anni c'è stato un aumento significativo delle infezioni polmonari e della conseguente malattia causata da micobatteri non tubercolari (NTM)2. A livello tissutale, la risposta immunitaria dell'ospite all'infezione polmonare da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è stata ben studiata e comprende la formazione di granulomi, aggregati eterogenei di linfociti, cellule dendritiche, macrofagi e neutrofili3. Sebbene l'infiammazione granulomatosa sia anche una caratteristica fondamentale dell'immunità dell'ospite all'infezione da NTM, le popolazioni di cellule immunitarie e le caratteristiche spaziali di questa risposta rimangono poco studiate. Ottenere una comprensione dettagliata delle componenti tissutali dell'immunopatologia rispetto alla guarigione delle ferite è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti (ad esempio, terapie dirette all'ospite) e strategie terapeutiche preventive (ad esempio, vaccini).

In questo studio, il nostro team ha avuto accesso a rari campioni clinici archiviati acquisiti durante resezioni polmonari o autopsie da pazienti con infezione da Mtb o NTM. La maggior parte di questi campioni aveva più di 10 anni ed era conservata come campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE), limitandone l'uso ai test istologici. Per superare i limiti dei marcatori dell'imaging tradizionale con immunoistochimica (IHC) e immunofluorescenza (IF), abbiamo utilizzato il metodo IBEX (Iterative Bleaching Extends multi-pleXity), un metodo di imaging open source altamente multiplexato 4,5. L'estensione del metodo IBEX ai campioni di FFPE polmonari umani ha richiesto un'ottimizzazione significativa a causa degli elevati livelli di fluorescenza endogena, un ostacolo ben descritto per l'imaging multiplex basato su anticorpi6.

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per ridurre l'autofluorescenza utilizzando un metodo di fotoirradiazione ottimizzato per sezioni di tessuto FFPE polmonare 7,8. È importante sottolineare che il metodo qui descritto utilizza una scatola luminosa economica e ampiamente disponibile che può essere estesa ad altre preparazioni di campioni con elevata autofluorescenza. Oltre a ridurre l'autofluorescenza prima dell'acquisizione dell'immagine, forniamo indicazioni sulla progettazione del pannello anticorpale, come l'abbinamento di marcatori a bassa abbondanza con etichette fluorescenti luminose, la valutazione dell'impatto della fotoirradiazione sulla marcatura degli anticorpi e l'amplificazione con anticorpi secondari in canali con elevata fluorescenza endogena. In media, sono stati elaborati cinque vetrini corrispondenti a una sezione di tessuto, ciascuno dei quali va da 37 a 114 mm2. Infine, dimostriamo come acquisire immagini di vetrini interi utilizzando uno strumento a campo largo. In sintesi, questo protocollo descrive l'adozione di IBEX per i campioni clinici archiviati e offre inoltre una guida su come risolvere i problemi comunemente riscontrati con l'imaging di campioni altamente autofluorescenti.

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Protocollo

Le sezioni di tessuto polmonare archiviate per l'autopsia e la resezione chirurgica sono state raccolte secondo il protocollo 09-H-0172 (NCT00943514), Storia naturale delle bronchiectasie, presso il Laboratorio di Patologia del National Institutes of Health Clinical Center. Questo protocollo è stato approvato dall'IRB e i partecipanti hanno fornito il consenso informato.

1. Recupero automatizzato dell'antigene

NOTA: La deparaffinazione e il recupero dell'antigene sono stati eseguiti utilizzando una piattaforma di colorazione di ricerca automatizzata (Figura 1). Lavori precedenti hanno stabilito che un approccio di recupero dell'antigene duale costituito da 30 minuti con una soluzione di recupero dell'epitopo a pH 6 a base di citrato (ER1) e poi 30 minuti con una soluzione di recupero dell'epitopo a pH 9 a base di EDTA (ER2) ha prodotto i migliori risultati di immunomarcatura per i tessuti FFPE9. Risultati comparabili possono essere ottenuti utilizzando la deceratura manuale e il recupero del doppio antigene utilizzando altri metodi descritti e il supporto fornito dalla IBEX Imaging Community10,11.

  1. Raccogli i vetrini e le forniture automatizzate per il recupero dell'antigene (coperchi dei vetrini, sistema di rilevamento della ricerca, soluzione per il recupero degli epitopi a base di pH 6 a base di citrato (ER1), soluzione per il recupero degli epitopi a base di EDTA a pH 9 (ER2), ecc.).
  2. Accendere lo strumento, lasciarlo inizializzare per 20 minuti, posizionare il braccio di rilevamento della ricerca nello strumento e inserire i contenitori dei reagenti nella parte inferiore della macchina.
  3. Aprire il software, fare clic su Impostazione diapositiva e selezionare Aggiungi studio e creare un nuovo nome per lo studio.
  4. Seleziona Aggiungi diapositiva ed etichetta le diapositive come desiderato.
  5. Per seguire questo protocollo, eseguire un protocollo di cottura e deceratura con un protocollo HIER composto da 30 minuti di ER1 e 30 minuti di ER2.
  6. Stampa le etichette e posizionale sopra le diapositive. Rimuovere il rack nero per vetrini dallo strumento e posizionare i vetrini di interesse sul rack. Posizionare i coperchi trasparenti dei vetrini su ciascun vetrino, riposizionare il rack dei vetrini nello strumento e premere il pulsante sotto il rack per richiedere allo strumento di eseguire la scansione dei codici a barre dei vetrini.
  7. Seleziona play | ok e lascia che il prelievo automatico dell'antigene inizi con una durata approssimativa di 3 ore.

2. Marcatura degli anticorpi prima della fotoirradiazione

  1. Al termine del recupero dell'antigene, immergere i vetrini nel PBS.
    NOTA: Alcuni epitopi sono sensibili alla fotoirradiazione e si degradano dopo l'esposizione notturna al LED. Gli epitopi sensibili devono essere determinati empiricamente e, una volta scoperti, l'immunomarcatura di questi epitopi dovrebbe avvenire in questa fase. Assicurarsi che il vetrino rimanga sempre bagnato dopo il recupero dell'antigene.
  2. Rimuovere un vetrino dal PBS e asciugare tutto il PBS in eccesso sul vetrino utilizzando un panno privo di lanugine; Fare attenzione a non toccare il fazzoletto. Disegna un bordo attorno al tessuto con una penna idrofoba. Ripetere la procedura per tutte le diapositive rimanenti. Lasciare asciugare la barriera idrofobica per 10 minuti.
  3. Preparare una camera di umidità a vetrino mettendo una piccola quantità d'acqua sul fondo di ogni pozzetto. Posizionare i vetrini nella camera di umidità del vetrino. Eliminare il PBS dal tessuto senza toccare direttamente il campione di tessuto.
  4. Aggiungere 200 μl di tampone di blocco (Tabella dei materiali) a ciascun vetrino. Posizionare la camera di umidità a vetrino in un forno a microonde scientifico non riscaldante con un meccanismo per mantenere una temperatura costante.
  5. Bloccare la marcatura degli anticorpi non specifici eseguendo il seguente programma stabilito in precedenza4: programma 2-1-2-1-2-1-2-1-2, dove "2" indica 2 minuti a 100 W e "1" indica 1 minuto a 0 W. Eseguire il programma di cui sopra una volta per il blocco. Se questo strumento non è disponibile, bloccare le sezioni di tessuto (5-10 μm) per 1 ora a 37 °C come descritto in precedenza5.
  6. Creare la soluzione di colorazione primaria dell'anticorpo #1 (Ciclo 1) (Tabella dei materiali) durante l'incubazione del tampone di blocco. Preparare le miscele di anticorpi secondo la tabella dei materiali. Mescolare delicatamente il cocktail di anticorpi e centrifugare la miscela di anticorpi con una mini centrifuga a 2.680 × g per 30 s.
    NOTA: Questa soluzione colorante contiene una diluizione di Hoechst 1:5000 che dovrebbe essere sufficiente per la durata dell'esperimento a due cicli. Gli utenti potrebbero dover titolare Hoechst e altri anticorpi per ottenere risultati ottimali per i loro tessuti e la configurazione di imaging.
  7. Al termine del ciclo, rimuovere la camera di umidità a vetrino dal microonde e rimuovere la soluzione tampone bloccante da ciascun tessuto. Aggiungere 200 μl di soluzione di colorazione primaria per anticorpi #1 (ciclo 1) (tabella dei materiali) a ciascun vetrino. Riposizionare la camera con i vetrini nel microonde ed eseguire il programma di anticorpi primari per circa 30 minuti: eseguire due volte il programma 2-1-2-1-2-1-2-1-2 per la marcatura degli anticorpi primari.
    NOTA: In questo caso, 200 μL di soluzione di anticorpi primari sono una stima. Utilizzare un volume adeguato di soluzione per coprire l'intera superficie della sezione di tessuto.
  8. Una volta completata la fase di marcatura degli anticorpi primari, lavare ogni vetrino con 1.000 μl di PBS inclinandolo verticalmente, pipettando il PBS sul tessuto e lasciando defluire il PBS. Ripeti questo passaggio 3-5 volte.
  9. Eliminare il PBS in eccesso e fissare i vetrini con paraformaldeide (PFA) all'1% per 10 minuti a temperatura ambiente nella camera di umidità.
    NOTA: La fissazione del PFA può mascherare gli epitopi, impedendo agli anticorpi di legarsi ai bersagli previsti. Quando si stabilisce un pannello di anticorpi per la prima volta, si consiglia di valutare l'impatto di una fissazione delicata (1% di PFA per 10 minuti) confrontando il modello di marcatura delle sezioni di tessuto trattate con o senza fissativo prima dell'immunomarcatura. Se un anticorpo è sensibile alla fissazione del PFA all'1%, spostare questo anticorpo prima della fase di postfissazione.
  10. Lavare accuratamente i vetrini con 1.000 μl di PBS 3-5x. Lasciare il PBS sul tessuto fino alla fase di fotoirradiazione.

3. Fotoirradiazione tissutale

  1. Per preparare la scatola di fotoirradiazione (Figura 2), procurarsi una lampada LED da 150 W, una lampada LED RGBW da 40 W, un grande contenitore di plastica (volume di 20 galloni [75,71 L] o più), 1x PBS fresco e una capsula di Petri.
  2. Posizionare la capsula di Petri al centro della lampada da 150 W e riempirla con 1x PBS. Usa un volume sufficiente per immergere le diapositive in PBS. Eseguire il processo di fotoirradiazione nella cella frigorifera per ridurre al minimo la generazione di calore dalle lampade.
  3. Rimuovere i vetrini dalla camera di umidità dei vetrini e metterli in una capsula di Petri, assicurandosi che tutti i vetrini siano immersi nel PBS.
  4. Posizionare la lampada da 40 W direttamente sopra la capsula di Petri con la sorgente luminosa rivolta verso i vetrini. Assicurarsi che la lampada da 40 W sia impostata sull'impostazione della luce rossa prima del posizionamento.
  5. Accendi entrambe le lampade da 150 W e 40 W. Coprire l'impianto di fotoirradiazione con il coperchio del contenitore di plastica. Mantenere la lampada da 40 W sull'impostazione della luce rossa per 2 ore, quindi passare all'impostazione della luce verde tramite il telecomando incluso per le restanti 16 ore.
    NOTA: È imperativo eseguire la fotoirradiazione a circa 4 °C per evitare distorsioni di calore indesiderate del tessuto del vetrino. Punto di pausa: la fotoirradiazione può essere eseguita durante la notte e il protocollo può essere ripreso la mattina seguente.

4. Marcatura degli anticorpi dopo la fotoirradiazione

  1. Rimuovere i vetrini dalla capsula di Petri e immergerli in 1x PBS in un barattolo Coplin, una provetta conica da 50 ml o un secchio dal sistema di colorazione dei vetrini. Preparare la soluzione di colorazione primaria degli anticorpi #2 (Ciclo 1) (Tabella dei materiali) alle diluizioni consigliate (Tabella 1). Utilizzare 200 μl di soluzione per ogni vetrino.
  2. Eliminare il PBS in eccesso da ogni singolo vetrino con un panno privo di lanugine, assicurandosi di asciugare l'area intorno al tessuto senza toccare il tessuto stesso. Posizionare i vetrini nella camera di umidità del vetrino.
  3. Agitare delicatamente la soluzione di colorazione degli anticorpi primari #2 (ciclo 1) e aggiungere 200 μl a ciascun vetrino, assicurandosi che l'intero tessuto sia coperto.
  4. Posizionare la camera di umidità del vetrino con i vetrini nel microonde ed eseguire il programma degli anticorpi primari per circa 30 minuti come descritto al punto 2.7
  5. Durante la marcatura degli anticorpi primari, preparare la soluzione per la colorazione degli anticorpi secondari #1 (Ciclo 1) (Tabella dei materiali).
  6. Una volta completato il programma a microonde, rimuovere la camera di umidità del vetrino e lavare ogni vetrino 3-5 volte con 1.000 μl di 1x PBS.
  7. Eliminare il PBS in eccesso da ogni singolo vetrino con un panno privo di lanugine, agitare la soluzione di colorazione anticorpale secondaria e aggiungere 200 μl a ciascun vetrino.
  8. Posizionare la camera di umidità a vetrino nel microonde ed eseguire il programma di anticorpi secondari: un programma 2-1-2-1-2-1-2-1-2, dove "2" indica 2 minuti a 100 W e "1" indica 1 minuto a 0 W. Eseguire il programma di cui sopra una volta per la marcatura degli anticorpi secondari.
  9. Lavare accuratamente i vetrini 3-5 volte con 1 mL di 1x PBS e rimuovere il PBS in eccesso da ciascun vetrino.
  10. Aggiungere a ciascun vetrino la soluzione di colorazione primaria per anticorpi #3 (ciclo 1) contenente anticorpi direttamente coniugati. Eseguire la colorazione degli anticorpi utilizzando il microonde o un'alternativa (1 ora a 37 °C) come descritto al punto 2.7.
  11. Lavare nuovamente i vetrini 3-5 volte con 1 mL di 1x PBS e rimuovere accuratamente il PBS in eccesso da ciascun vetrino.
  12. Aggiungere 30 μl di terreno di montaggio direttamente su ciascuna sezione di tessuto e posizionare un vetrino coprioggetti che copra l'intera sezione di tessuto. Ispezionare lo scivolo per verificare la presenza di bolle d'aria e spingere le bolle d'aria sul perimetro dello scivolo con una leggera pressione. Ripetere il processo per le diapositive rimanenti.
  13. Rimuovere il supporto di montaggio in eccesso con un panno privo di lanugine e utilizzare un detergente per lenti ottiche per pulire eventuali residui rimasti sulla superficie del vetrino coprioggetti. Lasciare che tutti i vetrini si solidosino per 10-15 minuti a temperatura ambiente prima di eseguire l'acquisizione dell'immagine su un microscopio.

5. Configurazione al microscopio e acquisizione delle immagini

  1. Accendere il microscopio a campo largo e la sorgente luminosa LED8; Avvia il software. Seleziona l'obiettivo (in questo caso, un obiettivo secco 20x/0,8). Posizionare la telecamera in modalità a 16 bit nella scheda di configurazione . Selezionare i canali richiesti in base ai fluorofori presenti nei pannelli anticorpali (vedere la Tabella 1 per ulteriori indicazioni).
    NOTA: I seguenti passaggi sono specificati per il microscopio di riferimento. Potrebbe essere utilizzato un microscopio a campo largo equivalente con una sorgente luminosa comparabile e cubi filtranti per l'eccitazione e l'emissione di diversi fluorofori e un tavolino di precisione.
  2. Pulire il vetrino coprioggetti con un detergente per lenti e carta per lenti immediatamente prima dell'imaging. Ispezionare visivamente il vetrino coprioggetti e rimuovere la polvere o la lanugine dalla superficie prima dell'imaging. Posizionare saldamente il vetrino nell'angolo in alto a sinistra (o equivalente) dell'inserto del tavolino, in modo che il tessuto sia posizionato in modo coerente sul piano XY (fondamentale per l'allineamento delle immagini cicliche).
  3. Configurare le impostazioni di acquisizione creando un canale corrispondente a ciascun fluoroforo incluso nel pannello anticorpale. Selezionare il cubo del filtro e il LED corrispondenti per ogni fluoroforo. Regola l'intensità di ciascun LED e i tempi di esposizione per ciascun canale. Vedere la Tabella 1 per un elenco delle impostazioni dell'immagine utilizzate qui.
  4. Prima dell'acquisizione dell'immagine, selezionare il canale Hoechst e attivare l'ombreggiatura collegata. Utilizzare la procedura guidata Linked Shading per impostare questa opzione per l'obiettivo selezionato.
    NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire immagini di vetrini interi attraverso l'acquisizione di scansioni di piastrelle di grandi dimensioni. L'ombreggiatura collegata o la correzione dell'ombreggiatura sono necessarie per superare l'illuminazione irregolare nelle immagini affiancate.
  5. Nel software, fare clic sul pulsante Live per visualizzare il canale Hoechst. Utilizzare la manopola di messa a fuoco grossolana per mettere a fuoco la sezione di tessuto.
  6. Selezionare ciascun canale fluorescente e valutare la sezione di tessuto per il modello di colorazione previsto per tutti gli anticorpi marcati in fluorescenza nel ciclo.
  7. Selezionare Navigatore nel software. Utilizzando il canale di Hoechst e la funzione a spirale in Navigator, è possibile mappare l'intera sezione di tessuto o la regione di interesse da visualizzare. Se verranno visualizzate più sezioni di tessuto per vetrino, ripetere questo passaggio per creare una mappa del tessuto utilizzando Navigator.
  8. Identifica le ROI da visualizzare utilizzando il poligono, la bacchetta magica o altri strumenti di selezione delle ROI in Navigator. Disegna con cura il contorno del tessuto per catturare il minor numero di tessere necessarie per coprire le ROI desiderate. Elimina le tessere extra per ridurre il tempo totale di acquisizione.
  9. Una volta create le ROI, rivedi e regola le impostazioni dei canali per ridurre al minimo i pixel saturi e ottimizzare il rapporto segnale/rumore. Selezionare la tabella di ricerca della mappa di calore nella finestra di visualizzazione dell'immagine. I colori indicano il livello di riempimento dei pixel, mentre i rossi, gli arancioni, i gialli e i bianchi indicano variazioni di intensità più facili da vedere; I pixel blu indicano pixel saturi. Per evitare di perdere informazioni e compromettere la qualità dell'immagine, ridurre il tempo di esposizione per ridurre al minimo il numero di pixel saturi (blu).
  10. In Navigatore, utilizzare lo strumento Mappa di messa a fuoco per creare una mappa topografica del tessuto. Imposta un punto della mappa di messa a fuoco ogni 3-4 FOV per tessere grandi o campioni irregolari.
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale per le scansioni di piastrelle di grandi dimensioni necessarie per l'imaging di vetrini interi. In generale, la qualità dell'immagine scala con il numero di punti della mappa di messa a fuoco selezionati; Tuttavia, questo processo può richiedere molto tempo, soprattutto per le scansioni di piastrelle di grandi dimensioni.
    1. Creare i punti della mappa di messa a fuoco nell'ordine in cui verranno scansionati dal microscopio. Per far corrispondere l'ordine di scansione delle tessere del microscopio di riferimento, selezionare Punti mappa di messa a fuoco lungo un percorso a serpentina che corrisponda al percorso utilizzato dal microscopio.
    2. Impostare il primo punto della mappa di messa a fuoco utilizzando la messa a fuoco manuale. Utilizzare la messa a fuoco automatica per i restanti punti della mappa di messa a fuoco. Sedersi e osservare per assicurarsi che sia selezionata la messa a fuoco ottimale per ciascun punto della mappa di messa a fuoco. Regolare manualmente i punti della mappa di messa a fuoco in base alle esigenze. Aumentare l'intervallo utilizzato per trovare ciascun punto della mappa di messa a fuoco per tessuti irregolari e/o di grandi dimensioni.
  11. Impostare l'elaborazione utilizzando i seguenti parametri: Small Volume Computational Clearing (SVCC) con un indice di rifrazione (RI) impostato in modo che corrisponda al mezzo di montaggio (qui, 1,4); Intensità impostata su 98% e dimensione delle caratteristiche impostata su 2.000 nm per i marcatori a membrana o 3.000 nm per i marcatori nucleari. Eseguire il protocollo di cancellazione computazionale durante l'acquisizione dell'immagine.
  12. Avvia la scansione delle piastrelle. Annotare il numero del riquadro e mantenere costanti le ROI durante tutti i cicli.
  13. Dopo l'acquisizione dell'immagine, unire le immagini cancellate computazionalmente con Mosaic Merge che si trova nella scheda Processo , con l'opzione Smooth selezionata. Ispeziona visivamente ogni immagine per verificare la presenza di errori di cucitura e ripeti l'unione mosaico con nuovi parametri se sono presenti errori di affiancamento.
    NOTA: le immagini mal allineate impediranno la registrazione delle immagini acquisite in modo iterativo.
  14. Se necessario, utilizzare il modulo di separazione del colorante per compensare lo spillover spettrale tra i canali come descritto in precedenza5.

6. Cicli di inattivazione del colorante, marcatura degli anticorpi e acquisizione delle immagini

  1. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, immergere i vetrini in una provetta conica da 50 ml di PBS sterile 1x fino a quando i vetrini coprioggetti non cadono. Se il vetrino coprioggetti non cade, far scorrere il PBS direttamente sul vetrino o utilizzare una pinzetta per rimuovere delicatamente il vetrino coprioggetti.
  2. Preparare la soluzione di boroidruro di litio (LiBH4) misurando 3-5 mg di polvere in una navicella di plastica. Aggiungere diH2O in rapporto 1:1 direttamente alla polvere (ad es. 3,2 mg di LiBH4 e 3,2 mL di diH2O) e omogeneizzare la soluzione con una pipetta. Utilizzare una siringa per far passare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm in una provetta conica da 50 ml e registrare la concentrazione e l'ora esatta in cui la soluzione è stata creata. Lasciare incubare la soluzione a temperatura ambiente per 3-5 minuti fino a quando non si vedono grandi bolle in tutta la soluzione.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare la soluzione di inattivazione del colorante entro 4 ore dalla preparazione. ATTENZIONE: Eseguire i seguenti passaggi in una cappa chimica e utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati. Questa reazione può produrre idrogeno gassoso, che è altamente infiammabile. È importante lavorare sempre con piccole quantità di LiBH4 (<10 mg). Per ulteriori indicazioni, guarda i video tutorial su come preparare LiBH4 in modo sicuro sulla IBEX Knowledge-Base10,11.
    Sostituire il flaconcino di LiBH4 dopo 4 settimane di utilizzo a causa della ridotta efficacia dello sbiancamento dopo ripetute esposizioni all'aria. Si consiglia di acquistare piccole aliquote di LiBH4 (1 grammo).
  3. Rimuovere ogni vetrino dall'ammollo 1x PBS, rimuovere il PBS in eccesso con un panno privo di lanugine e posizionarlo nella camera di umidità del vetrino.
  4. Trattare ogni vetrino non vetrino con LiBH4 per 30 minuti pipettando la soluzione direttamente sul vetrino con un volume sufficiente a coprire il tessuto. Rimuovere la vecchia soluzione di LiBH4 da ogni vetrino e rinfrescare con una nuova aliquota di LiBH4 a 10 minuti e 20 minuti dalla stessa soluzione madre di LiBH4 .
  5. Lavare accuratamente i vetrini 3-5 volte con 1 PBS. Utilizzare sostituzioni rapide di PBS, immergendo le diapositive per 1 minuto per lavaggio.
  6. Per acquisire un'immagine per la sottrazione dello sfondo, posizionare un nuovo vetrino coprioggetti su ciascun vetrino come descritto nei passaggi 4.12-4.13 e acquisire immagini dell'inattivazione post-colorante del tessuto. Crea un nuovo progetto per l'immagine di sottrazione dello sfondo e ripeti i passaggi 5.2-5.14 per acquisire l'immagine. Immagine utilizzando lo stesso numero di tessere, canali, impostazioni dei canali e FOV stabiliti per l'immagine del ciclo 1. Mantieni i punti della mappa di messa a fuoco negli stessi campi visivi, ma usa la messa a fuoco automatica per regolare ogni punto della mappa di messa a fuoco per questa nuova immagine.
    NOTA: Utilizzare il canale che contiene il marcatore fiduciale ripetuto (Hoechst) per identificare le strutture uniche (forme nucleari) presenti nell'immagine "live" (immagine di sottrazione di sfondo, ad esempio) e nell'immagine precedente (ciclo 1).
  7. Per ridurre al minimo i segnali fluorescenti aspecifici degli anticorpi biotinilati nel secondo ciclo di anticorpi, eseguire il blocco dell'avidina e della biotina.
    1. Eliminare il PBS in eccesso e applicare la soluzione bloccante avidina su ogni vetrino a temperatura ambiente per 15 minuti.
    2. Lavare le diapositive 3-5 volte con 1 PBS e rimuovere il PBS in eccesso quando i lavaggi sono completati.
    3. Applicare la soluzione bloccante della biotina su ciascun vetrino a temperatura ambiente per 15 minuti e lavare i vetrini 3-5 volte con 1 PBS come al punto 6.7.2.
  8. Preparare un nuovo tampone di blocco esente da BSA (ciclo 2) (tabella dei materiali) per
    Soluzione di colorazione primaria degli anticorpi #4 (Ciclo 2) e Soluzione di colorazione degli anticorpi secondari #2 (Ciclo 2).
    NOTA: Queste soluzioni non richiedono albumina sierica bovina perché la BSA può compromettere la fase di blocco avidina/biotina.
  9. Diluire gli anticorpi primari alle concentrazioni raccomandate dal produttore nella soluzione di colorazione degli anticorpi primari #4 (ciclo 2). Agitare delicatamente questa soluzione e aggiungerla a ciascun vetrino all'interno della camera di umidità, assicurandosi che il tessuto sia completamente coperto con la soluzione di anticorpi primari. Posizionare la camera di umidità dei vetrini con i vetrini nel microonde ed eseguire il programma degli anticorpi primari per circa 30 minuti, come descritto nei passaggi 2.7-2.8.
  10. Eseguire la marcatura degli anticorpi secondari con la soluzione di colorazione degli anticorpi secondari #2 (ciclo 2) come descritto nei passaggi 4.6-4.9. Una volta completata la colorazione, posizionare un nuovo vetrino coprioggetti su ciascun vetrino come descritto in precedenza nei passaggi 4.12-4.13. Riposizionare il vetrino sul tavolino del microscopio e riposizionarlo in modo che si trovi sullo stesso piano XY delle immagini precedenti.
    NOTA: Utilizzare il canale che contiene il fiducial marker ripetuto (Hoechst) per identificare le strutture uniche (forme nucleari) presenti nell'immagine "live" (ciclo 2, ad esempio) e nell'immagine precedente (ciclo 1).
  11. Creare un nuovo progetto per l'immagine del ciclo 2 e ripetere i passaggi 5.2-5.14 per acquisire l'immagine del ciclo 2. Immagine utilizzando lo stesso numero di tessere, canali, impostazioni dei canali e FOV stabiliti per l'immagine del ciclo 1. Mantieni i punti della mappa di messa a fuoco negli stessi FOV, ma usa la messa a fuoco automatica per regolare ogni punto della mappa di messa a fuoco per questa nuova immagine. Una volta acquisita l'immagine del ciclo 2, procedere all'allineamento dell'immagine o ripetere i passaggi nella sezione 6 per ulteriori cicli con anticorpi direttamente coniugati. NOTA: Utilizzare il canale che contiene il fiducial marker ripetuto (Hoechst) per identificare strutture uniche (forme nucleari) presenti nell'immagine "live" (immagine del ciclo 2, ad esempio) e nell'immagine precedente (ciclo 1). Ulteriori cicli richiedono anticorpi coniugati direttamente perché IBEX non rimuove gli anticorpi.

7. Allineamento dell'immagine

  1. Converti le immagini grezze dai file .lif di output del microscopio in file .ims con il convertitore di file gratuito e l'elaborazione delle immagini con il software open source come descritto in precedenza5 e dettagliato nei video sulla Knowledge-Base IBEX10,11.
  2. Per ogni ciclo di imaging, modificare il file e applicare le fasi di elaborazione desiderate (ad esempio, denominazione del canale, pseudo-colorazione del canale).
    1. Esegui la sottrazione di fondo e la soglia dei canali utilizzando le funzioni aritmetiche dei canali create per SimpleITK per diminuire il segnale di autofluorescenza (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
      NOTA: Eseguiamo questi passaggi su ciascuna immagine (ad esempio, Ciclo 1, Ciclo 2) prima di allinearle in un'unica immagine composita. Questo perché è più facile lavorare sulle singole immagini più piccole rispetto all'immagine combinata più grande.
  3. Elabora una strategia di denominazione coerente per utilizzare il software di registrazione. Nominare i canali con un carattere separatore di prefisso-suffisso (ad esempio 'Cycle1 CD8_AF647') con uno spazio come carattere separatore per indicare il canale in cui è stato utilizzato l'anticorpo anti-CD8 AF647 nel primo ciclo.
    NOTA: Per ulteriori dettagli, vedere l'estensione del file della guida: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html.
  4. Dopo che tutti i canali sono stati denominati in modo appropriato, avviare il software di registrazione, fare clic su Estensioni Imaris | SimpleITK | Affine.
  5. Caricare il file .ims per ogni ciclo utilizzando il pulsante Sfoglia accanto a Nomi file. Immettere il carattere separatore del prefisso del nome del canale. Se segui l'esempio precedente, digita uno spazio singolo, quindi fai clic su Avanti.
  6. Selezionare il canale di registrazione utilizzato come fiducial marker comune tra i cicli (ad es. Hoechst).
  7. Selezionare l'immagine fissa, l'immagine a cui verranno registrate altre immagini.
    NOTA: Si consiglia di registrarsi al ciclo 2 di immagini iterative.
  8. Selezionare la directory desiderata per il 'File di output'. L'opzione Inizia registrazione alla risoluzione sarà impostata alla risoluzione massima per impostazione predefinita per consentire la migliore registrazione possibile. Se la potenza di calcolo è limitata, ridurre questo parametro.
    NOTA: Per i dati qui descritti (12-15 GB per immagine) abbiamo utilizzato una risoluzione massima di 5.
  9. Fai clic su Registrati per iniziare. Una volta completata la registrazione, attendi che appaia il pulsante Ricampiona e salva immagine combinata , fai clic su di esso e attendi che la barra di avanzamento vada al completamento.
  10. Aprire il file di output completato nel software di elaborazione. L'immagine registrata con tutti i cicli e le informazioni sul canale sarà disponibile e pronta per l'analisi o la pubblicazione.

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Risultati

La progettazione di un pannello di imaging multiplex basato su anticorpi richiede tempo, impegno e risorse significativi12. Queste sfide sono particolarmente evidenti quando si progetta un pannello per campioni FFPE archiviati da tessuti altamente autofluorescenti, come descritto qui (Figura 1). Per superare queste sfide, abbiamo prima identificato i fluorofori più luminosi compatibili con il nostro protocollo di inattivazione del colorante (Tabella 1...

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Discussione

La patologia polmonare clinica da tubercolosi polmonare è caratterizzata da infiammazione granulomatosa necrotizzante. La patologia polmonare NTM si verifica principalmente in due popolazioni di pazienti distinte con due modelli patologici separati: danno polmonare isolato caratterizzato da infiammazione granulomatosa con obliterazione bronchiolare e formazione di cavità in individui immunocompetenti, o malattia nodulare diffusa che colpisce i polmoni e altri organi in individui immunode...

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Dichiarazioni

A.J.R. è un dipendente di Leica Microsystems, Inc. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca Intramurale di DIR/NIAID, NCI e NHLBI. La Figura 1 è stata creata utilizzando BioRender nell'ambito di un accordo di licenza istituzionale con il NIH.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,3% Tritone-X-100Sigma-AldrichT8787Soluzione per il blocco del buffer
1% BSASigma-AldrichCodice: A4503Soluzione per il blocco del buffer
1% Blocco BD Fc umanoBD Bioscienze564220Blocco Fc necessario per il blocco del buffer
Lampada LED da 150 WAmazzoneB07VH3CVSFSorgente luminosa a LED per fotoirraggiamento tissutale
1x PBS Gibco10010-023Soluzione per il blocco delle fasi di tampone e lavaggio
Contenitore di stoccaggio da 20 galloniAmazzoneB001B1C4G0Contenitore per il processo di fotoirraggiamento
Lampada LED RGBW da 40 W AmazzoneB08QFPJSMDSorgente luminosa RGB per fotoirraggiamento tissutale
Ag85BAbcamab43019/NAAnticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Alfa-actina muscolare liscia DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAAnticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Kit di blocco Avidin/BiotinaAbcamab64212Soluzione bloccante di avidina e biotina
BD Cytofix/CytopermBD Bioscienze554714Soluzione di fissaggio
Soluzione di decera BONDLeica BiosystemsNC0221076Soluzione di deparaffinazione
Soluzione per il recupero degli epitopi BOND 1Leica BiosystemsNC0235529Soluzione di recupero dell'epitopo a base di citrato pH 6 (ER1)
Soluzione per il recupero degli epitopi BOND 2Leica BiosystemsNC0235530Soluzione per il recupero di epitopi a base di EDTA a pH 9 (ER2)
Sistema di rilevamento BOND ResearchLeica BiosystemsNC0396648Reagente di colorazione per ricerca automatizzato
Coloratore di ricerca BOND RXLeica BiosystemsNAPiattaforma automatizzata di colorazione per la ricerca
Soluzione di lavaggio BONDLeica BiosystemsNC0221077Tampone di lavaggio
CD15BD BioscienzeCodice 347420/AB_400298Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientifico50-0202-82/AB_11150959Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD4 Alexa Fluor 488R& Sistemi DFAB8165G/AB_2728839Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD45 Ficoeritrina (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAAnticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotecnologie1064135/AB_2892745Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-capra IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificoA32814/AB_2762838Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-topo IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificoA32787/ AB_2762830Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-topo IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_2340844Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Asino anti-coniglio IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificoA32794/AB_2762834Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Sistema di colorazione EasyDipRifornimento per nuovi arrivati5300KITSistema di colorazione dei vetrini
Fluoromount-GThermo Fisher Scientifico00-4958-02Supporti di montaggio
HoechstBiozio40046Colorazione nucleare per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Convertitore di file Imaris x64 10.2.0Imaris Oxford StrumentiConvertitore di file gratuito
ImarisViewer software x64 10.2.0Imaris Oxford StrumentiSoftware gratuito per l'elaborazione delle immagini
Penna ImmEdgeLaboratori VectorH-4000Penna barriera idrofobica
Boroidruro di litio (1 grammo)Prodotti chimici STREM93-0397Sostanza chimica per l'inattivazione del colorante, acquistare piccole aliquote di questa sostanza chimica (1 grammo)
Biotina LumicanR& Sistemi DBAF2846Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Occhiali Micro CoverVWR48393-241Coperture per vetrini
Pan-citocheratina Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Sistema a microonde PELCO BioWave ProTed Pella Inc36500-230Microonde scientifico non riscaldante
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062Controllo della temperatura completamente automatizzato per microonde scientifiche
SimpleITKSoftware open sourceSoftware di registrazione ed elaborazione dei canali
Streptavidina Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificoEpisodio 11227Reagente di marcatura per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.
Microscopio a campo largoLeica MicrosystemsNALeica Microsystems THUNDER imager con sorgente luminosa LED8 e software LAS X (3.7.1.21655). Per l'imaging a fluorescenza, è stato utilizzato un filtro quad-band personalizzato con ruota portafiltri esterna (PN: 11536075) con due filtri a banda singola aggiuntivi (PN: 8118215) per visualizzare sette canali di colorante per passaggio. Le linee di eccitazione, dicroica ed emissione del filtro sono (1) cubo Quad-Band: dicroico a 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, senza filtri di eccitazione o di emissione; (2) ruota portafiltri esterna posizione 1: 434/32, posizione 2: 520/40, posizione 3: 585/20, posizione 4: 720/60, posizione 5: passante; (3) 1 banda singola— 585/22 eccitazione, 594 dicroica, 625/30 emissione; (4) banda singola 2— 635/20 eccitazione, 647 dicroica, 667/30 emissione.
Zeiss Detergente per lenti otticheAmazzoneB00GPVQVCODetergente per lenti per obiettivi per microscopi
Anticorpi
Ag85BAbcamab43019IgG policlonali di coniglio, ciclo 1
Alfa-actina muscolare liscia DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1, ciclo 1
CD4 Alexa Fluor 488R& Sistemi DFAB8165GIgG policlonali di capra, ciclo 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLeggenda372906C8/144B, ciclo 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotecnologie1064135KP1, ciclo 1
Asino anti-capra IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificoCodice A32814Asino policlonale, ciclo 1
Asino anti-topo IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificoCodice: A32787Asino policlonale, ciclo 1
Asino anti-coniglio IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificoCodice: A32794Asino policlonale, ciclo 1
HoechstBiozio40046Marcatura nucleare, ciclo 1
CD15BD Bioscienze347420MMA, ciclo 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientifico50-0202-82L26, ciclo 2
CD45 Ficoeritrina (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, ciclo 2
Asino anti-topo IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020Asino policlonale, ciclo 2
Biotina LumicanR& Sistemi DBAF2846IgG policlonali di capra, ciclo 2
Pan-citocheratina Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, ciclo 2
Streptavidina Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificoEpisodio 11227N/D, ciclo 2
HoechstBiozio40046ciclo 2
Soluzioni
Blocking Buffer (Ciclo 1)
Tritone-X-100Sigma-AldrichT87870,3% in volume
BSASigma-AldrichCodice: A45031% in volume
Blocco Fc BD umanoBD Bioscienze5642201% in volume
1x PBS Gibco10010-02397,7% in volume
Soluzione colorante per anticorpi primari #1 (Ciclo 1)
Buffer di blocco (ciclo 1)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
HoechstBiozio400461:5000
CD8 AF647BioLeggenda3729061:10
Soluzione colorante con anticorpi primari #2 (Ciclo 1)
Buffer di blocco (ciclo 1)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
CD4  AF488R& Sistemi DFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
Soluzione colorante con anticorpi secondari #1 (Ciclo 1)
Buffer di blocco (ciclo 1)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
Asino Anti-Capra AF Plus 488Thermo Fisher ScientificoA32814/AB_27628381:100
Asino anti-Coniglio AF Plus 555Thermo Fisher ScientificoA32794/AB_27628341:100
Asino anti-Topo AF Plus 647Thermo Fisher ScientificoA32787/AB_27628301:50
Soluzione colorante per anticorpi primari #3 (Ciclo 1)
Buffer di blocco (ciclo 1)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
CD68 iF594Caprico Biotecnologie10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
Tampone di blocco senza BSA (ciclo 2) 
Tritone-X-100Sigma-AldrichT87870,3% in volume
Blocco Fc BD umanoBD Bioscienze5642201% in volume
1x PBS Gibco10010-02398,7% in volume
Soluzione colorante con anticorpi primari #4 (ciclo 2)
Buffer di blocco senza BSA (ciclo 2)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
CD15BD Bioscienze3474201:30
Biotina LumicanR& Sistemi DBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientifico50-0202-821:10
Pan-citocheratina AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
Soluzione di colorazione anticorpale secondaria #2 (Ciclo 2)
Buffer di blocco senza BSA (ciclo 2)Vedi sopraRabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi
Asino anti-Topo IgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidina AF594Thermo Fisher ScientificoEpisodio 112271:200

Riferimenti

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