Un Chirurgia Procedura Craniotomia per l'imaging cerebrale cronica

Sommario

Questo video e protocollo dimostrano come impiantare una copertura in vetro finestra cranica nei roditori. Queste preparazioni possono essere utilizzate per cronica in vivo a due fotoni di imaging della neocorteccia su scale temporali di mesi. Può essere utilizzato anche per altri tipi di imaging, tra cui l'imaging ottico del segnale intrinseco.

Abstract

Tecniche di imaging stanno diventando sempre più importante nella funzione del cervello di studio. Tra questi, la microscopia a due fotoni scansione laser è emerso come un metodo estremamente utile, perché permette lo studio del cervello vive intatto. Con i preparativi del caso, questa tecnica permette l'osservazione della stessa area corticale cronica, da minuti a mesi. In questo video ci mostra una preparazione cronica imaging in vivo del cervello usando la microscopia a due fotoni. Questa tecnica è stata inizialmente introdotta da Dott. Karel Svoboda, che ora è un Howard Hughes Medical Institute presso Janelia Farm. Preparati come quella mostrata qui può essere utilizzata per l'imaging della struttura neocorticale (ad esempio, dinamiche dendritica e assonale), per registrare l'attività neuronale con calcio-sensibili coloranti, alle dinamiche del flusso sanguigno corticale immagine, o per intrinseca studi di imaging ottico. L'imaging profondo della neocorteccia è possibile con interventi chirurgici ottimale finestra cranica. Che operano nelle condizioni più sterile possibile per evitare infezioni, insieme con estrema cura per non danneggiare la dura madre durante l'intervento, si tradurrà in successo e di lunga durata con tetto in vetro finestre craniche.

Protocollo

1. Anestetizzare topi con isoflurano (4% per l'induzione, 1,5-2% per la chirurgia) utilizzando IACUC procedure approvate. E 'importante che la coda e / o pizzichi punta sono utilizzati al fine di assicurare l'animale è completamente sedato.
2. Utilizzando un trimmer roditore, radere i capelli dalla parte posteriore del collo fino agli occhi.
3. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica, nel corso di un intervento chirurgico d'acqua a ricircolo di coperta. Fissare saldamente la testa con le barre orecchio.
4. Applicare una pomata oculare, al fine di prevenire gli occhi dell'animale si secchi.
5. Somministrare, per via sottocutanea, Desametasone (0,2 mg / Kg) e carprofen (5 mg / Kg) per prevenire il gonfiore del cervello e / o una risposta infiammatoria, rispettivamente.
6. Prima di iniziare l'intervento, sterilizzare l'area operativa strofinando la pelle con tre colpi alternati di alcool al 70% e Betadine.
7. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati pre-sterilizzati con uno sterilizzatore perle di vetro. Utilizzando le forbici che sono stati sterilizzati con etanolo, togliere la pelle sopra la parte superiore del cranio, a partire da un taglio orizzontale lungo tutta la base della testa, seguito da due tagli nella direzione rostrale, raggiungendo quasi le palpebre, poi due tagli obliqui che convergono sulla linea mediana.
8. Una goccia di adrenalina lidocaina + soluzione è applicata a questo punto sul periostio per evitare un eccessivo sanguinamento o dolore. Con un bisturi, ritrarre il periostio ai bordi del cranio. Inoltre, leggermente ritirare la muscolatura della parte posteriore del collo.
9. Raschiare delicatamente tutta l'area esposta del cranio con il bisturi per creare una superficie asciutta. Questo è molto importante, in quanto consentirà la colla per aderire meglio se applicato in seguito.
10. Una volta che un sito di imaging è stato scelto, si è pronti per creare la finestra del cranio. In primo luogo, gentilmente "disegnare" un cerchio di circa 4 mm di diametro con il martello pneumatico dentale.
11. Dopo una foratura leggero, applicare lidocaina + adrenalina soluzione ancora una volta sulla superficie del cranio. Interrompere la perforazione quando uno strato molto sottile di osso è rimasto. Premendo delicatamente sul centro della craniotomia per sentire come si dà modo, si può sapere che di solito questa fase viene raggiunto.
12. Sotto una goccia di soluzione salina e prendendo vantaggio delle trabecole ossee - la struttura spugnosa delle ossa - ascensore via la craniotomia dal cranio con una pinza punta molto sottile. La salina è importante, in quanto contribuirà a sollevare il cranio e prevenire il sanguinamento della dura.
13. Applicare Gelfoam che è stato precedentemente lavate con soluzione alla dura madre per fermare qualsiasi emorragia di piccole dimensioni che si verifica di tanto in tanto quando il cranio è stato rimosso.
14. Dopo l'essiccazione la superficie dura madre e la garanzia che non c'è sanguinamento, appoggiare delicatamente una sterile di vetro da 5 millimetri di copertura antiscivolo sulla parte superiore della dura madre. (Nota: altri gruppi anche mettere una goccia di agarosio a basso punto di fusione (1,2%) oltre la dura e mettere il coprioggetto in cima alla agar).
15. Applicare una goccia di cianoacrilato colla a base all'emisfero opposto sul cranio. Con l'aiuto di un ago, esercitare il collante di tutto il finestra mentre facendo attenzione a non metterla sotto il vetro. Colla può essere applicata in uno strato sottile su tutta la superficie del cranio.
16. Una volta che la colla si è asciugata, mescolare acrilico dentale e applicarla su tutta la superficie del cranio, che contempli anche un orlo piccolo della ricevuta di copertura, per fissarlo.
17. Dopo essersi assicurato la polizza di copertura, fare un piccolo pozzo intorno alla finestra con acrilico dentale. Inoltre, integrare una barra di titanio in acrilico dentale. Questa barra sarà in seguito utilizzato per collegare il mouse in modo sicuro sul palco del microscopio per l'imaging. E 'importante assicurarsi che il bar è di livello, in modo che sia parallelo con la finestra del cranio. Mettendo un pezzo di carta sotto la barra può permettere la barra di restare livello mentre l'acrilico si indurisce.
18. L'acrilico dentale è permesso di curare (indurimento) per 10 minuti, quando ormai la barra di titanio è fissata al suo posto. Posto l'animale in una gabbia di caldo fino a che non recupera.
19. Dopo il recupero dall'anestesia, l'animale può essere ripreso nello stesso giorno.

Discussione

Come abbiamo mostrato nel video e nelle figure supplementari, la preparazione window cranica, combinato con l'uso della microscopia a due fotoni, è uno strumento molto potente per studiare in vivo la struttura e la funzione della neocorteccia. La tecnica richiede un addestramento rigoroso per acquisire familiarità con l'anatomia e le relative procedure chirurgiche e sottile abilità che richiede questa preparazione. Solo interventi chirurgici incontaminate possono essere utilizzati per l'imaging cronica. Se la durata è manipolato...

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