Estrazione del DNA micobatterico mediante battitura del tallone in tampone personalizzato seguita da flusso di lavoro NGS

Summary

Questo protocollo dimostra che il beadbeating combinato con la purificazione delle microsfere per la cattura del DNA fornisce un metodo rapido e coerente per estrarre il DNA da campioni di Mycobacterium tuberculosis , rendendolo una scelta efficace per le applicazioni di sequenziamento di nuova generazione.

Abstract

La tubercolosi è una malattia mortale e l'emergere della resistenza ai farmaci antibiotici nel batterio agente eziologico, Mycobacterium tuberculosis, peggiora i risultati del trattamento. L'identificazione precisa e rapida della resistenza ai farmaci attraverso le tecnologie di sequenziamento è necessaria per migliorare gli esiti dei pazienti affetti da tubercolosi attraverso regimi terapeutici su misura. Il metodo di estrazione del DNA è fondamentale per i saggi molecolari a valle ed è complicato dalla dura parete cellulare di Mycobacterium, dal basso carico bacillare di molti campioni clinici e dalla complessità della matrice dell'espettorato. Sono stati riportati numerosi metodi di estrazione del DNA di M. tuberculosis , ma attualmente non esiste un gold standard. Inoltre, pochi di questi metodi hanno dimostrato di funzionare in modo coerente e molti non sono adatti per contesti di tubercolosi con scarse risorse e ad alto carico. Di conseguenza, i laboratori introducono spesso le proprie modifiche alle procedure, con conseguente significativa variabilità del metodo. Qui, presentiamo un protocollo economico, rapido e standardizzato per l'estrazione del DNA micobatterico sia dall'espettorato clinico che dalla coltura che produce DNA adatto per la qPCR e che dovrebbe essere preso in considerazione per l'uso nei laboratori di diagnostica clinica.

Introduction

L'estrazione di DNA di alta qualità da M. tuberculosis è necessaria per l'individuazione della tubercolosi (TB) resistente ai farmaci utilizzando il sequenziamento mirato di nuova generazione (NGS) e il sequenziamento dell'intero genoma (WGS), ma è spesso trascurata. Abbiamo sviluppato un protocollo standardizzato per fornire DNA coerente e di alta qualità per applicazioni cliniche NGS, inclusi approcci NGS mirati come Deeplex-MycTB (GenoScreen) e il sequenziamento dell'intero genoma, che sono ora raccomandati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) per la diagnosi della tubercolosi resistente ai farmaci. In particolare, mentre l'OMS raccomanda queste strategie diagnostiche basate su NGS, non specifica i particolari protocolli di estrazione del DNA per supportarle. Il nostro metodo può essere utilizzato con i test approvati dall'OMS e con le tecnologie emergenti che richiedono DNA micobatterico di alta qualità.

La sfida dell'estrazione deriva dalla parete cellulare unica di M. tuberculosis, composta da acidi micolici e lipidi che ne rendono eccezionalmente difficile l'apertura. Le attuali soluzioni di estrazione pubblicate presentano variazioni sostanziali nei metodi di lisi (ad es. sonicazione, chimica, calore e battitura delle microsfere) e nei metodi di estrazione del DNA (ad es. estrazione fenolo-cloroformio, precipitazione dell'etanolo, metodi basati su CTAB e basati su colonne e microsfere), il che si traduce in differenze nella resa, nella purezza e nella qualità del DNA 1,2,3,4,5,6,7,8 ^,9,10,11,12,13,14,15,16. Inoltre, i gruppi di ricerca usano raramente lo stesso metodo di estrazione del DNA e spesso misurano il successo in modo diverso. Ciò rende difficile determinare quale metodo funzioni meglio, poiché l'approccio ottimale dipende dal tipo di applicazione molecolare. Ad esempio, la risoluzione delle varianti strutturali di M. tuberculosis nell'espettorato utilizzando il sequenziamento a lettura lunga richiede DNA di qualità superiore e una polimerasi più accurata rispetto all'esecuzione di uno strumento diagnostico a pagamento che si rivolge solo a una piccola regione di rpoB. Diversi fattori complicano ulteriormente il successo dell'estrazione del DNA. La quantità di DNA che possiamo estrarre varia in base al tipo di campione, al numero di batteri presenti e alla presenza di sostanze (DNA non micobatterico co-estratto e inibitori della PCR) che interferiscono con il processo. Anche gli aspetti tecnici, come la precisione con cui un tecnico di laboratorio pipetta le pipette, possono influenzare i risultati. I metodi attuali spesso non sono all'altezza nel trattamento di campioni con basse cariche batteriche o alti livelli di DNA contaminante, che si incontrano comunemente in contesti clinici 17,18,19.

La battitura delle microsfere in un buffer personalizzato, seguita da un protocollo di pulizia delle perline, offre vantaggi chiave rispetto ad altri metodi. Si tratta di un flusso di lavoro semplice e rapido che riduce la possibilità di variazioni dipendenti dall'operatore e mantiene l'integrità del DNA per le applicazioni NGS a valle. Questo approccio standardizzato è particolarmente adatto ai laboratori clinici che cercano risultati affidabili e riproducibili utilizzando i test di resistenza ai farmaci NGS raccomandati dall'OMS e tutte le applicazioni WGS.

Protocol

Questo studio è stato condotto presso l'Università della California di San Francisco (UCSF) con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Biosicurezza (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) e segue le linee guida etiche della ricerca UCSF. Abbiamo ottenuto campioni di espettorato residuo raccolti da Discovery Life Sciences nell'ambito di un protocollo di rinuncia al consenso approvato dall'IRB da individui con condizioni respiratorie non tubercolari.

1. Preparazione dei tamponi

1. Tampone Triton personalizzato (Tabella 1): per preparare 100 mL di tampone Triton personalizzato, iniziare combinando 2 mL di NaCl 5 M, 1 mL di Tris-HCl 1 M (pH 8), 1 mL di Triton X-100 e 0,2 mL di acido etilendiamminotetraacetico 0,5 M (EDTA). Aggiungere acqua ultrapura per portare il volume totale a 100 ml. Sterilizzare il filtro prima dell'uso. Il tampone finale contiene 100 mM di NaCl, 10 mM di Tris-HCl, 1 mM di EDTA e l'1% di Triton X-100.
2. Basso EDTA TE (Tabella 2): per preparare 100 mL di tampone Low EDTA TE, combinare 1 mL di Tris-HCl 1M (pH 8) e 0,02 mL di EDTA 0,5 M. Aggiungere acqua ultrapura per portare il volume totale a 100 ml. Il tampone finale contiene 10 mM di Tris-HCl e 0,1 mM di EDTA.

2. Preparazione delle provette di lisi

1. Utilizzando una lama da bisturi, tagliare con cura il fondo di una provetta con tappo a vite da 1,5 mL appena sotto il punto di flesso.
2. Tagliare la punta di una punta P1000, tagliare un cuneo a forma di V vicino all'estremità e incuneare al suo interno il fondo preparato del tubo con tappo a vite. Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema del misurino.
3. Riempire un contenitore sterile (ad es. un serbatoio o una capsula di Petri) con perle di silicato di zirconio da 0,1 mm e utilizzare il misurino preparato per distribuire un misurino di perle (~200 mg) in provette con tappo a vite da 1,5 mL.

Figura 1: Paletta di distribuzione del tallone interna. Il misurino è stato progettato per il facile trasferimento di ~200 mg di perle di zirconio da 0,1 mm in provette di lavorazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione dei contributi

NOTA: Tutta la preparazione dei campioni deve essere condotta secondo i protocolli di biosicurezza della struttura. Si consiglia vivamente di maneggiare materiali infettivi all'interno di una cabina di biosicurezza (BSC) di Classe II per ridurre al minimo il rischio di esposizione all'aerosol.

1. Coltura cellulare batterica
   1. Centrifugare ~ 5 mL di coltura di M. tuberculosis (MGIT o coltura liquida torbida) in una provetta da centrifuga conica da 15 mL alla massima velocità (≥ 3.000 x g) per 10 minuti.
   2. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, rimuovere con cura tutto il surnatante tranne ~ 500 μL senza disturbare il pellet. Rimuovere il surnatante rimanente con una pipetta P1000 senza disturbare il pellet.
   3. Risospendere il pellet in 350 μl di tampone Triton personalizzato pipettandolo su e giù. Se necessario (ad esempio, per rimuovere campioni per l'elaborazione al di fuori di un BSL-3), inattivare il campione secondo le procedure operative standard.
2. Preparazione dell'espettorato
   1. Trasferire 1-5 mL di campione di espettorato (spontaneo o indotto) in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL.
3. Liquefazione DTT
   1. Aggiungere quattro volumi di 100 mM di ditiotreitolo al campione di espettorato (il volume può variare). Se si utilizza un reagente commerciale, seguire le istruzioni di diluizione del produttore.
   2. Agitare accuratamente per 30 s. Incubare a temperatura ambiente (20-25 °C) per 7 min. Vortice di nuovo per 30 s.
   3. Ripetere i passaggi 3.3.1. e 3.3.2. 1x, per campioni molto viscosi, eseguire fino a 5 cicli di incubazione-vortice.
   4. Centrifugare alla massima velocità (≥ 3.000 x g) per 10 min. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, scartare con cura tutto tranne ~ 500 μL del surnatante. Rimuovere il surnatante rimanente con una pipetta P1000 senza disturbare il pellet.
   5. Risospendere il pellet in 350 μl di tampone Triton personalizzato.
4. Liquefazione NALC-NaOH
   1. Per preparare la soluzione NALC-NaOH, seguire le istruzioni del produttore per la preparazione e la diluizione.
   2. Aggiungere quattro volumi di soluzione di NALC-NaOH al campione di espettorato (spontaneo o indotto, il volume può variare).
   3. Vortice per 30 s. Incubare a temperatura ambiente (20-25 °C) per 7 min. Ripetere i passaggi 3.4.1 e 3.4.2. 1x. Per campioni molto viscosi, eseguire fino a 5 cicli di incubazione-vortice.
   4. Aggiungere PBS al segno di 50 ml. Agitare brevemente per mescolare. Centrifugare alla massima velocità (≥ 3.000 x g) per 10 min.
   5. Utilizzando una pipetta sierologica da 50 mL, scartare con cura tutto tranne ~ 500 μL del surnatante. Rimuovere il surnatante rimanente con una pipetta P1000 senza disturbare il pellet.
   6. Risospendere il pellet in 350 μl di tampone Triton personalizzato. Se necessario (ad esempio, per rimuovere campioni per l'elaborazione al di fuori di un BSL-3), inattivare il campione secondo le procedure operative standard.

4. Estrazione del DNA

1. Trasferire la sospensione batterica inattivata (350 μL dalla fase 3) in una nuova provetta con tappo a vite da 1,5 mL ben marcata contenente ~250 μL di perle di silicato di zirconio da 0,1 mm.
2. Bead ha battuto il lisato a 6,5 m/s per 45 s con 2 minuti di riposo tra le corse. Ripetere per un totale di tre cicli di battitura delle talline.
3. Centrifugare alla massima velocità (≥ 12.000 x g) per 2 minuti e trasferire 150 μl di surnatante in una nuova provetta ben marcata. Fare attenzione a non trasferire perline o detriti cellulari.
4. Lasciare che le perle magnetiche di pulizia si equilibrino a temperatura ambiente per 30 minuti e vorticare accuratamente per garantire una risospensione completa prima dell'uso.
5. Aggiungere 180 μl (1,2x volume) di microsfere magnetiche di pulizia e mescolare pipettando su e giù 10x. Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
6. Posizionare su una griglia magnetica e attendere che la soluzione si liberifichi per ~ 2 min. Utilizzando una pipetta P200, scartare con cura il surnatante senza disturbare le microsfere magnetiche.
7. Con la provetta ancora sulla rastrelliera magnetica, aggiungere 500 μl di etanolo al 70 % (v/v) appena preparato, erogando lungo la parete opposta della provetta alle microsfere magnetiche. Attendere 30 s.
8. Ripetere i passaggi 4.5. - 4.7. per un totale di due lavaggi. Al termine dell'ultimo lavaggio, rimuovere l'etanolo residuo con una pipetta P10. Asciugare brevemente le perline per ~ 2 min.
9. Immediatamente dopo che il pellet di perlina diventa opaco, rimuovere la provetta dal rack magnetico e risospendere in 20 μl di tampone Tris a basso EDTA. Non lasciare che le perline si secchino e si screpolino.
10. Miscelare mediante pipettaggio o vortice per assicurarsi che tutte le microsfere siano in soluzione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
11. Posizionare su una griglia magnetica e attendere che la soluzione diventi limpida per ~ 2 min. Trasferire il DNA eluito in una nuova provetta ben marcata per l'analisi a valle. Aspirare <20 μL di DNA estratto per evitare il carry-over delle biglie magnetiche.

5. Enumerazione qPCR del DNA micobatterico

1. Per quantificare il DNA micobatterico utilizzando una PCR quantitativa mirata a 99 nucleotidi dell'atpE micobatterico (Rv1305), assemblare una miscela di reazione da 10 μL per campione su ghiaccio contenente 5 μL di miscela master per sonda universale (2x), 0,4 μL ciascuno di primer diretto (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) e primer inverso (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL di sonda TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL di DNA stampo e 2 μL di acqua priva di nucleasi (Tabella 3).
2. Eseguire la reazione utilizzando le seguenti condizioni di ciclo termico: denaturazione iniziale a 95 °C per 60 s, seguita da 35 cicli di 95 °C per 10 s e 60 °C per 30 s (con una cattura qui, utilizzando una velocità di rampa di 2,11 °C/s; Tabella 4).
   NOTA: In questo caso, la qPCR è stata eseguita utilizzando un test TaqMan con sonda marcata VIC su un sistema di PCR in tempo reale QuantStudio 3,
3. Esegui tutti i campioni, gli standard e i controlli in triplicate tecniche. Generare curve standard utilizzando diluizioni seriali di DNA purificato di M. tuberculosis . Esegui analisi di quantificazione relativa utilizzando il software di analisi.
4. Esporta i valori di quantificazione relativa risultanti in formato CSV e visualizzali utilizzando R Studio (versione 2024.09.1+394) per generare box plot che confrontano le rese di DNA tra i metodi di estrazione.

Results

Abbiamo testato il protocollo di estrazione del DNA su campioni di espettorato puntato di M. tuberculosis in coltura e M. tuberculosis (n = 3 per ciascuna condizione). Utilizzando M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 in coltura, abbiamo standardizzato l'input a 8,4 x 10⁶ cellule per 50 μL, equivalenti a 1 mL di una coltura MGIT a 200 GU. Per gli esperimenti sull'espettorato, abbiamo raccolto 1 mL di espettorato da individui con condizioni respiratorie non tubercolari (ottenute commercialme...

Discussion

In questo lavoro, presentiamo un protocollo robusto e convalidato per l'estrazione di DNA di M. tuberculosis di alta qualità utilizzando il bead-beating con pulizia magnetica per applicazioni molecolari e NGS a valle.

Il metodo offre diversi vantaggi rispetto ai protocolli di estrazione del DNA di M. tuberculosis esistenti. Mentre l'estrazione tradizionale con fenolo-cloroformio richiede in genere diversi giorni e introduce sostanze chimiche ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perle di silicato di zirconio da 0,1 mm	Prodotti Biospec	Codice 11079101Z	Perle utilizzate per la fase di battitura delle perle per lisare le cellule micobatteriche
Perline AMPure XP	Beckman Coulter	Codice A63880	Sfere magnetiche per la pulizia del DNA post-lisi
EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientifico	AM9260G	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati
Preparazione rapida 24	MPbio, Stati Uniti	116004500	Attrezzatura per la battitura del cordone a 6,5 m/s
Primer in avanti	Thermo Fisher Scientifico	Sintesi personalizzata	Sequenza di primer: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (acqua, grado di biologia molecolare)	Thermo Fisher Scientifico	BP2819-1	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati
Sonda universale Luna	Biolaboratori del New England	Motore M3004	Reagente qPCR per l'enumerazione del DNA micobatterico
MycoPrep Kit	BD	Codice SKU/REF 240863	BD MycoPrep Digestione dei campioni per l'elaborazione dell'espettorato NALC-NaOH
NaCl (cloruro di sodio, soluzione 5M)	Thermo Fisher Scientifico	AM9759	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati
PBS	Millipore Sigma	P2272	Elaborazione dell'espettorato
Innesco inverso	Thermo Fisher Scientifico	Sintesi personalizzata	Sequenza di primer: GTTTACGGCGTGGACTACCA
Sonda TaqMan	Thermo Fisher Scientifico	Sintesi personalizzata	Sequenza della sonda: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientifico	AM9855G	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati
Triton X-100	Thermo Fisher Scientifico	28314	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati