Estrazione del DNA micobatterico mediante battitura del tallone in tampone personalizzato seguita da flusso di lavoro NGS

Summary

Questo protocollo dimostra che il beadbeating combinato con la purificazione delle microsfere per la cattura del DNA fornisce un metodo rapido e coerente per estrarre il DNA da campioni di Mycobacterium tuberculosis , rendendolo una scelta efficace per le applicazioni di sequenziamento di nuova generazione.

Abstract

La tubercolosi è una malattia mortale e l'emergere della resistenza ai farmaci antibiotici nel batterio agente eziologico, Mycobacterium tuberculosis, peggiora i risultati del trattamento. L'identificazione precisa e rapida della resistenza ai farmaci attraverso le tecnologie di sequenziamento è necessaria per migliorare gli esiti dei pazienti affetti da tubercolosi attraverso regimi terapeutici su misura. Il metodo di estrazione del DNA è fondamentale per i saggi molecolari a valle ed è complicato dalla dura parete cellulare di Mycobacterium, dal basso carico bacillare di molti campioni clinici e dalla complessità della matrice dell'espettorato. Sono stati riportati numerosi metodi di estrazione del DNA di M. tuberculosis , ma attualmente non esiste un gold standard. Inoltre, pochi di questi metodi hanno dimostrato di funzionare in modo coerente e molti non sono adatti per contesti di tubercolosi con scarse risorse e ad alto carico. Di conseguenza, i laboratori introducono spesso le proprie modifiche alle procedure, con conseguente significativa variabilità del metodo. Qui, presentiamo un protocollo economico, rapido e standardizzato per l'estrazione del DNA micobatterico sia dall'espettorato clinico che dalla coltura che produce DNA adatto per la qPCR e che dovrebbe essere preso in considerazione per l'uso nei laboratori di diagnostica clinica.

Introduction

L'estrazione di DNA di alta qualità da M. tuberculosis è necessaria per l'individuazione della tubercolosi (TB) resistente ai farmaci utilizzando il sequenziamento mirato di nuova generazione (NGS) e il sequenziamento dell'intero genoma (WGS), ma è spesso trascurata. Abbiamo sviluppato un protocollo standardizzato per fornire DNA coerente e di alta qualità per applicazioni cliniche NGS, inclusi approcci NGS mirati come Deeplex-MycTB (GenoScreen) e il sequenziamento dell'intero genoma, che sono ora raccomandati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) per la diagnosi della tubercolosi resistente ai farmaci. In particola....

Protocol

Questo studio è stato condotto presso l'Università della California di San Francisco (UCSF) con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Biosicurezza (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) e segue le linee guida etiche della ricerca UCSF. Abbiamo ottenuto campioni di espettorato residuo raccolti da Discovery Life Sciences nell'ambito di un protocollo di rinuncia al consenso approvato dall'IRB da individui con condizioni respiratorie non tubercolari.

1. Preparazione dei tamponi

1. Tampone Triton personalizzato (Tabella 1): per preparare 100 mL di tampone Triton personalizzato, iniziare combinando 2 mL ....

Results

Abbiamo testato il protocollo di estrazione del DNA su campioni di espettorato puntato di M. tuberculosis in coltura e M. tuberculosis (n = 3 per ciascuna condizione). Utilizzando M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 in coltura, abbiamo standardizzato l'input a 8,4 x 10⁶ cellule per 50 μL, equivalenti a 1 mL di una coltura MGIT a 200 GU. Per gli esperimenti sull'espettorato, abbiamo raccolto 1 mL di espettorato da individui con condizioni respiratorie non tubercolari (ottenute commercialme.......

Discussion

In questo lavoro, presentiamo un protocollo robusto e convalidato per l'estrazione di DNA di M. tuberculosis di alta qualità utilizzando il bead-beating con pulizia magnetica per applicazioni molecolari e NGS a valle.

Il metodo offre diversi vantaggi rispetto ai protocolli di estrazione del DNA di M. tuberculosis esistenti. Mentre l'estrazione tradizionale con fenolo-cloroformio richiede in genere diversi giorni e introduce sostanze chimiche .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perle di silicato di zirconio da 0,1 mm	Prodotti Biospec	Codice 11079101Z	Perle utilizzate per la fase di battitura delle perle per lisare le cellule micobatteriche
Perline AMPure XP	Beckman Coulter	Codice A63880	Sfere magnetiche per la pulizia del DNA post-lisi
EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientifico	AM9260G	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati
Preparazione rapida 24	MPbio, Stati Uniti	116004500	Attrezzatura per la battitura del cordone a 6,5 m/s
Primer in avanti	Thermo Fisher Scientifico	Sintesi personalizzata	Sequenza di primer: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (acqua, grado di biologia molecolare)	Thermo Fisher Scientifico	BP2819-1	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati
Sonda universale Luna	Biolaboratori del New England	Motore M3004	Reagente qPCR per l'enumerazione del DNA micobatterico
MycoPrep Kit	BD	Codice SKU/REF 240863	BD MycoPrep Digestione dei campioni per l'elaborazione dell'espettorato NALC-NaOH
NaCl (cloruro di sodio, soluzione 5M)	Thermo Fisher Scientifico	AM9759	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati
PBS	Millipore Sigma	P2272	Elaborazione dell'espettorato
Innesco inverso	Thermo Fisher Scientifico	Sintesi personalizzata	Sequenza di primer: GTTTACGGCGTGGACTACCA
Sonda TaqMan	Thermo Fisher Scientifico	Sintesi personalizzata	Sequenza della sonda: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientifico	AM9855G	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati
Triton X-100	Thermo Fisher Scientifico	28314	Componenti buffer Triton/Low EDTA personalizzati