Per comprendere meglio la risposta della lesione dei condrociti a un sovraccarico meccanico della cartilagine, il protocollo descrive lo sviluppo di un modello di impatto della cartilagine ex vivo che è stato subletale per 24 ore.
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Articolo metodologico
In vitro Modello di impatto per generare una lesione subletale dei condrociti negli espianti di cartilagine bovina
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'osteoartrite post-traumatica (PTOA) è una malattia articolare progressiva prevalente, degenerativa e dolorosa che insorge tipicamente dopo un trauma articolare significativo, che colpisce oltre 6 milioni di americani. Il trauma della cartilagine indotto dall'impatto provoca una risposta alla lesione dei condrociti che culmina nella PTOA. Comprendere gli eventi molecolari associati al danno dei condrociti è necessario per sviluppare terapie per prevenire il PTOA o rallentarne la progressione. Per facilitare ciò, è stato sviluppato un modello di impatto della cartilagine ex vivo che è stato subletale per 24 ore. Gli espianti osteocondrali sono stati raccolti dalle articolazioni metacarpo-falangee bovine ed è stata utilizzata una torre di caduta per fornire carichi d'impatto agli espianti. Per garantire che lo stress e l'impatto fossero applicati in modo relativamente uniforme alla cartilagine articolare, gli espianti sono stati posizionati con la superficie ossea rivolta verso l'alto e l'osso è stato colpito dall'alto. Agli espianti sono stati applicati carichi diversi a partire da altezze del carrello di 4,0 cm, 4,5 cm e 5,0 cm, con conseguenti sollecitazioni medie di picco rispettivamente di 10,87 ± 1,84 MPa, 11,69 ± 0,67 MPa e 12,98 ± 0,75 MPa. Lo studio ha analizzato il ruolo della presenza di osso subcondrale nella cartilagine durante la coltura post-impatto e l'effetto dell'utilizzo di un supporto montato o sciolto durante l'impatto, valutando la vitalità cellulare e l'apoptosi. La cartilagine articolare impattata da 4,5 cm, combinata con un supporto montato e l'immediata rimozione dell'osso, ha fornito il modello ottimale per indurre una lesione della cartilagine con una morte cellulare minima a 24 ore dopo l'impatto.
Introduzione
L'osteoartrite post-traumatica (PTOA) è una malattia debilitante che colpisce oltre 5 milioni di adulti negli Stati Uniti1. Un singolo impatto traumatico sulla cartilagine può innescare una risposta di lesione dei condrociti, portando a sintomi ad esordio precoce e a una lotta permanente con dolore e disfunzione articolare2. La cartilagine ha poca o nessuna capacità di riparazione intrinseca e, quindi, esiste un bisogno insoddisfatto di sviluppare terapie per modificare la progressione della malattia3. Poiché la PTOA è correlata a un singolo evento traumatico chiaramente definito, c'è l'opportunità di intervenire prima che la malattia progredisca. Tuttavia, lo sviluppo di questi trattamenti è ostacolato dal divario nelle conoscenze sulla segnalazione molecolare che regola la risposta al danno dei condrociti e porta all'osteoartrite post-traumatica 2,3,4. Una migliore comprensione degli eventi molecolari successivi al danno dei condrociti potrebbe aiutare a progettare nuovi trattamenti terapeutici che recuperino la risposta al danno dei condrociti e prevengano o ritardino lo sviluppo del PTOA 2,5,6.
Per comprendere meglio la segnalazione molecolare della lesione dei condrociti, ricerche precedenti hanno utilizzato torri di caduta o dispositivi simili che influiscono meccanicamente sugli espianti di cartilagine in modo da avviare una risposta alla lesione. Questi studi hanno cercato di caratterizzare molti aspetti di questa risposta, tra cui i cambiamenti nelle proprietà meccaniche e nella struttura 7,8, il danno alla matrice e la sintesi 6,9,10,11, la disfunzione mitocondriale 12,13,14,15, le vie di trasporto ionico 16,17,18,19 ed espressione genica 9,11,20,21,22,23. Tuttavia, in molti di questi studi, la vitalità cellulare non è stata riportata o è stata compromessa, con una vitalità cellulare del 50% o inferiore in alcuni studi 24,25,26. Gli effetti confondenti della bassa vitalità cellulare possono rendere difficile lo studio della risposta al danno. La morte dei condrociti che segue immediatamente il trauma articolare è irreversibile, ma le terapie che trattano il danno dei condrociti mitigano il successivo PTOA27. Al fine di identificare i cambiamenti molecolari associati al danno dei condrociti e non alla perdita di cellule vitali, è necessario un modello di impatto della cartilagine che mantenga la vitalità dei condrociti per un periodo di tempo. Inoltre, un impatto della cartilagine che genera una risposta alla lesione dei condrociti relativamente uniforme in tutto il tessuto cartilagineo fornirebbe i risultati più coerenti nell'analisi del comportamento cellulare.
L'obiettivo dello studio è stato quello di sviluppare e caratterizzare un modello di lesione da impatto ex vivo economicamente vantaggioso per la cartilagine articolare che conservi la capacità di studiare le vie di segnalazione inerenti la risposta acuta alla lesione della cartilagine. Inoltre, un tale modello potrebbe essere utilizzato per valutare potenziali trattamenti per salvare la risposta alla lesione. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo prima sviluppato una tecnica sterile per raccogliere espianti di cartilagine da articolazioni metacarpo-falangee bovine da animali scheletricamente maturi utilizzando una punta di carotaggio con punta di diamante montata su un trapano a colonna. Le articolazioni metacarpo-falangee vengono scartate dal macello quando gli animali vengono lavorati per il consumo alimentare, rendendo questa articolazione una fonte di tessuto facilmente accessibile ed economica. Successivamente, abbiamo stabilito un modello di lesione da impatto in cui il campione osteocondrale è stato posizionato in un supporto sotto un dispositivo a torre di caduta. In questo modello, i campioni osteocondrali sono stati posizionati con la superficie articolare rivolta verso il basso su una superficie in acciaio inossidabile lucidato a specchio #8 e l'osso è stato sottoposto a un impatto dall'alto, fornendo un carico relativamente uniforme al tessuto cartilagineo. Sono stati determinati i parametri di impatto che mantengono la vitalità dei condrociti per 24 ore dopo l'impatto, pur innescando una risposta di danno molecolare apoptotico. I supporti che consentivano diverse quantità di movimento laterale del campione durante l'impatto sono stati valutati per il loro effetto sulla vitalità cellulare e sull'apoptosi; Infine, è stato valutato l'effetto della rimozione della cartilagine dall'osso subcondrale dopo l'impatto.
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Protocollo
L'uso di arti bovini ottenuti da un macello locale non richiedeva l'approvazione etica, poiché i tessuti venivano raccolti post-mortem da animali trasformati per il consumo alimentare.
1. Raccolta dell'espianto osteocondrale
- Sterilizzare i seguenti materiali utilizzando un'autoclave prima del prelievo dell'espianto: soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; circa 1 L per giunto), punta da trapano per carotaggio, adattatore girevole per acqua, un flacone di lavaggio autoclavabile, un manico per bisturi, due pinze e una lama per sega per autopsia.
- Installare la cappa per coltura tissutale con trapano a colonna e morsa all'interno di una bacinella per contenere il PBS. Montare la punta del carotaggio e l'adattatore girevole nel trapano a colonna e collegare l'ugello dell'adattatore girevole con un tubo flessibile a una damigiana riempita di PBS sterilizzato. Montare la sega per autopsia e posizionarla all'interno del cofano (Figura 1A-B).
- Stendere i sottocuscinetti monouso in una pila nella cappa di coltura tissutale, uno per ogni articolazione.
NOTA: I sottocuscinetti assorbono la PBS e il liquido sinoviale che può gocciolare durante l'apertura dell'articolazione. L'impilamento di diversi sotto-tamponi consente una facile rimozione dello strato superiore quando diventa troppo umido, fornendo uno spazio di lavoro pulito e asciutto durante tutta la procedura. - Preparare una provetta da 50 ml contenente il 70% di etanolo e un'altra provetta da 50 ml contenente lo 0,13% v/v di betadina in PBS e inserirle nella cappa. Posizionare la pinza e il manico del bisturi nella provetta per l'etanolo per mantenere la sterilità durante la manipolazione dei tessuti e posizionare una piastra sterile per colture cellulari a 6 pozzetti sul retro della cappa.
- Preparare 3 mL di terreno di coltura cellulare per ogni campione previsto. I terreni di coltura sono costituiti da Modified Eagle's Medium (DMEM) con 0,9 mM di piruvato di sodio, insulina, transferrina e selenio (ITS), 50 mg/mL di acido L-ascorbico, aminoacidi non essenziali del terreno essenziale minimo (MEM), penicillina, streptomicina e amfotericina B. Aggiungere acido L-ascorbico e ITS il giorno dell'uso28.
- Ottenere zampe anteriori bovine da animali scheletricamente maturi da un macello locale entro 6 ore dal sacrificio. Tenere il fazzoletto sul ghiaccio durante il trasporto.
- Isolare l'articolazione metacarpo-falangea rimuovendo lo zoccolo utilizzando una sega a nastro per carne senza aprire la capsula articolare. Rimuovere la pelle utilizzando le lame del bisturi #22 senza perforare la capsula articolare.
- Sciacquare accuratamente ogni gamba all'esterno della cabina di biosicurezza con acqua fredda per rimuovere lo sporco e rivestire con betadine per disinfettare.
- All'interno della cappa di coltura tissutale, aprire la capsula articolare utilizzando una nuova lama di bisturi #22. Isolare l'articolazione distale e mantenere la cartilagine articolare idratata con PBS da un flacone di lavaggio (Figura 1C). Coprire la cartilagine articolare con una garza sterile imbevuta di PBS per mantenere l'idratazione.
- Isolare ulteriormente l'articolazione metacarpo-falangea distale tagliando il metatarso con la sega per autopsia (Figura 1D). Posizionare l'articolazione distale nella morsa con la cartilagine coperta rivolta verso l'alto e serrare fino a quando non è ben fissata. Durante l'intero processo, inumidire regolarmente la garza sulla cartilagine con PBS.
- Piegare la garza lontano da un condilo e regolare la posizione della morsa in modo che la punta del carotaggio si trovi al di sopra della regione più piatta della superficie articolare (Figura 1E).
- Aprire la valvola della damigiana per consentire al PBS di fluire attraverso la punta di carotaggio. Utilizzare un flacone di lavaggio per idratare continuamente il tessuto con PBS e raffreddare i campioni durante la perforazione.
NOTA: Il PBS della damigiana e della bottiglia di lavaggio ha un effetto rinfrescante durante il processo di detorsolazione. - Scavare lentamente nel condilo, premendo la punta del trapano sulla superficie del condilo. Rilasciare frequentemente la pressione e lasciare che il calore si disperda. Continuare fino a quando la profondità di carotaggio è di circa 2 mm nell'osso subcondrale. Ripetere per ogni lato (Figura 1E).
NOTA: I segni di surriscaldamento includono una rapida evaporazione del fluido o un odore di bruciato. - Utilizzare la sega per autopsia per rilasciare i nuclei osteocondrali tagliando l'osso parallelamente alla superficie della cartilagine articolare, continuando a spremere il PBS dal flacone di lavaggio all'interfaccia della sega per autopsia e all'osso osteocondrale durante il taglio. Durante questa fase, mantenere la garza inumidita sulla superficie della cartilagine articolare per evitare la disidratazione.
- Conservare i nuclei osteocondrali (Figura 1F) in una soluzione diluita di betadina (vedere passaggio 1.3) fino a quando tutte le articolazioni non sono state lavorate.
- Sciacquare i nuclei osteocondrali in PBS e trasferire i campioni in pozzetti individuali di una piastra sterile a 6 pozzetti contenente 3 mL di terreno di coltura preriscaldato (DMEM con 0,9 mM di piruvato di sodio, insulina-transferrina-selenio (ITS), 50 mg/mL di acido L-ascorbico, aminoacidi non essenziali, penicillina, streptomicina e amfotericina B)28. Conservare i campioni in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 fino alla procedura di impatto del giorno successivo.
2. Impatto dell'espiantazione osteocondrale
- Fabbricare il supporto d'urto in acciaio inossidabile con una superficie d'impatto lucidata a specchio (Figura 1 e Figura 2 supplementare) e praticare i fori corrispondenti nella piastra di base della torre di caduta (Figura 3 supplementare).
- Prima della procedura di impatto, sterilizzare i seguenti materiali utilizzando un'autoclave: testa di impatto sferica in acciaio inox di 15 mm di diametro, supporto in acciaio inox con superficie d'impatto lucidata a specchio, 4 viti 6/32, 4 rondelle, pinze.
- Posizionare una torre di caduta che era stata precedentemente progettata e fabbricata29 in una cappa di biosicurezza. Per questo studio utilizzare una torre di caduta con una testa di impattatore sferica di 15 mm di diametro montata su un carrello dotato di cella di carico e accelerometro (Figura 2A), con una massa totale del carrello di 358,4 g.
- Fissare il supporto alla piastra di base della torre di caduta con quattro viti autoclavate (Figura 2B). In questo studio sono stati testati supporti con aperture circolari di 8,7 mm e 9,1 mm di diametro.
- Posizionare un nucleo osteocondrale nel supporto (Figura supplementare 1, Figura supplementare 2, Figura supplementare 3) sotto la testa del dispositivo di simulazione della torre di caduta con l'osso rivolto verso l'alto.
NOTA: Per un carico più omogeneo è stato scelto il posizionamento del nucleo osteocondrale con l'osso rivolto verso l'alto e la superficie articolare rivolta verso il basso30. - Regolare il carrello della torre di caduta all'altezza desiderata rispetto alla parte superiore dell'osso. Determinare l'altezza approssimativa della torre di caduta dagli studi pilota. In questo studio sono state valutate altezze di 4,0, 4,5 e 5,0 cm.
- Fare clic sul pulsante Start del software di acquisizione dati (Supplementary Coding File 1) appena prima di rilasciare il carrello della torre di caduta liberando l'arresto del mandrino (Figura 2A) e consentendo alla testa dell'impattatore di cadere sotto il peso della gravità sul campione. Sollevare immediatamente il carrello e appoggiarlo sul fermo del mandrino.
NOTA: Durante l'impatto, i dati saranno raccolti a 100 kHz utilizzando un software di acquisizione dati collegato a un modulo di acquisizione dati, che registra i segnali provenienti da una cella di carico posizionata tra la testa dell'impattatore e il carrello, nonché da un accelerometro. Sebbene solleviamo il carrello il prima possibile dopo l'impatto, non dispone di una funzione antirimbalzo o di altri meccanismi per prevenire un secondo impatto. - Posizionare il file .txt generato dal software di acquisizione dati nella stessa cartella del codice di analisi dati Matlab (Supplementary Coding File 2, disponibile anche all'https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis) ed eseguire il codice di analisi dei dati per filtrare i dati grezzi e calcolare i parametri di impatto.
NOTA: Il codice di analisi dei dati utilizza uno spessore della cartilagine di 0,563 mm per calcolare l'energia d'impatto. Questo è stato determinato come lo spessore medio della cartilagine prelevato da > 50 posizioni su ciascuno dei cinque campioni in uno studio separato utilizzando il metodo dell'ago31 e un tester meccanico Biomomentum Mach-1. I parametri di impatto sono calcolati come descritto in precedenza32. - Rimuovere la cartilagine dall'osso con una lama di bisturi #11, a seconda dei casi. Trasferire il campione nel terreno e nell'incubatore umidificato a 37 °C con CO2 al 5% fino all'imaging del giorno successivo.
NOTA: In questo studio è stato valutato l'effetto della rimozione della cartilagine dall'osso immediatamente dopo l'impatto o 24 ore dopo l'impatto.
3. Caratterizzazione della vitalità cellulare in campioni di cartilagine
- Rimuovere la cartilagine dall'osso, se necessario. Tagliare il campione di cartilagine a metà con un bisturi affilato. Evitare di effettuare tagli multipli; Puntare a un'unica incisione per garantire un bordo liscio.
- Immergere ogni semicampione di interesse in una soluzione costituita da 5 μM di omodimero di etidio e 2,5 μM di calcien AM in PBS. Proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per completare la colorazione dei morti vivi.
- Sciacquare i campioni con PBS 2x e conservarli in PBS fino all'imaging. Immagine il prima possibile dopo il completamento della colorazione.
- Posizionare il campione di cartilagine in posizione verticale su alcune gocce di PBS in un piatto per microscopia in modo che l'intero semicerchio sia visibile dalla parte anteriore del microscopio. Acquisisci immagini con un microscopio confocale invertito. Piegare leggermente la cartilagine con una pinza se non riesce a stare in piedi da sola.
- Utilizzando FIJI, una distribuzione di ImageJ con plug-in in bundle33, convertire prima l'immagine a 8 bit facendo clic su Tipo di > immagine > 8 bit. Quindi, imposta la soglia in Immagine > Regola > soglia e fai clic su Applica. Quindi, eseguire la funzione Spartiacque in Elabora > binario ed eseguire Analisi particelle... in Analizza per entrambi i canali verde e rosso. Analizza le immagini acquisite a un'altezza z coerente per ciascun campione per confronti accurati tra i gruppi.
- Calcola la vitalità cellulare dividendo il numero di cellule vive per il numero totale di cellule nel campione.
4. Caratterizzazione dell'apoptosi in campioni di cartilagine
- Immergere ogni mezzo campione di interesse nel reagente di rilevamento verde Caspasi-3/7 da 8 μM in PBS. Proteggere dalla luce e incubare a 37 °C per 30 min.
- Lavare i campioni con PBS 3x. Fissare i campioni colorati incubandoli in paraformaldeide al 4% (PFA) per 15 minuti. Lavare nuovamente con PBS e conservare in PBS fino all'imaging. Immagine entro 24 ore dalla colorazione.
- Immagine con microscopio confocale (vedere il passaggio 3.4 sopra). Per confronti validi dell'intensità della fluorescenza tra i gruppi, mantenere parametri di imaging coerenti per tutti i campioni, tra cui la lente dell'obiettivo, la potenza del laser di eccitazione, il guadagno del rivelatore del tubo fotomoltiplicatore, la dimensione del foro stenopeico, lo spessore della fetta ottica, la velocità di scansione, la media delle linee e la risoluzione dell'immagine.
- Utilizzando l'estensione FIJI di ImageJ, selezionare Valore medio di grigio nel menu Analizza > imposta misurazioni....
- Utilizzare lo strumento Sezione poligono per delineare l'intera area del campione mostrato in un'immagine. Eseguire la funzione Misura nel menu Analizza e registrare il valore medio di grigio, utilizzando gli stessi parametri di elaborazione in tutti i gruppi.
- Utilizzare lo strumento Sezione poligono per selezionare un'area dell'immagine che non contiene il campione ed eseguire nuovamente la funzione Misura. Registralo come valore medio di grigio dello sfondo.
- Calcolare l'intensità della fluorescenza sottraendo il valore medio dei grigi di fondo dal valore medio dei grigi del campione.
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Risultati
Il carico d'impatto meccanico agli espianti osteocondrali è stato applicato utilizzando una torre di caduta con altezze del carrello di 4,0 cm, 4,5 cm e 5,0 cm sopra il tessuto (n = 3 o 4). L'aumento dell'altezza del carrello prima che fosse rilasciato ha comportato forze d'impatto, sollecitazioni di picco medie, tassi di carico ed energie d'impatto più elevati (Tabella 1).
Abbiamo cercato di sviluppare un modello ex vivo di lesione della cartilagine che fosse subleta...
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Discussione
L'obiettivo di questo studio è stato quello di caratterizzare e ottimizzare un modello di impatto della cartilagine che non comprometta la vitalità cellulare per lo studio degli eventi molecolari a seguito di danno condrocitario, con l'obiettivo finale di sviluppare un trattamento che salvi le cellule danneggiate per prevenire la progressione del PTOA. Nel perseguimento di questo obiettivo, è stato erogato un carico meccanico alla porzione ossea dei nuclei osteocondrali, trasferendo il c...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato da NIH NIAMS Grant R21 AR080255. Gli autori desiderano ringraziare Kevin Carr per aver fornito la sua esperienza nella lavorazione e nella fabbricazione a questo progetto. Gli autori ringraziano la macelleria di Mooresville (Mooresville, IN) per aver fornito il tessuto per questo studio. Gli autori ringraziano il personale dell'Indiana Center for Biological Microscopy per la loro assistenza con la microscopia confocale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #11 lama per bisturi sterile | Thermo Fisher Scientific | 10-001-823 | Rimuovere la cartilagine dall'osso |
| #22 lama per bisturi sterile | Thermo Fisher Scientific | 10-001-833 | Rimuovere la pelle dai tessuti bovini e aprire l'articolazione tagliando i legamenti |
| 10-1000 ul puntali per pipette | Thermo Fisher Scientific | 02-707-411 | Misurare e trasferire PBS, terreni di coltura e altre soluzioni |
| Etanolo a 200 prove | Thermo Fisher Scientific | 03-007-647 | Utilizzato per preparare etanolo al 70% come agente sterilizzante per disinfettare gli strumenti chirurgici e mantenere un ambiente sterile durante la preparazione e la lavorazione dei tessuti. |
| Provetta da centrifuga da 50 mL (sterile) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Utilizzato per conservare terreni e campioni |
| Damigiana da 5 galloni | Thermo Fisher Scientific | 04-355-233 | Contenitore PBS sterile collegato all'adattatore girevole tramite tubo flessibile. |
| Piastra a 6 pozzetti (sterile) | Thermo Fisher Scientific | 140685 | Utilizzato per conservare temporaneamente i nuclei osteocondrali in un ambiente sterile con terreno preriscaldato durante la raccolta, l'incubazione prima degli studi di impatto e l'imaging |
| Accelerometro | Kistler | 8743A5 | Utilizzato per misurare l'accelerazione prodotta durante un kit |
| di colorazione dell'apoptosi da impatto (CellEvent)Thermo | Fisher Scientific | C10423 | Utilizzato per rilevare e visualizzare le cellule apoptotiche |
| Flaconi di lavaggio autoclavabili | Nalgene | 2405-0500 | Riempire con PBS sterile per idratare la cartilagine durante il prelievo dei tessuti. |
| Sega per autopsia | Mopec | BD 810 | Rimuovere l'osso in eccesso dopo aver aperto l'articolazione o estratto il nucleo osteocondrale |
| Lama per sega per autopsia | Mopec | BD 101 | Utilizzato per il taglio dell'osso per isolare e rilasciare espianti osteocondrali. |
| Betadina | Avrio Health L.P. | n/a | Utilizzato per la disinfezione dell'esterno dei campioni bovini prima di spostarli nella cappa e diluito per disinfettare i campioni osteocondrali finali. |
| Tubo trasparente da 4 piedi | n/a | n/a | Utilizzato per collegare la damigiana da 5 litri contenente PBS all'adattatore girevole del trapano a colonna per trasportare PBS. |
| Punta da trapano per carotaggio | UKAM Industrial Superhard Tools | 3EDCD7160 | Utilizzato per estrarre espianti osteocondrali dall'osso perforando la cartilagine articolare e l'osso subcondrale.- diametro della punta del trapano: 7/16" (Carotaggi diamantati elettrolitici) |
| Chiave a mezzaluna | McMaster Carr | 5362A1 | Utilizzato per serrare il morsetto (che tiene il giunto in posizione) e serrare la punta del carotaggio |
| Pipette sierologiche monouso | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | Misura e trasferimento di PBS e terreni di coltura |
| Sottopiede monouso | Thermo Fisher Scientific | 23-666-062 | Utilizzato per coprire lo spazio di lavoro per assorbire acqua e liquidi durante la raccolta per una maggiore comodità e igiene |
| Unità filtranti sottovuoto monouso | Thermo Fisher Scientific | SCGP00525 | Filter PBS e altre soluzioni |
| Trapano a colonna | WEN | 433TV 3.25-Inch | Applicare forza per forare campioni osteocondrali- WEN 433TV 3.25-Pollici Industrial Strength |
| Benchtop Pointtop Angle Visse WEN | TV434 | Fissa i campioni osteocondrali in una posizione fissa all'angolo desiderato durante il processo di carotaggio. | |
| Torre di caduta | su misura | n/a | Utilizzato per l'impatto sui campioni |
| FIJI (ImageJ Extension) | n/a | n/a Software | utilizzato per l'elaborazione e l'analisi delle immagini di microscopia, compresa la vitalità cellulare e la quantificazione dell'apoptosi |
| Pinze | Fisherbrand | 12-000-163 | Utilizzato per il taglio dei tessuti nel cappuccio, l'apertura dell'articolazione e il trasferimento dei campioni |
| Garza (sterile) | Dukal | 6412 | Utilizzato per idratare la cartilagine articolare dopo l'apertura della capsula articolare |
| Flacone di supporto in vetro da 1 litro | Sigma | Aldrich CLS13951LHTC | Utilizzato per conservare PBS sterile |
| Guanti | Thermo Fisher Scientific | 19-130-1597D | Utilizzato per proteggere il team di raccolta |
| Insulina-Transferrina-Selenio (ITS) | Gibco | 41400-045 | Supplemento multimediale |
| Software di acquisizione dati LabVIEW | National Instruments | n/a | Acquisisce i dati dalla cella di carico e dall'accelerometro durante i test di impatto per l'analisi successiva. |
| Acido L-ascorbico | Merck | A4403 | Supplemento multimediale |
| Microscopio laser a scansione confocale | Olympus | FV1000D | Utilizzato per acquisire immagini tridimensionali ad alta risoluzione di campioni di tessuto colorati. |
| Kit di colorazione per saggi vivi e morti | Thermo Fisher Scientific | L3224 | Utilizzato per differenziare tra cellule vive e morte in campioni di tessuto per valutare la vitalità cellulare |
| Cella di carico | Kistler | 9712B5000 | Utilizzata per misurare la forza applicata durante un impatto. |
| MATLAB | La MathWorks Inc. | n/a | |
| Sega a nastro per carne | Skymsen | MSKLE | Rimozione dello zoccolo carpale da campioni bovini |
| Micropipetta 10-100 uL | Thermo Fisher Scientific | FBE00100 | Misurazione e trasferimento PBS e terreni di coltura |
| Soluzione di aminoacidi non essenziali non essenziali (MEM) | Gibco | 11140-050 | Integratore di terreni |
| Modified Eagle' s Medium (DMEM) | Gibco | 10566-016 | Coltura di espianti osteocondrali. |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15-140-148 | Integratore di terreni |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Thermo Fischer Scientific | BP399-20 | Utilizzato per il risciacquo, l'idratazione e il raffreddamento dei tessuti per mantenere le condizioni fisiologiche, prevenire la disidratazione e preparare soluzioni coloranti |
| Supporto per campioni su torre di caduta | su misura | n/a | Fissa il nucleo osteocondrale durante l'impatto. |
| Manico del bisturi | Thermo Fisher Scientific | 16-100-107 | Utilizzato per il taglio preciso, la dissezione dei tessuti e l'apertura dell'articolazione. |
| Viti (aggiungi al cad) | Filettatura 6-32 Dimensione-18-8 Viti a brugola in acciaio inossidabile | ||
| Piruvato di sodio | Gibco | 11360-070 | Supplemento multimediale |
| Testa dell'impattatore sferico | McMaster Carr | 9292K52 | Autoclave prima della procedura di impatto |
| Maschere chirurgiche | Maschera filtrante | 375101 | Utilizzato per proteggere la squadra di raccolta |
| Adattatore girevole per acqua | UKAM Industrial Superhard Tools | 7035812 | Si collega alla punta del trapano di carotaggio per fornire un flusso continuo di PBS per il raffreddamento durante il processo di perforazione. |
Riferimenti
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- Grande, D. A., Schwartz, J. A., Brandel, E., Chahine, N. O., Sgaglione, N. Articular Cartilage Repair: Where We Have Been, Where We Are Now, and Where We Are Headed. Cartilage. 4 (4), 281(2013).
- Punzi, L., et al. Post-traumatic Arthritis: Overview On Pathogenic Mechanisms and Role of Inflammation. RMD Open. 2 (2), e000279(2016).
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