Articolo metodologico

In vitro Esposizioni alla cannabis delle cellule epiteliali polmonari all'interfaccia aria-liquido

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DOI:

10.3791/68102

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20 giugno 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

In questo articolo

Sommario

Stabiliamo un modello standardizzato in vitro per lo studio dell'esposizione ai vapori di cannabis all'interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce un approccio sistematico per esaminare gli impatti della cannabis vaporizzata, affrontando il crescente interesse per i vaporizzatori di cannabis come alternativa al fumo.

Abstract

Si stima che la cannabis sia utilizzata da circa 192 milioni di persone in tutto il mondo. La maggior parte delle persone usa la cannabis attraverso l'inalazione del fumo di cannabis, che contiene sottoprodotti della combustione che possono influire negativamente sulla salute dei polmoni. La conoscenza di questi rischi ha portato a un crescente interesse per i vaporizzatori di cannabis, che riscaldano il fiore di cannabis secco senza bruciare. La vaporizzazione della cannabis rilascia ancora cannabinoidi per inalazione, ma riscalda il materiale vegetale a una temperatura più bassa. Attualmente non esiste un modello standardizzato in vitro per valutare gli effetti del vapore secco di cannabis. Pertanto, abbiamo stabilito un modello per l'esposizione di colture cellulari polmonari a un'interfaccia aria-liquido (ALI), in base al quale le cellule sono esposte apicalmente alla cannabis vaporizzata, simulando così in modo più accurato la fisiologia delle cellule epiteliali polmonari. Questo protocollo garantisce un'erogazione costante e riproducibile di vapore di cannabis sulla superficie cellulare, fornendo una piattaforma affidabile per studiare gli impatti cellulari e molecolari della cannabis vaporizzata. Questo lavoro è il primo a standardizzare un metodo di somministrazione di vapore di cannabis in vitro , che può fungere da punto di riferimento per la futura ricerca preclinica sulla cannabis.

Introduzione

La cannabis viene tipicamente utilizzata inalando il fumo della combustione del fiore della pianta sotto forma di spinello, sia a scopo ricreativo che medicinale. Le principali attività biologiche della cannabis sono dovute a cannabinoidi come il Δ 9-tetraidrocannabinolo (Δ9-THC) e il cannabidiolo (CBD), che vengono rilasciati nell'organismo per inalazione. Il fumo di cannabis contiene anche composti pirogeni, tra cui agenti cancerogeni, mutageni e teratogeni, che hanno il potenziale di causare esiti negativi per la salute1. Date queste preoccupazioni, c'è interesse a rivolgersi a vaporizzatori di cannabis che riscaldano il fiore di cannabis senza bruciare, nella speranza che ciò consenta il rilascio di cannabinoidi per la successiva inalazione ma senza prodotti di combustione. È stato fatto un po' di lavoro per caratterizzare i componenti chimici del vapore di cannabis, mostrando la presenza di cannabinoidi ma anche di varie sostanze tossiche respiratorie, sfidando l'idea che questi dispositivi siano sicuri 2,3. Ci sono lacune significative nella conoscenza di come la cannabis vaporizzata influisca sui polmoni e su altri organi.

Gli studi sulle colture cellulari sono essenziali in tossicologia per isolare e comprendere gli effetti specifici delle sostanze inalate a livello cellulare, consentendo intuizioni ad alto rendimento, economiche e meccanicistiche rilevanti per la biologia umana. Anche il metodo di coltura delle cellule è un importante fattore determinante per i risultati complessivi ottenuti da un esperimento in vitro . La maggior parte degli studi di coltura cellulare viene eseguita utilizzando un ambiente sommerso, in cui le cellule vengono coltivate su plastica ed esposte apicalmente a mezzi acquosi. Le cellule epiteliali delle vie aeree, tuttavia, rappresentano una sfida unica in questo senso. In tutto il sistema respiratorio, la superficie apicale delle cellule epiteliali è a contatto con l'aria. All'interno degli alveoli, le cellule epiteliali producono tensioattivo, mentre altre cellule epiteliali delle vie aeree producono muco; Collettivamente, questo protegge e mantiene la funzione polmonare. Le colture sommerse non riescono a replicare l'esposizione all'aria apicale, limitando la loro capacità di modellare accuratamente l'ambiente in vivo . Un'alternativa ai modelli di coltura sommersa è la coltura all'interfaccia aria-liquido (ALI), dove le cellule epiteliali respiratorie vengono coltivate su una membrana rivestita di collagene con terreni sul lato basolaterale mentre sono esposte apicalmente all'aria. Le cellule epiteliali coltivate all'ALI sono modelli più accurati dell'epitelio respiratorio grazie alla loro capacità di polarizzarsi, produrre tensioattivo o muco e formare giunzioni in questo ambiente4.

Un'ulteriore considerazione che i metodi tradizionali di coltura cellulare sommersa devono affrontare è che i composti idrofobici come i cannabinoidi si solubilizzano male in mezzi acquosi5. Gli estratti etanolici sono un solvente comune per studiare i composti idrofobici in colture sommerse 6,7,8,9,10,11,12. Questi estratti consentono di sciogliere sia i composti idrofobici che quelli idrofili in un mezzo acquoso. Tuttavia, una limitazione è rappresentata dal potenziale di agglomerazione dei composti e dall'interazione dei composti con i mezzi, che possono alterare la biodisponibilità13,14. Di recente sono stati sviluppati per consentire la somministrazione di composti in fase aerosol alle cellule in assenza di solvente o terreno di coltura utilizzando sistemi di esposizione avanzati come expoCube15 (ALI/Transwell in vitro/sistema di esposizione ex vivo) e altri. La deposizione diretta di aerosol e sospensioni di particelle utilizzando un sistema di esposizione avanzato elimina il processo di raccolta-risospensione cruciale per le esposizioni sommerse, che è noto per alterare sostanzialmente le proprietà fisico-chimiche delle particelle16. Qui, descriviamo un protocollo standardizzato per l'esposizione di una linea cellulare epiteliale alveolare all'ALI.

Protocollo

1. Coltura di cellule epiteliali polmonari presso ALI

NOTA: Qui viene descritto un protocollo per la coltura di cellule A549 presso ALI. Si prega di rivedere la letteratura per il tipo di cellula da utilizzare nello studio. Diverse linee cellulari richiedono una diversa quantità di tempo all'ALI per differenziarsi, formare giunzioni strette e produrre tensioattivo/muco.

  1. Coltura cellulare
    1. Preparare i terreni aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS), 5 ml di glutamax, 5 ml di antibiotico-antimicotico e 500 μl di gentamicina a un flacone da 500 ml di DMEM.
    2. Mettere il terreno preparato a bagnomaria per 10-15 minuti per scaldare a 37 °C.
    3. Spruzzare la cabina di biosicurezza con etanolo al 70% e pulirla. Una volta che il terreno è riscaldato, posizionarlo sotto l'armadio di biosicurezza sterilizzato.
    4. Sotto la cappa di coltura, pipettare circa 10 mL di terreno in una provetta da 15 mL.
    5. Recuperare le cellule dall'azoto liquido e scongelarle agitando delicatamente a bagnomaria.
    6. Sotto la cappa di coltura, pipettare le cellule scongelate del crioviale nella provetta da 15 mL.
    7. Centrifugare la provetta da 15 mL a 300 g per 5 min.
    8. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet.
    9. Miscelare il pellet con il fluido e trasferirlo nel pallone T75 .
    10. Controllare il pallone T75 al microscopio.
    11. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 con umidità saturante.
    12. Aggiornare i terreni di coltura cellulare ogni 2-3 giorni.
    13. Passaggio e crescita delle cellule fino al raggiungimento del numero di cellule desiderato. Per seminare una piastra a 12 pozzetti, sono necessarie 3 × 106 celle.
  2. Rivestimento in collagene dei transwell
    1. Preparazione della soluzione di collagene
      1. Sciogliere 10 mg di collagene di tipo IV in 20 mL di ddH2O con 50 μL di acido acetico glaciale.
      2. Incubare a 37 °C per 30 minuti, agitando di tanto in tanto, fino a completa dissoluzione.
      3. Sterilizzare la soluzione filtrando attraverso un filtro da 0,22 μm.
      4. Aliquotare 1,5 mL della soluzione in provette da 15 mL e conservare a -20 °C.
    2. Rivestimento dei filtri transwell con collagene di tipo IV
      1. Scongelare una provetta di collagene di tipo IV (50 μg/mL) a partire da -20 °C.
      2. Aggiungere 150 μL di collagene a ciascun filtro Transwell.
        NOTA: Solo le piastre a 12 pozzetti sono compatibili con il sistema di esposizione.
      3. Lasciare asciugare le piastre con i coperchi aperti nella camera di biosicurezza (BSC) per 18 ore.
      4. Sterilizzare esponendolo alla luce ultravioletta (UV) per 30 minuti.
    3. Conservare le piastre a 4 °C, avvolte in parafilm, per un massimo di 30 giorni.
    4. Prima di galvanizzare le celle, sciacquare entrambi i lati dei filtri con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
  3. Semina delle cellule negli inserti e transizione ad ALI
    1. Preparazione della sospensione di piastre e cellule
      1. Pipettare 1,5 mL di terreno preparato preriscaldato in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti.
      2. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
      3. Preparare una sospensione cellulare con una concentrazione di 5 × 105 cellule/mL in terreno preparato.
    2. Semina di celle in inserti
      1. Rimuovere la piastra di coltura cellulare preparata dall'incubatore e posizionarla sotto una cappa di biosicurezza sterilizzata.
      2. Pipettare 0,5 mL di sospensione cellulare (2,5 × 105 cellule/inserto) sulla parte superiore della membrana nell'inserto.
      3. Coprire la piastra con il suo coperchio e rimetterla nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
    3. Fonda ALI
      1. Rimuovere il terreno apicale 24 ore dopo la semina delle cellule.
      2. Sostituire il terreno basolaterale con 0,6 ml di terreno preparato. A questo punto, le cellule sono esposte apicalmente all'aria, stabilendo l'ALI.
      3. Colture delle cellule A549 presso ALI per un massimo di 2 settimane, cambiando terreno ogni 2 giorni per consentire alle cellule di differenziarsi come è stato precedentemente caratterizzato4.

2. Valutazione dosimetrica dell'esposizione ai vapori di cannabis mediante LC/MS

NOTA: In questa parte del protocollo, sono stati utilizzati metodi privi di cellule per caratterizzare la dose di vapore di cannabis depositato all'interno di ciascun pozzetto analizzando le concentrazioni di Δ9-THC. Il Δ9-THC aderisce ai materiali plastici, quindi per la raccolta dei campioni devono essere utilizzate solo fiale di vetro. Questo metodo richiede che la cultivar di cannabis scelta contenga Δ9-THC.

  1. Preparazione e messa a punto del sistema di esposizione
    1. Impostare il tubo per il sistema di esposizione in base al percorso del flusso specificato (Figura 1A, B): ENDS Unità > condensatore > pompa di soffiaggio > gruppo di campionamento isometrico con pompa Aeroneb > sensore di umidità > expoCube con filtro > porta di flusso di esposizione expoCube.
    2. Attivare i controlli della temperatura per riscaldare il sistema a 35 °C e 50 °C.
    3. Eseguire i test di flusso per assicurarsi che il sistema sia privo di perdite e che le pressioni siano impostate correttamente (fare riferimento alla nota tecnica SCIREQ Una guida alla risoluzione dei problemi di flussi irregolari in expoCube).
    4. Avviare le pompe Aeroneb per ottenere un'umidità relativa superiore al 75%.
  2. Test dosimetrici e preparazione del vaporizzatore
    1. Preparazione del vaporizzatore di cannabis
      1. Macina il fiore di cannabis usando un macinino per erbe.
      2. Pesare 0,25 g di aliquote, utilizzando un separatore di pillole per organizzare ogni porzione.
      3. Posizionare gli inserti in acciaio inossidabile nella fila di esposizione della piastra a 12 pozzetti all'interno del sistema di esposizione.
  3. Esposizione degli inserti in acciaio inossidabile ai vapori di cannabis
    1. Inizia l'esposizione
      1. Riempi il vaporizzatore con 0,25 g di cannabis.
      2. Collega il vaporizzatore per cannabis all'unità ENDS del sistema di esposizione con una guarnizione sicura e inizia il regime di sbuffo desiderato. Impostare il vaporizzatore sull'impostazione della temperatura Smart Path Level 2 .
        NOTA: Il sistema di esposizione utilizzato in questo studio ha quattro livelli di percorso intelligente tra cui scegliere, tra cui Livello 1 (176-188°C), Livello 2 (188-199 °C), Livello 3 (199-210 °C) e Livello 4 (210-221 °C).
      3. Creare un profilo puff nel software flexiWare (software di acquisizione dati; fare riferimento a SCIREQ Technote: A Guide to Creating Profiles for flexiWare 8). Per questo protocollo, utilizzare un volume di soffio di 70 ml con una frequenza di 4 boccate/min.
      4. Aziona il vaporizzatore per erbe secche per 5 minuti prima di cambiare cannabis rimuovendo il fiore di cannabis dal forno del vaporizzatore e aggiungendo 0,25 g di cannabis fresca al vaporizzatore. Alterna due vaporizzatori per un'esposizione continua.
      5. Continuare i passaggi 2.3.1.1-2.3.1.4 fino a raggiungere il tempo di esposizione desiderato.
    2. Dopo ogni esposizione, rimuovere con cautela gli inserti dal sistema di esposizione utilizzando una pinzetta e prepararli per la raccolta del campione come descritto di seguito.
  4. Raccolta e preparazione di campioni per l'analisi LC/MS
    1. Utilizzando una pinzetta, posizionare i filtri corrispondenti a ciascuna esposizione in una fiala di vetro etichettata contenente 10 ml di metanolo di grado LC/MS (ad esempio, esposizione 1, esposizione 2, esposizione 3).
    2. Lavare l'inserto.
      1. Inserire ciascun inserto in acciaio inossidabile esposto in una fiala di vetro etichettata contenente 10 ml di metanolo di grado LC/MS.
      2. Etichettare le fiale in base all'esposizione (ad esempio, esposizione 1 pozzetto 1-4).
    3. Estratto di Δ9-THC
      1. Utilizzare un bagno sonicatore per sonicare le fiale con inserti per 10 minuti per estrarre Δ9-THC.
      2. Trasferire gli inserti in un secondo set di fiale di vetro con 10 ml di metanolo fresco e sonicare per altri 10 minuti.
    4. Inviare tutti i campioni preparati (pozzetti, lavaggio e filtro) per l'analisi LC/MS per quantificare i livelli di Δ9-THC.
  5. Calcoli dosimetrici
    1. Utilizzando i risultati dell'analisi LC/MS, calcolare la quantità di Δ9-THC depositato per determinare la dosimetria del flusso di esposizione (quantità depositata nel filtro) e la dosimetria nel pozzo.
    2. Calcolare il rapporto tra il filtro del flusso di esposizione e la deposizione del pozzo per Δ9-THC.
    3. Utilizzare questo rapporto per determinare la dose che verrà erogata alle cellule durante le esposizioni.

3. Valutazione dosimetrica dell'esposizione ai vapori di cannabis mediante una microbilancia a cristalli di quarzo

NOTA: Questo metodo descrive in dettaglio l'impostazione e la calibrazione di una microbilancia a cristalli di quarzo (QCM) per valutare la massa delle particelle di vapore di cannabis depositate durante le esposizioni. Ogni QCM fornisce misurazioni in tempo reale, consentendo una dosimetria precisa dell'esposizione ai vapori di cannabis.

  1. Preparazione e impostazione della QCM nel sistema di esposizione
    1. Configurare il sistema di esposizione come descritto in precedenza.
    2. Collegare ciascun QCM al relativo modulo elettronico utilizzando il connettore a clip e collegare il modulo agli ingressi dell'unità inExpose (piattaforma di esposizione per inalazione) con un connettore a 7 pin.
    3. Posizionare gli inserti QCM in una piastra a pozzetti sul lato di esposizione del sistema di esposizione, assicurandosi che il QCM sia ben allineato.
    4. Preriscaldare il sistema di esposizione con QCM collegati fino a quando il sistema non si stabilizza alle temperature target di 35 °C e 50 °C.
    5. Attivare microflussi e flussi di esposizione secondo le impostazioni sperimentali.
  2. Calibrazione della QCM
    1. Utilizzare la procedura guidata di calibrazione del software di acquisizione dati per calibrare il QCM prima di ogni esecuzione di esposizione.
    2. Attendere che la barra di calibrazione blu si stabilizzi, quindi selezionare Avanti per registrare la frequenza di risonanza QCM per calcoli di massa accurati.
      NOTA: L'intervallo di calibrazione previsto è compreso tra -15% e 15%. Le deviazioni possono indicare problemi come un QCM sporco o un connettore LEMO scollegato.
  3. Monitoraggio in tempo reale dei segnali QCM
    1. Monitorare le uscite QCM; Il sistema emette la massa accumulata depositata. Il valore viene visualizzato nel software di acquisizione dati sia come parte di un grafico che come valore attuale effettivo.
      NOTA: Per ogni esecuzione sperimentale, nel software vengono riportate anche la deposizione massima e minima.
  4. Pulizia della QCM
    1. Per mantenere la precisione, pulire il QCM dopo ogni esperimento.
    2. Aggiungere 1 mL di alcol isopropilico al 70% all'interno di ciascun inserto QCM.
    3. Pipettare la soluzione alcolica su e giù 2-3 volte per sciogliere i residui.
    4. Rimuovere la soluzione alcolica e lasciare asciugare completamente il QCM all'aria in un ambiente privo di polvere prima dell'uso successivo.

4. Risultati dell'esposizione delle cellule al vapore di cannabis

NOTA: Questo protocollo è progettato per valutare gli effetti del vapore di cannabis sulle cellule respiratorie coltivate presso ALI utilizzando il sistema expoCube. I saggi post-esposizione, tra cui 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) e lattato deidrogenasi (LDH), forniscono informazioni sulla citotossicità dose-dipendente e sull'attività metabolica.

  1. Erogazione di vapori di cannabis
    1. Impostare il sistema di esposizione come descritto sopra: Assicurarsi che il sistema abbia raggiunto una temperatura di 35 °C e 50 °C e livelli di umidità relativa superiori al 75%.
    2. Se si utilizza un QCM, collegare il dispositivo al suo modulo elettronico utilizzando il connettore a clip e collegare il modulo agli ingressi dell'unità di esposizione per inalazione con un connettore a 7 pin. Posizionare l'inserto QCM singolo in una piastra a pozzetti sul lato di esposizione dell'expoCube, assicurandosi che la QCM sia ben allineata.
    3. Aprire il sistema di esposizione e posizionare la piastra di coltura cellulare all'interno.
    4. Iniziare il regime di sbuffi per la durata desiderata in base alla sezione 2. L'utilizzo del QCM consentirà il monitoraggio in tempo reale del vapore totale depositato.
    5. Dopo l'esposizione, riportare le cellule nell'incubatore fino al punto temporale del saggio desiderato.
    6. Raccogliere i campioni secondo necessità da vari scomparti, tra cui lo scomparto basolaterale, il lavaggio dello scomparto apicale (per tensioattivo o muco) e il lisato cellulare.
    7. Saggi di selezione della dose: utilizzare i saggi LDH e MTT per determinare la dose ottimale e la potenziale citotossicità.
  2. Saggio LDH per cellule all'ALI
    1. Raccolta dei supporti: nel momento desiderato dopo l'esposizione, raccogliere i supporti dallo scomparto basolaterale.
    2. Trasferire 100 μl di terreno raccolto in una micropiastra trasparente a 96 pozzetti.
    3. Aggiungere 100 μl di miscela di reazione LDH appena preparata in ciascun pozzetto.
    4. Incubare la piastra a temperatura ambiente (15-25 °C) per 30 minuti, proteggendola dalla luce.
    5. Misura l'assorbanza a 490-492 nm, utilizzando una lunghezza d'onda di riferimento superiore a 600 nm.
    6. Calcolare la citotossicità utilizzando la seguente formula:
      Citotossicità (%) = (valore sperimentale-controllo negativo)/(controllo positivo-controllo negativo) x 100
  3. Saggio MTT per cellule all'ALI
    1. Coltura di cellule A549 presso ALI come precedentemente stabilito.
    2. Dopo l'erogazione dell'esposizione nel sistema di esposizione, riportare le cellule nell'incubatore fino al punto temporale del test desiderato.
    3. Sciogliere 1 mg di MTT in 1 mL di PBS per ottenere la soluzione MTT.
    4. Aggiungere 500 μl di soluzione di MTT sul lato apicale delle cellule e 500 μl di soluzione di MTT nel compartimento basolaterale.
    5. Riportare le cellule nell'incubatore a 37 °C per 1 ora.
    6. Rimuovere con cautela tutti i supporti.
    7. Aggiungere 500 μl di dimetilsolfossido (DMSO) sul lato apicale e 1.000 μl di DMSO sul lato basolaterale.
    8. Incubare per 1 ora per sciogliere i cristalli di formazan.
    9. Raccogliere e combinare la soluzione sia dal lato apicale che da quello basolaterale.
    10. Misurare l'assorbanza a 540 nm (OD540) con un riferimento a 690 nm (OD690).
    11. Calcola la vitalità cellulare utilizzando la seguente formula:
      Vitalità cellulare (%) = 100 × (Media OD_exposure/Media OD_negative controllo)

Risultati

Durante gli esperimenti con il sistema expoCube, quattro pozzetti ricevono l'esposizione ai vapori di cannabis, quattro pozzetti sono esposti all'aria condizionata come controlli del veicolo e i restanti quattro pozzetti sono completamente chiusi come controlli negativi (Figura 1C)17. Questa configurazione consente un confronto preciso tra condizioni trattate, del veicolo e negative. Il sistema è umidificato per creare un ambiente adatto alle colture cellulari (Figura 2) e la regolazione della temperatura all'interno del sistema migliora la deposizione di particelle attraverso la termoforesi, consentendo una consegna efficiente dei composti vaporizzati alle cellule18. Per quantificare l'esposizione, misuriamo la quantità di Δ9-THC come marcatore della deposizione da vapore di cannabis nel sito di esposizione cellulare. Questa quantificazione è fondamentale per ottimizzare i tempi di esposizione e le dosi, consentendo ai ricercatori di regolare i periodi di esposizione attiva per raggiungere le dosi desiderate negli esperimenti di coltura cellulare (Figura 3). Calcolando il rapporto tra il Δ9-THC raccolto nel filtro di flusso di esposizione e la quantità depositata nei singoli pozzetti, possiamo stimare la dose effettiva erogata alle cellule (Tabella 1). Questa dose calcolata informa l'intervallo di esposizione desiderato, aiutando a determinare i parametri ottimali per studiare le risposte cellulari al vapore di cannabis in modo coerente e misurabile. Questo può essere eseguito per altri cannabinoidi, a seconda del profilo cannabinoide della varietà di cannabis selezionata. Inoltre, l'analisi QCM può essere eseguita per misurare la deposizione di vapori di cannabis in tempo reale. La Figura 4 mostra la deposizione da vapore di cannabis in un corso di 30 minuti in cui il vaporizzatore e il materiale di cannabis sono stati cambiati ogni 5 minuti. Ogni pozzetto ha mostrato un aumento costante della massa nel tempo, indicando un'efficace e continua deposizione di intere particelle di vapore di cannabis.

figure-results-1
Figura 1: Schema del sistema di esposizione ALI/Transwell in vitro/ex vivo per l'esposizione ai vapori di cannabis presso l'ALI. (A) Il vaporizzatore DaVinci MIQRO è stato utilizzato per generare vapore di cannabis. Questo campione viene umidificato e trasportato attraverso il campionatore isocinetico e nel sito di esposizione. L'unità di controllo consente di regolare le uscite del flusso d'aria e i gradienti di temperatura. (B) Fotografie della configurazione del sistema di esposizione. (C) L'interno dell'expoCube è suddiviso in tre file: una fila di prova per l'esposizione ai vapori di cannabis, una fila di controllo del veicolo di aria condizionata e la fila di controllo negativa chiusa che rimane intatta da qualsiasi flusso d'aria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Profilo di umidità relativa (%) registrato nel tempo. Questi dati mostrano i livelli di umidità relativa quando gli Aeronebs vengono attivati, raggiungendo e mantenendo un'umidità media del 75%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Quantificazione della deposizione di Δ 9-THC tramite analisi LC/MS dopo esposizioni di 30 minuti al vapore di cannabis. (A-C) La deposizione di Δ9-THC è stata misurata in ciascun pozzetto dopo tre esposizioni indipendenti al vapore di 30 minuti, ciascuna utilizzando 1,5 g di una cultivar di cannabis ad alto contenuto di THC. I livelli di Δ9-THC sono stati quantificati mediante LC/MS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

figure-results-4
Figura 4: Misurazioni QCM della deposizione di vapore di cannabis nel sistema di esposizione ALI/Transwell in vitro/ex vivo in un regime di esposizione di 30 minuti. (A-D)Ogni grafico rappresenta la deposizione cumulativa di particelle di vapore di cannabis nei pozzetti 1-4, con massa misurata in microgrammi (μg) nel tempo. Il tasso di deposizione dimostra un accumulo costante in tutti i pozzi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Deposizione del filtro del flusso primario (μg)Deposizioni di pozzetti (μg)Percentuale del flusso primario depositato nel pozzo (%)
Esposizione 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
Esposizione 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
Esposizione 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
Nella media2422.94.30.18
Deviazione standard292.80.40.03

Tabella 1. Confronto della deposizione di Δ9-THC nel sistema di esposizione ALI/Transwell in vitro/ex vivo tra il filtro di flusso di esposizione e il sito di esposizione cellulare.

Discussione

La coltura di cellule presso l'ALI è un metodo importante nella ricerca respiratoria grazie alla sua capacità di rappresentare in modo più accurato le condizioni delle vie aeree in vivo rispetto alle tradizionali colture sommerse19. La coltura presso l'ALI consente alle cellule epiteliali polmonari di essere esposte direttamente all'aria sulla loro superficie apicale, mantenendo i nutrienti essenziali del terreno di coltura sul lato basolaterale. Questa configurazione consente alle cellule di produrre tensioattivo o muco, componenti chiave del meccanismo di difesa respiratoria che sono fondamentali per intrappolare e rimuovere le particelle e gli agenti patogeni inalati 20,21,22. Le cellule A549 sono comunemente impiegate per studi in vitro, ma sono solo una delle tante colture di cellule epiteliali respiratorie che possono essere utilizzate per l'ALI. Silva et al. hanno esaminato le linee cellulari e le colture primarie dell'epitelio respiratorio per l'ALI dalla cavità nasale agli alveoli22. La flessibilità del sistema di esposizione ALI presentato ne consente l'adattamento a diverse linee cellulari e cellule primarie.

Le colture ALI sono sempre più considerate il "gold standard" per gli studi di inalazione in vitro , in particolare per la ricerca sugli inquinanti atmosferici, sul particolato e su altri agenti inalabili23. Un vantaggio primario dei modelli ALI risiede nella loro capacità di fornire informazioni più traducibili in effetti umani in vivo . Tuttavia, uno svantaggio notevole è la mancanza di protocolli standardizzati per l'esposizione all'ALI, che influisce sulla riproducibilità e sulla comparabilità tra gli studi. Una delle lacune è un flusso di lavoro di esposizione standardizzato. Esponendo le cellule al vapore di cannabis all'ALI, è possibile valutare l'impatto della cannabis sulla funzione cellulare, sulla vitalità e sulla citotossicità. Queste esposizioni consentono una valutazione dettagliata degli esiti biologici, compresi i marcatori di citotossicità, infiammazione e stress ossidativo. La quantificazione precisa dei cannabinoidi depositati consente studi riproducibili sugli effetti cellulari del vapore di cannabis (e di altre forme di prodotti a base di cannabis), migliorando la nostra comprensione dei suoi potenziali impatti sulla salute in un ambiente di laboratorio controllato.

I sistemi avanzati di esposizione affrontano i limiti delle colture sommerse tradizionali consentendo la deposizione diretta di particelle sulla superficie cellulare, fornendo così esposizioni più rilevanti dal punto di vista fisiologico. Ciò riduce anche i potenziali effetti dei solventi o dei supporti. Consentendo la deposizione diretta di particelle senza la necessità di questi solventi, i sistemi di esposizione aiutano a ridurre al minimo gli effetti legati al veicolo. Ciononostante, permangono alcune considerazioni relative ai veicoli. Ad esempio, livelli di umidità incontrollati possono causare stress cellulare indesiderato24, con un potenziale impatto sui risultati sperimentali. Garantire che l'umidità sia regolata con attenzione per raggiungere livelli ottimali è essenziale per mantenere la stabilità e l'accuratezza dei risultati. Inoltre, ogni particella, aerosol o miscela di gas ha le sue proprietà fisico-chimiche uniche, che potrebbero alterare la deposizione sulla superficie cellulare25. È quindi importante caratterizzare un regime di esposizione per ogni prodotto unico. I fattori che potrebbero influenzare la deposizione di particelle includono la termoforesi, il movimento delle particelle da una regione di temperatura più alta a una più bassa26. La termoforesi aiuta a dirigere le particelle verso le cellule e migliora l'efficienza della deposizione.

La coerenza e la precisione del dosaggio sono ulteriori sfide quando si lavora con i sistemi di esposizione presso l'ALI, in particolare quando sono coinvolti aerosol o particelle. La deposizione di particelle in vivo nel polmone è un processo complesso influenzato dalla dimensione, dalla forma, dalla densità e dalla solubilità delle particelle, nonché dalla regione specifica del polmone esposta27. Questi fattori determinano tassi di deposizione variabili che possono essere difficili da replicare in vitro. I modelli matematici, come la dosimetria di particelle multi-percorso (MPPD), sono strumenti utili per stimare i tassi di deposizione in vivo e guidare la traduzione della dose in vitro 28. Tuttavia, l'abbinamento del dosaggio in vitro con gli scenari di esposizione in vivo rimane una sfida, in particolare per gli aerosol complessi con composizioni eterogenee.

Per la caratterizzazione della dose senza cellule, è importante notare che i lavaggi degli inserti in acciaio inossidabile tendono a sovrastimare la deposizione, poiché i composti possono aderire sia alle pareti dell'inserto che alla base dove si troverebbero tipicamente le cellule. La QCM offre un vantaggio in questo caso, misurando solo la massa depositata direttamente nel luogo di coltura cellulare, fornendo una valutazione più accurata della deposizione specificamente rilevante per l'esposizione cellulare.

Man mano che la tossicologia si muove verso modelli fisiologicamente più rilevanti, l'adozione di protocolli unificati di esposizione all'ALI sarà fondamentale per colmare il divario tra i risultati in vitro e le risposte umane in vivo , supportando in ultima analisi valutazioni più affidabili delle sostanze tossiche respiratorie e del loro impatto sulla salute.

Dichiarazioni

PG e BU sono impiegati presso SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. ETW ha completato uno stage presso SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. attraverso il programma Mitacs Accelerate. Gli altri autori non hanno conflitti da rivelare

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant 162273. CJB è stato sostenuto dal Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS). Questo studio è stato supportato anche da una sovvenzione Mitacs #IT34076 a ETW.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da centrifuga da 15 mL, rack (rack in polistirene), sterileMontreal Biotech Inc.
fiale di vetro da 30 mlThomas Scientific1755F32
A549 celluleATCCCCL-185
Antibiotico-antimicotico (100x)Wisent450-115-EL
Grinder per erbe di cannabis Genchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT
NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3
SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4
97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8
vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf
PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N
nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH
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ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v
OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F
-O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS
Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV
qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92
Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU
vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_
K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY
GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
CN3LXumyu8Q& dib_tag=se&
parole chiave=erba%2Bgrinder& qid=1736346511&
sprefix=erba%2Bgrinder%2Caps%
2C168& sr=8-10& th=1
Collagene da placenta umana, tipo IVSigma-AldrichC7521
Costar 12 mm transwell, 0,4 µ InsertiStemcell Technologies38023
Kit di rilevamento della citotossicità (LDH)Roche11644793001
Davinci MIQRO-C vaporizzatore per erbe seccheDAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
Dimetil solfossidoSigma-Aldrich34869
DMEM mediumWisent319-005-CL
Fiore di cannabis essiccatoSocié té qué bé coise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Valore&fv1=THC		Contenuto di cannabinoidi: 17– 23% di THC < 0,1% di CBD 
Siero fetale bovinoWisent080-150FBS
flexiWareSCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/Versione 8.4.1
GentamicinaWisent450-134-XL
Acido acetico glacialeSigma-Aldrich100063 
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
pacchetto di esposizione in vitro Expose expoCube   SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
Metanolo di grado LC/MSSigma-Aldrich106035
Soluzione salina tamponata con fosfatoThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask, TC Surface, Tappo filtroThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask, TC Surface, Tappo filtroThermoFisher Scientific
Tiazolo blu tetrazolio bromuroSigma-AldrichM 2128MTT
Triton X-100Sigma-Aldrich108603
Bagno pulitore ad ultrasuoniVWR18303Bagno sonicatore
Organizzatore settimanale di pilloleHealthSmart640-8223-0000
MBI601051C156499

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