Method Article

Assemblaggio modulare standardizzato di operoni policistronici con clonazione modulare (MoClo) utilizzando il toolkit In-Cloning

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un protocollo passo-passo che dimostra come la clonazione modulare (MoClo) possa essere adattata per la clonazione di operoni policistronici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I toolkit di clonazione modulare (MoClo) consentono l'assemblaggio rapido di costrutti multigenici. Si basano sulla clonazione Golden Gate, che utilizza enzimi di restrizione di tipo IIS che tagliano al di fuori del loro sito di riconoscimento. Poiché il riconoscimento e la sequenza di taglio sono disaccoppiati, le sporgenze create dagli enzimi di restrizione di tipo IIS possono essere scelte deliberatamente e le strategie di clonazione in genere impediscono il taglio di frammenti di DNA correttamente uniti. Ciò consente assemblaggi altamente efficienti di più frammenti di DNA in un'unica reazione. In MoClo, alle singole parti funzionali del DNA come i promotori, i siti di legame ribosomiale, le sequenze codificanti e i terminatori, così come agli assemblaggi di ordine superiore, vengono assegnate sporgenze standardizzate, in modo tale da poter creare librerie di parti riutilizzabili. La maggior parte dei toolkit di MoClo batterici sono progettati per la clonazione di unità trascrizionali monocistroniche e non forniscono un percorso strutturato per l'assemblaggio di operoni policistronici. Questo protocollo dimostra l'assemblaggio di unità di trascrizione policistronica con il toolkit In- & Out-Cloning . Lo stesso approccio è trasferibile ad altri toolkit MoClo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il clonaggio molecolare, l'introduzione di DNA ricombinante in un replicone come un plasmide, è una metodologia fondamentale in biologia molecolare. I metodi di costruzione e assemblaggio del DNA sono diventati sempre più sofisticati negli ultimi decenni. A questo punto, i ricercatori possono costruire interi cromosomi sintetici e persino genomi dal DNA sintetizzato1. Il clonaggio molecolare tradizionale si basa spesso su strategie di clonaggio ad hoc e può essere laborioso e costoso per grandi costrutti multi-gene2. Negli ultimi anni, la clonazione Golden Gate (GG) e i toolkit di clonazione modulare gerarchica derivata (MoClo) 2,3 sono diventati soluzioni popolari per consentire l'assemblaggio del DNA in termini di tempo e costi.

Gli enzimi di restrizione di tipo IIS sono endonucleasi che riconoscono una sequenza direzionale (non palindrroma) e si scindono al di fuori di questa sequenza di riconoscimento4. Di conseguenza, le sequenze di sporgenza create dalla scissione non dipendono dal sito di riconoscimento, ma possono essere scelte4. Inoltre, i frammenti di DNA funzionali, qui chiamati "parti", possono essere progettati in modo tale che la scissione rimuova il sito di riconoscimento dalle estremità delle parti da unire2. Le strategie di clonazione GG sfruttano questo aspetto per consentire efficienti assemblaggi di DNA in più parti in reazioni one-pot5. I toolkit MoClo si basano sulla clonazione GG e mirano a fornire un modo modulare e gerarchico per l'assemblaggio di costrutti multi-gene. Le sporgenze utilizzate per assemblare le parti sono standardizzate, consentendo la creazione di librerie di parti riutilizzabili e intercambiabili. I toolkit MoClo si basano su plasmidi accettori, progettati per accettare più sequenze di DNA e rilasciare il prodotto assemblato. Ogni plasmide accettore contiene due siti di riconoscimento di due diversi enzimi di tipo IIS, uno utilizzato per accettare il carico di DNA e l'altro per rilasciare il DNA 3,6 assemblato. Un'illustrazione di questo principio è mostrata nella Figura 1 per la clonazione di una singola parte, un terminatore, in un plasmide accettore MoClo (Livello 0). Sia il plasmide accettore che l'inserto vengono tagliati dall'enzima di restrizione BbsI, in modo da lasciare sporgenze compatibili e rimuovere i siti di riconoscimento BbsI. I plasmidi correttamente legati, quindi, non vengono più tagliati da BbsI. Il taglio del plasmide risultante con l'enzima di tipo IIS SapI rilascia il frammento precedentemente inserito nella successiva fase di assemblaggio (Livello 1).

In questo protocollo, viene utilizzato il toolbox MoClo per la clonazione in entrata e in uscita 7. Qui, i plasmidi di Livello 0 contengono parti genetiche fondamentali definite come promotori con regioni non tradotte 5' (UTR), sequenze codificanti e terminatori con 3'UTR, la Figura 1 mostra una panoramica schematica del Livello 0. Al Livello 1, più parti vengono assemblate in un'unità di trascrizione (TU), la Figura 2 mostra una panoramica schematica delle parti di Livello 1 e della clonazione. Clonazione in entrata e in uscita MoClo è stato progettato per l'assemblaggio senza cicatrici di unità di trascrizione di Livello 1 utilizzando un enzima di tipo IIS che crea sporgenze di 3 nucleotidi. Ciò consente alle sporgenze di essere completamente all'interno del raster del codone della sequenza di codifica, utilizzando i codoni di inizio ATG e di arresto TGA per l'assemblaggio. I livelli M e P sono utilizzati per l'assemblaggio di unità di trascrizione multiple rilasciate dai plasmidi di Livello1 3,8. La Figura 3 mostra una panoramica schematica delle parti per la clonazione nei livelli M e P e l'assemblaggio di un operone bicistronico nel livello M (un operone bicistronico è un'unità trascrizionale che esprime sequenze di codifica multiple (CDS)). I livelli P e M sono stati progettati per consentire il ciclo iterativo dall'uno all'altro, in modo tale che non vi sia alcun limite teorico al numero di parti che possono essere assemblate, questo tuttavia non è descritto in questo protocollo, poiché l'obiettivo principale di questo protocollo è mostrare l'assemblaggio di un operone bicistico. Sebbene non ci sia un limite al numero di parti che possono essere assemblate, esiste un limite alle dimensioni di un costrutto che può essere assemblato; fino a 100.000 bp è stato assemblato utilizzando un kit MoClo9. Inoltre, costrutti di grandi dimensioni o costrutti che contengono geni tossici possono causare un carico sulla cellula; Per questi casi, sono stati pubblicati protocolli modificati10.

L'In- and Out-Cloning inizialmente non descriveva uno schema per l'assemblaggio di unità di trascrizione policistronica. Gli operoni policistronici sono una modalità di organizzazione genica molto comune nei batteri 11,12,13 e, pertanto, c'è un notevole interesse per il loro assemblaggio dal basso verso l'alto in modo modulare 14. Qui viene descritto uno schema strutturato per l'assemblaggio di operoni policistronici utilizzando la clonazione in e in uscita. Lo schema presentato consente di scambiare facilmente la posizione delle sequenze codificanti all'interno delle unità di trascrizione policistronica, così come gli assemblaggi costituiti sia da trascrizione mono- che policistronica.

Il seguente protocollo passo-passo mostra la progettazione e la clonazione di un operone policistronico utilizzando la clonazione in entrata e in uscita. La strategia presentata per la clonazione delle unità di trascrizione policistronica può essere facilmente adattata ad altri toolkit MoClo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Questo protocollo descrive la progettazione e l'assemblaggio di un operone policistronico attraverso tre livelli dello standard di clonazione ( 0, 1 e M). L'operone policistronico qui assemblato inizia con un promotore, seguito da un sito di legame ribosomiale (RBS), una sequenza codificante (CDS), un secondo RBS, un secondo CDS e infine un terminatore (Figura S1). Si consiglia vivamente di utilizzare un software di clonazione molecolare per simulare la clonazione in silico, per garantire che la strategia di clonazione progettata sia corretta. Un esempio di assemblaggio di un promotore come parte di Livello 0, l'assemblaggio di un RBS con una sequenza di codifica e un terminatore in un'unità di trascrizione di Livello 1 e l'assemblaggio di un operone bicistronico nel Livello M è descritto qui, e una panoramica schematica dell'intero assemblaggio è mostrata nella Figura S1.

1. Livello 0: Addomesticamento delle parti

NOTA: Il termine "addomesticamento" è usato per indicare che una parte molecolare è stata integrata in una libreria di parti MoClo e può essere assemblata in tutti i livelli del kit MoClo. Tipicamente, tutti i siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione di tipo IIS utilizzati all'interno del kit vengono rimossi dalla parte da addomesticare, ad esempio mediante ricodifica sinonimi.

  1. Design dell'inserto
    1. Scegli le parti molecolari, come il promotore, il CDS e il terminatore, da assemblare insieme nell'operone.
      NOTA: In questo protocollo l'operone inizia con il promotore PLuxB, che può essere attivato dalla proteina LuxR in presenza del composto induttore N-(β-Ketocaproyl)-L-omoserina lattone (OC6)17. GFP è il primo CDS dell'operone; il suo RBS è iGEM BBa_B0064. La GFP è seguita da un linker non terminale, il "ponte terminatore". Il secondo CDS è mTurquoise. Il suo RBS è stato progettato da un calcolatore RBS18. Infine, l'operone termina con il terminatore L3S2P2119.
    2. Scegliere la posizione in cui la parte deve essere assemblata, una panoramica è mostrata nella Figura 1. In base alla posizione, scegliere il plasmide accettore da utilizzare nel GG.
      NOTA: Le parti possono essere addomesticate per un uso successivo in varie posizioni. Ad esempio, un promotore può essere assemblato come una singola parte collegandosi successivamente con una parte 5'UTR (pSL252), oppure può essere addomesticato con una 5'UTR già contenuta (pSL099). Un CDS può essere assemblato in quattro plasmidi accettori, da assemblare senza un tag (pSL102), da assemblare con un tag N-terminale (pSL104), da assemblare con un tag C-terminale (pSL101) o da assemblare sia con un tag N-terminale che con un tag C-terminale (pSL103). Nell'esempio dato, il promotore è addomesticato in pSL252, il primo RBS è addomesticato in pSL253, il primo CDS è addomesticato in pSL102, il ponte terminatore è addomesticato in pSL106, il secondo RBS è addomesticato in pSL099, il secondo CDS è addomesticato in pSL102 e il terminatore è addomesticato in pSL106.
    3. Aggiungere estensioni all'inserto progettato in base al plasmide accettore scelto. La Tabella 1 fornisce una panoramica dell'estensione richiesta per l'assemblaggio GG per plasmide accettore. Queste estensioni devono essere aggiunte durante la progettazione dei primer per la PCR, la progettazione degli oligo in caso di ricottura di due oligo per costruire una parte o durante la sintesi genica.
      NOTA: Affinché una parte possa essere addomesticata, è necessario assicurarsi che la parte stessa non contenga siti di riconoscimento degli enzimi di tipo IIS utilizzati all'interno del kit, SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') e BsaI (5'-GGTCTC-3'). La presenza di siti di riconoscimento nelle parti riduce drasticamente l'efficienza del corretto assemblaggio perché il prodotto finale può essere tagliato dall'enzima di tipo IIS utilizzato (vedi Figura 1).
  2. Reazione GG
    1. Per la reazione GG, aggiungere 50 fmol dell'inserto desiderato, 50 fmol del plasmide accettore, 1 μl di tampone DNA ligasi 10x T4, 1 μl di ligasi T4 e 1 μl di BbsI. Aggiungere acqua priva di nucleasi a un volume totale di 10 μl. Inoltre, includere un controllo negativo con la stessa reazione senza l'inserto desiderato.
    2. Eseguire il seguente programma in un termociclatore: 25 cicli di 37 °C per 3 minuti (37 °C è la temperatura ottimale dell'enzima di restrizione) e 16 °C per 4 minuti (16 °C è la temperatura ottimale della T4 ligasi), seguiti da una digestione finale a 50 °C per 20 minuti (a 50 °C, la T4 ligasi mostra un'attività molto scarsa o nulla, mentre l'enzima di restrizione è ancora in grado di funzionare, limitando così la quantità di plasmide accettore non tagliato nel prodotto finale) e un'inattivazione termica degli enzimi a 80 °C per 20 minuti (a 80 °C, tutti gli enzimi sono inattivati dal calore e la reazione è terminata)6.
    3. Trasformare la reazione GG aggiungendo 5 μL della reazione GG in 50 μL di cellule di E. coli chimicamente competenti ed eseguire una trasformazione per shock termico con una fase di recupero come descritto in un protocollo15 precedentemente pubblicato.
    4. Distribuire 100 μL dell'escrescenza di trasformazione su una piastra di agar Luria-Bertani (LB) con 100 μg/mL di spectinomicina. Incubare la piastra per una notte a 37 °C.
    5. Confrontare l'efficienza di trasformazione del controllo negativo con quella dell'assemblaggio completo contando il numero di colonie bianche su entrambe le piastre. Procedere al passaggio successivo se l'assemblaggio ha circa 10 volte (o più) colonie bianche rispetto al controllo negativo.
      NOTA: La maggior parte delle colonie risultanti dovrebbe essere bianca, con solo una piccola frazione di colonie rosse. I plasmidi accettori nel toolkit In-Cloning hanno una doppia cassetta di selezione, contenente mCherry (Livello 0 e Livello 1) o LacZα (Livello M e Livello P), e un gene ccdB, che codifica per un inibitore della girasi. La trasformazione della reazione GG viene eseguita in cellule di E. coli sensibili a ccdB, quindi solo le cellule che hanno il plasmide assemblato possono crescere, mentre il plasmide accettore originale non può essere propagato. Esempi di ceppi sensibili al ccdB includono DH5α e TOP10. mCherry/LacZα consente l'identificazione visiva delle cellule che sfuggono al meccanismo ccdB 16.
    6. Per ogni assemblaggio, coltivare due colonie bianche prelevando un po' di materiale della colonia con la punta di una pipetta e risospendendolo in 5 mL di terreno LB con 100 μg/mL di spectinomicina ciascuno e incubare per una notte a 37 °C in un incubatore agitatore a 250 giri/min. Eseguire un'estrazione plasmidica su colonna secondo le istruzioni del produttore. Verificare che il plasmide estratto abbia la sequenza prevista mediante sequenziamento Sanger.

2. Livello 1: Determinazione delle posizioni

NOTA: Il livello 1 è il livello tra l'addomesticamento delle parti e l'assemblaggio di un operone policistronico (Figura 2). Qui vengono determinate le posizioni degli assemblaggi intermedi nel costrutto finale. La posizione di un assemblaggio di Livello 1 all'interno dell'operone può essere modificata utilizzando un plasmide accettore di Livello 1 diverso. L'esempio fornito descrive l'assemblaggio di un'unità bicistronica, ma lo schema fornito può essere facilmente adattato per l'assemblaggio di un massimo di sei sequenze di codifica (con un RBS ciascuna). L'assemblaggio di più sequenze di codifica richiede inoltre il passaggio dal livello P al livello M. Con il ciclo iterativo tra il livello P e M, non esiste un limite superiore fisso al numero di sequenze di codifica che possono essere assemblate in un singolo operone.

  1. Scelta delle parti e dei plasmidi accettori
    1. Scegli le parti di livello 0 da assemblare in un'unità di trascrizione. Come minimo, questi devono includere un promotore, un CDS e un terminatore.
    2. Scegliere la posizione in cui l'unità di trascrizione deve essere assemblata nell'operone. In base a tale posizione, scegliere il plasmide accettore appropriato. Una panoramica è mostrata nella Figura 2.
      NOTA: I 7 frammenti di DNA per la costruzione dell'operone bicistronico mostrati come esempio sono assemblati in due costrutti di Livello 1. Il promotore, il primo RBS, il primo CDS e il ponte terminatore sono assemblati in pSL68; il secondo RBS, il secondo CDS e il terminatore sono assemblati in pSL69.
  2. Reazione GG
    1. Per la reazione GG, aggiungere 50 fmol di ciascuno degli inserti desiderati, 50 fmol del plasmide accettore, 1 μL di tampone DNA ligasi 10x T4, 1 μL di Ligasi T4 e 1 μL di SapI. Aggiungere acqua priva di nucleasi per un volume totale di 10 μl.
    2. Eseguire il seguente programma in un termociclatore: 25 cicli a 37 °C per 3 minuti e 16 °C per 4 minuti, seguiti da una digestione finale a 50 °C per 20 minuti e inattivazione termica degli enzimi a 80 °C per 20 minuti6.
    3. Opzionale: aggiungere 0,5 μL di SapI alla reazione GG e incubare a 37 °C per 1 ora.
      NOTA: SapI non è stabile come gli altri enzimi di restrizione di tipo IIS utilizzati. È stato riscontrato che una fase di digestione con SapI dopo la reazione GG riduce la quantità di colonie che trasportano il plasmide accettore relegato. SapI ha un isoschizomero, BspQI, che potrebbe non aver bisogno di questa fase finale di digestione.
    4. Trasformare 5 μl della reazione GG in 50 μl di cellule di E. coli chimicamente competenti ed eseguire una trasformazione per shock termico, preferibilmente con una fase di recupero come quella eseguita al punto 1.2.3.
    5. Piastra 100 μL dell'escrescenza di trasformazione su una piastra di agar LB con 100 μg/mL di ampicillina. Incubare la piastra per una notte a 37 °C.
    6. Per ciascuna, coltivare due colonie bianche prelevando del materiale della colonia con la punta di una pipetta e risospendendolo in 5 mL di terreno LB con 100 μg/mL di ampicillina ciascuno. Incubare per una notte a 37 °C in un incubatore vibrante a 250 giri/min. Eseguire un'estrazione plasmidica su colonna secondo le istruzioni del produttore.
    7. Confermare il corretto assemblaggio attraverso un digest di restrizione con BbsI, verificando che la dimensione del ritaglio corrisponda alla dimensione prevista dell'inserto. Digerire 1000 ng di DNA plasmidico aggiungendo 1 μL del tampone di digestione 10x appropriato e 1 μL di BbsI. Aggiungere acqua priva di nucleasi per un volume totale di 10 μL. Incubare la reazione a 37 °C per 15 minuti.
    8. Eseguire l'elettroforesi su gel caricando il plasmide digerito su un gel di agarosio all'1%, far funzionare il gel a 100 V per 35 minuti.
      NOTA: È possibile eseguire una digestione in silico del plasmide previsto per simulare un gel di agarosio per prevedere il risultato.

3. Livello M: Assemblaggio di un operone policistronico

NOTA: In questo passaggio, l'operone policistronico viene assemblato. Nel caso presentato di un operone bicisticonico, due inserti di livello 1 sono assemblati nelle posizioni 1 e 2. Di conseguenza, viene scelto il plasmide accettore pMA60. Inoltre, è necessario un terminatore di collegamento. Tutti i plasmidi accettori di livello M e P hanno la sporgenza GGGA come seconda sporgenza. I linker terminali fanno da ponte tra l'inserto e il plasmide accettore e consentono l'assemblaggio di un costrutto di livello P nel livello M e viceversa. Per un assemblaggio di livello P di due inserti di livello 1, viene utilizzato il leverer terminale pMA668 che occuperà la terza e ultima posizione. Una panoramica dei livelli M e P e una visualizzazione della fase di clonazione sono mostrate nella Figura 3. Con il montaggio esclusivamente sul livello M (o P), è possibile clonare operani fino a 6 sequenze di codifica (posizioni 1-6). La posizione 7 viene presa dal linker finale. L'assemblaggio di un numero maggiore di sequenze codificanti in un operone è possibile, ma richiede il passaggio al livello M (o P), che non è descritto in questo protocollo.

  1. Per la reazione GG, aggiungere 50 fmol di ciascun inserto desiderato, 50 fmol del plasmide accettore, 1 μl di tampone DNA ligasi 10x T4, 1 μl di ligasi T4 e 1 μl di BbsI. Aggiungere acqua priva di nucleasi per un volume totale di 10 μl.
  2. Eseguire il seguente programma in un termociclatore: 50 cicli a 37 °C per 3 minuti e 16 °C per 4 minuti, seguiti da una digestione finale a 50 °C per 20 minuti e inattivazione termica degli enzimi a 80 °C per 20 minuti6.
  3. Trasformare 5 μl della reazione GG in 50 μl di cellule di E. coli chimicamente competenti ed eseguire una trasformazione per shock termico con una fase di recupero come eseguito al punto 1.2.3.
  4. Distribuire 100 μL della crescita di trasformazione su una piastra di agar LB con 100 μg/mL di spectinomicina. Incubare la piastra per una notte a 37 °C o a 30 °C se si prevede un carico metabolico o una tossicità dell'assemblaggio.
  5. Per ogni assemblaggio, crea una cultura da due colonie bianche. A tal fine, immergere un puntale di pipetta nella colonia e utilizzarlo per inoculare 5 ml di LB con 100 μg/mL di spectinomicina. Incubare per una notte a 37 °C o 30 °C in un incubatore vibrante a 250 giri/min. Eseguire un'estrazione plasmidica su colonna secondo le istruzioni del produttore.
  6. Confermare il corretto assemblaggio tramite un digest di restrizione con BsaI, verificando che la dimensione dell'intaglio corrisponda alla dimensione prevista dell'inserto, come eseguito nel passaggio 2.2.7.
    NOTA: Il costrutto potrebbe essere troppo lungo per essere coperto dal sequenziamento Sanger per la conferma. Può quindi essere confermato dal sequenziamento dell'intero plasmide, che è disponibile come servizio commerciale da diversi fornitori di servizi di sequenziamento.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui vengono mostrati i risultati di un assemblaggio bottom-up di un operone policistronico dal Livello 0 al Livello M (Figura S1). L'operone inizia con il promotore PLuxB, che può essere attivato dalla proteina LuxR in presenza del composto induttore N-(β-Ketocaproyl)-L-omoserina lattone (OC6)17. GFP è il primo CDS dell'operone, il suo RBS è iGEM BBa_B0064. La GFP è seguita da un linker non terminale, il "ponte terminatore". Il secondo ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La clonazione molecolare può richiedere molto tempo e essere ingombrante, soprattutto con strategie di clonazione ad hoc. I toolkit MoClo possono migliorare il clonaggio molecolare grazie alla loro modularità, all'assemblaggio gerarchico e alle reazioni one-pot altamente efficienti. Si basano sull'assemblaggio del DNA attraverso le reazioni del Golden Gate. Grazie alle sporgenze standardizzate, le librerie di parti molecolari possono essere riutilizzate e condivise con altri

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAL, STdV e DS sono stati sostenuti dalla Max Planck Society nell'ambito del progetto MaxGENESYS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicillinaMerck Life ScienceA9518
Agar battericoFisher Scientific P0011B
BbsI-HFNew England BiolabsR3539
BsaI-HF V2New England BiolabsR3733
E. coli DH5α Cellule competenti
Eppendorf  Mastercycler  Nexus Thermal CyclersEppendorf6333000014
EzDrop 1000 Micro-Volume SpectrophotometroBlue-Ray BiotechBRED-1000
Kit Miniprep per plasmidi GeneJETThermo ScientificK0503
In- & Fuori - Kit degli attrezzi per la clonazione
Buffer della ligasiNew England BiolabsB0216
NaClFisher Scientific BP358
New Brunswick Innova®   42/42R - Shaker Incubatore ImpilabileEppendorfM1335-0080
PhenoBooth+Strumenti cantantiPHB-007
SapINew England BiolabsR0569
SpectinomicinaMerck Life ScienceS4014
Materiale standard per laboratorio
Ligasi del DNA T4New England BiolabsM0202
Thermomix MMB. Braun Biotech International
TriptoneFisher Scientific LP0042B
Estratto di lievitoFisher Scientific LP0021B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
  2. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765(2011).
  3. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  4. Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).
  5. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553(2009).
  6. de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly. Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).
  7. de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly. Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).
  8. Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors. ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).
  9. Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. Modular assembly of synthetic secondary chromosomes. Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).
  10. Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. Golden Gate Cloning: Methods and Protocols. , Springer, New York. (2025).
  11. Sun, G., et al. Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons. Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).
  12. Zhao, J., et al. Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification. Front Genet. 10, 1-12 (2019).
  13. Müntjes, K., et al. Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis. Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).
  14. Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis. ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).
  15. Green, R., Rogers, E. J. Chemical transformation of E. coli. Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).
  16. Köbel, T. S., et al. An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria. ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).
  17. Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. Escherichia coli "Marionette" strains with 12 highly optimized small-molecule sensors. Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).
  18. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nat Biotechnol. 27 (10), 946-950 (2009).
  19. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  20. Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli. Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).
  21. Messerschmidt, S. J., et al. Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli. Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Modular CloningGolden Gate CloningPolycistronic OperonsType IIS EnzymesDNA AssemblyMultigene ConstructsStandardized OverhangsRibosome Binding SiteHeat Shock TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles