Analisi completa delle piastrine procoagulanti che presentano caratteristiche di necrosi, apoptosi e attivazione piastrinica

Summary

Il presente protocollo fornisce una serie completa di procedure necessarie per analizzare le piastrine procoagulanti, che presentano caratteristiche sovrapponibili di necrosi, apoptosi e attivazione piastrinica.

Abstract

Le piastrine che circolano nel flusso sanguigno sono relativamente quiescenti, ma si "attivano" quando incontrano stimolanti o "agonisti" nel sito della lesione dei vasi sanguigni. Le piastrine proaggregatorie e procoagulanti rappresentano due popolazioni distinte di piastrine attivate. Mentre le piastrine proaggregatorie facilitano la cessazione del sanguinamento, o "emostasi", formando un tappo di piastrine raggruppate insieme attraverso ponti di fibrinogeno, le piastrine procoagulanti accelerano notevolmente la cascata della coagulazione, culminando nella formazione di coaguli di fibrina. Un aspetto interessante delle piastrine procoagulanti è che la loro morfologia presenta alcune caratteristiche di "necrosi" e "apoptosi". Possono quindi rappresentare una forma di morte cellulare nelle piastrine, anche se con un ruolo importante nella trombosi e nell'emostasi. Questo articolo introduce il concetto di piastrine procoagulanti, la loro rilevanza per la salute e la malattia e un confronto tra i metodi esistenti per la loro analisi. Fornisce quindi protocolli completi per l'analisi delle piastrine procoagulanti, lo studio dei meccanismi della loro formazione e la valutazione del loro ruolo protrombotico nel facilitare la coagulazione. L'articolo si conclude con una discussione dei passaggi chiave, delle limitazioni e dei principi di risoluzione dei problemi per i metodi descritti.

Introduction

Esistono almeno due popolazioni distinte di piastrine attivate ^1,2. Le piastrine proaggregatorie sono caratterizzate da un'elevata attivazione delle integrine e da una bassa, se nulla, esposizione al PS. D'altra parte, le piastrine procoagulanti sono caratterizzate da una bassa attività delle integrine e da un'elevata esposizione al PS ^1,2, fornendo una superficie per l'assemblaggio dei complessi tenasi e protrombonasi³, che è 10^{5-10 6} volte e 300000 volte più attiva dei singoli fattori di fase solubili IXa e Xa, rispettivamente⁴. Le piastrine procoagulanti accelerano quindi notevolmente la coagulazione. Un aspetto interessante delle piastrine procoagulanti è che la loro morfologia assomiglia ad alcune caratteristiche della "necrosi" come la microvescicolazione, il ballooning della cellula con distruzione del citoscheletro e la perdita dell'integrità della membrana, così come quelle dell'"apoptosi" come la perdita dell'asimmetria fosfolipidica di membrana con esposizione della fosfatidilserina nel lembo esterno ^5,6. In altre parole, la formazione di piastrine procoagulanti può rappresentare una forma di morte cellulare nelle piastrine, anche se con un'importante funzione fisiologica nell'emostasi.

Le piastrine procoagulanti sono significativamente associate a disturbi trombotici. Mentre la maggior parte degli individui sani non ha piastrine procoagulanti circolanti, ~30% delle piastrine normali del donatore adotta un fenotipo procoagulante ex vivo dopo l'esposizione a forti agonisti come trombina e collagene⁷. Le piastrine procoagulanti circolanti sono state riportate nei traumi, dove la loro formazione può riflettere l'attivazione da parte dell'istone H4 ^8,9. Nella maggior parte dei disturbi protrombotici, tuttavia, l'aumento dei livelli di piastrine procoagulanti viene rilevato solo dopo la stimolazione ex vivo ¹⁰. Ad esempio, i pazienti con ictus acuto in cui il >51,1% delle loro piastrine è stato convertito in piastrine procoagulanti (note anche come piastrine COATed) da collagene e trombina avevano un hazard ratio di 10,72 per ictus ricorrente entro 30 giorni rispetto ai pazienti con minore formazione di piastrine procoagulanti¹¹. Risultati simili sono stati riportati in pazienti con attacchi ischemici transitori e aterosclerosi carotidea¹². Al contrario, la sindrome di Scott è il risultato di una mutazione di ANO6, che codifica per la fosfolipide scramblasi TMEM-16F, che porta a una carenza di esposizione piastrinica al PS¹³. I disturbi emorragici idiopatici e il sanguinamento intracranico possono essere associati a una ridotta capacità di generare piastrine procoagulanti¹⁴.

Pertanto, la valutazione delle piastrine procoagulanti fa parte di qualsiasi analisi della funzione piastrinica non solo durante le indagini di base sui meccanismi di attivazione piastrinica e conseguente trombosi ed emostasi, ma anche durante l'analisi clinica per il rischio di trombosi o sanguinamento nei pazienti durante vari stati patologici. Un gruppo di esperti scientifici della Società internazionale per la trombosi e l'emostasi (ISTH) ha raccomandato l'uso del legame dell'annessina V e dell'espressione della P-selectina mediante citometria a flusso per distinguere i procoagulanti da altre sottopopolazioni piastriniche¹⁵. L'articolo discute anche i vari metodi che possono essere utilizzati per analizzare le piastrine procoagulanti e apoptotiche, ma non riesce a descrivere i processi in dettaglio. Questi metodi includono il rilevamento di (1) attivazione piastrinica da parte di PAC1/JonA o legame del fibrinogeno (citometria a flusso); (2) secrezione di granuli alfa mediante espressione di P-selectina (citometria a flusso); (3) esposizione al PS mediante legame con l'annessina V/lattaferina (citometria a flusso); (4) perdita di integrità della membrana mediante marcatura GSAO (citometria a flusso); (5) cambiamenti morfologici come il ballooning (microscopia); (6) rilevamento dell'attivazione delle caspasi mediante saggio delle caspasi (immunoblotting/luminometria/citometria a flusso) o degradazione del substrato citoscheletrico gelsolina (immunoblotting); (7) perdita del potenziale di membrana mitocondriale da parte di coloranti sensibili al potenziale mitocondriale come JC-1/Mitotracker (citometria a flusso); (8) marcatori apoptotici intrinseci mitocondriali Bax, Bak e rilascio di citocromo c (immunoblotting); (9) funzione procoagulante mediante saggio di generazione di trombina e legame del fattore della coagulazione Xa/Va (citometria a flusso, microscopia); (10) Aumento citosolico e mitocondriale del calcio mediante coloranti fluorescenti sensibili al calcio (citometria a flusso, fluorimetria, microscopia).

Il presente studio approfondisce i protocolli completi per l'analisi delle piastrine procoagulanti e per distinguerle dalle piastrine proaggregatorie e apoptotiche. La maggior parte delle procedure descritte si basa sulla citometria a flusso che presenta i vantaggi di (1) essere prontamente disponibile e facile da usare, (2) richiedere un basso volume di campione e (3) consentire il rilevamento simultaneo di più sottopopolazioni di piastrine (proaggregatorie, procoagulanti e apoptotiche)¹⁵. Questi protocolli basati sulla citometria a flusso sono integrati con saggi funzionali dell'attività procoagulante basati sul legame del fattore della coagulazione e saggi di generazione di trombina basati su coaguli.

Protocol

I partecipanti umani sono stati reclutati nello studio per il prelievo di sangue venoso periferico dopo aver ottenuto il consenso informato scritto, seguendo rigorosamente le raccomandazioni e l'approvazione dell'Institutional Review Board del Cleveland Clinic Lerner Research Institute, con tutte le metodologie di studio conformi agli standard stabiliti dalla Dichiarazione di Helsinki. Sono stati inclusi i partecipanti adulti sani di età superiore ai 18 anni, mentre quelli di età inferiore ai 18 anni, gli individui con una storia recente di eventi trombotici negli ultimi sei mesi, quelli con una storia di alcolismo o abuso di droghe e i partecipanti che avevano usato farmaci antipiastrinici o anticoagulanti nelle ultime quattro settimane sono stati esclusi. Una descrizione dettagliata dei materiali e dei reagenti utilizzati nei protocolli è disponibile nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione delle piastrine

1. Prelevare campioni di sangue venoso periferico nell'anticoagulante ACD (1:9 v/v) da partecipanti umani dopo aver ottenuto il consenso informato scritto, seguendo rigorosamente le raccomandazioni approvate dall'Institutional Review Board.
2. Centrifugare il sangue raccolto in ACD a 100 x g per 20 minuti a 22 °C per ottenere plasma ricco di piastrine (PRP) come surnatante.
3. Centrifugare il PRP a 800 x g per 7 minuti a 22 °C dopo aver aggiunto 3 μM di PGE₁ e 2 mM di EDTA.
4. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet piastrinico nel tampone A (vedere la Tabella dei materiali) mediante pipettaggio delicato.
5. Centrifugare le piastrine risospese nel tampone A a 800 x g per 7 minuti a 22 °C.
6. Risospendere il pellet piastrinico nel tampone B (vedere la Tabella dei materiali) mediante pipettaggio delicato.
7. Regolare la conta piastrinica finale su 1 × 10⁷/mL utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
   NOTA: Eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili e prendere precauzioni per mantenere le piastrine in uno stato di riposo evitando l'esposizione a tagli eccessivi durante il pipettaggio.

2. Analisi delle piastrine procoagulanti mediante citometria a flusso

1. Integrare le piastrine umane lavate con 2,5 mM di calcio (0,5 μL di soluzione madre di CaCl₂ 0,5 M in 100 μL di sospensione piastrinica).
2. Mantenere una frazione di piastrine non stimolata e stimolare le frazioni rimanenti con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL, 0,5 U/mL), convulssina (20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL) o la loro combinazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Dopo la stimolazione, aggiungere 1 μL di PE-Annexina V, FITC-PAC1 e anticorpo APC-anti-umano CD62P a 100 μL di sospensioni piastriniche stimolate.
4. Incubare le piastrine al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.
5. Fissare le piastrine aggiungendo un volume uguale (1:1) di formalina al 2%.
6. Analizzare i campioni mediante citometria a flusso per quantificare le piastrine procoagulanti^15,16.
7. Disegna un cancello amorfo per avvolgere le piastrine, separandole dal rumore e dalle particelle multi-piastriniche.
8. Raccogli tutti i dati di fluorescenza utilizzando l'amplificazione logaritmica a quattro quadranti per 10.000 eventi nel gate piastrinico da ciascun campione.
9. Definire le regioni per le piastrine in base alla positività o negatività della fluorescenza per l'esposizione alla fosfatidilserina (PS) (legame dell'annessina V), all'espressione della P-selectina (CD62P) e all'attivazione dell'integrina αIIbβ₃ (legame PAC1).
10. Considerare le piastrine positive sia per l'esposizione al PS (legame con l'annessina V) che per l'espressione della P-selectina (CD62P), ma negative per l'attivazione dell'integrina αIIbβ₃ (legame PAC1) come piastrine procoagulanti (Figura 1) (Tabella 1).
11. Allo stesso modo, si considerino le piastrine positive sia per l'attivazione dell'integrina αIIbβ₃ (legame PAC1) che per l'espressione della P-selectina (CD62P), ma negative per l'esposizione al PS (legame dell'annessina V) come piastrine proaggregatorie.
    NOTA: Le piastrine negative sia per l'attivazione dell'integrina αIIbβ₃ (legame PAC1) che per l'espressione della P-selectina (CD62P), ma positive per l'esposizione al PS (legame dell'annessina V) sono probabilmente piastrine apoptotiche^15,16.

3. Analisi del calcio mitocondriale mediante citometria a flusso

1. Diluire le piastrine umane lavate a 1 × 10⁶/mL e integrare con 2,5 mM di calcio (0,5 μL di soluzione madre di CaCl₂ 0,5 M in 100 μL di sospensione piastrinica).
2. Etichettare le piastrine con 5 μM di Rhod-2 AM (per il calcio mitocondriale) per 30 minuti al buio.
3. Applicare le piastrine in modo appropriato, come descritto al punto 2.
4. Analizza gli eventi nel gate piastrinico per le variazioni dipendenti dal tempo nella fluorescenza media degli eventi acquisiti nell'arco di 5 minuti utilizzando un grafico a dispersione di densità della fluorescenza PE (per Rhod-2 AM) rispetto al tempo.
5. Registrare i livelli basali di calcio per il primo 1 minuto.
6. Aggiungere trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulxina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o la loro combinazione e continuare ad acquisire dati per altri 4 minuti¹⁷.

4. Analisi del potenziale di membrana mitocondriale mediante citometria a flusso

1. Integrare le piastrine umane lavate con 2,5 mM di calcio (0,5 μL di soluzione madre di CaCl₂ 0,5 M in 100 μL di sospensione piastrinica).
2. Mantenere una frazione di piastrine non stimolata e stimolare le frazioni rimanenti con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulssina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o la loro combinazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Dopo la stimolazione, aggiungere il colorante di marcatura dei mitocondri (vedi Tabella dei materiali) a una concentrazione finale di 500 nM alle sospensioni piastriniche stimolate.
4. Incubare le piastrine per 30 minuti al buio.
5. Fissare le piastrine aggiungendo un volume uguale di formalina al 2%.
6. Analisi dei campioni mediante citometria a flusso¹⁷.
7. Applicare le piastrine in modo appropriato come descritto al punto 2.
8. Analizzare gli eventi nel gate piastrinico per un calo della fluorescenza nel canale PE (per il colorante di marcatura dei mitocondri) del citometro a flusso.

5. Analisi dell'attività della caspasi 3 e della caspasi 8 mediante citometria a flusso

1. Integrare le piastrine umane lavate con 2,5 mM di calcio (0,5 μL di soluzione madre di CaCl₂ 0,5 M in 100 μL di sospensione piastrinica).
2. Mantenere una frazione di piastrine non stimolata e stimolare le frazioni rimanenti con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulssina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o la loro combinazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Dopo la stimolazione, aggiungere alle sospensioni piastriniche stimolate un reagente per la rilevazione dell'apoptosi 1:1000 (v/v) (vedere la Tabella dei materiali) o 1:300 (v/v) FITC-IETD-FMK (per la caspasi 8 della via dell'apoptosi estrinseca).
4. Incubare le piastrine per 30 minuti al buio.
5. Fissare le piastrine aggiungendo un volume uguale di formalina al 2%.
6. Analisi dei campioni mediante citometria a flusso¹⁷.
7. Applicare le piastrine in modo appropriato, come descritto al punto 2.
8. Analizzare gli eventi nel gate piastrinico per la fluorescenza nel canale FITC (per la caspasi 3/7 o la caspasi 8) del citometro a flusso.

6. Analisi del legame della protrombina mediante citometria a flusso

1. Coniugare la protrombina bovina con il colorante Alexa Fluor 488 utilizzando un kit di marcatura delle proteine (vedere la Tabella dei materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
2. Integrare le piastrine umane lavate con 2,5 mM di calcio (0,5 μL di soluzione madre di CaCl₂ 0,5 M in 100 μL di sospensione piastrinica).
3. Mantenere una frazione di piastrine non stimolata e stimolare le frazioni rimanenti con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulssina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o la loro combinazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Dopo la stimolazione, aggiungere protrombina bovina coniugata con AF488 (100 μg/mL) e 1 μL ciascuno di PE-Annexina V e anticorpo CD62P umano APC a 100 μL di sospensioni piastriniche stimolate.
5. Fissare le piastrine aggiungendo un volume uguale di formalina al 2%.
6. Analizzare i campioni mediante citometria a flusso¹⁷ per la quantificazione del legame della protrombina alle piastrine.
7. Disegna un cancello amorfo per inglobare le piastrine, separate dal rumore e dalle particelle multi-piastriniche.
8. Raccogli tutti i dati di fluorescenza utilizzando l'amplificazione logaritmica a quattro quadranti per 10.000 eventi nel gate piastrinico da ciascun campione.
9. Disegnare le regioni per le piastrine con fluorescenza positiva o negativa per l'esposizione al PS (legame dell'annessina V), l'espressione della P-selectina (CD62P) e la AF488-protrombina (legame della protrombina).
10. Determinare la proporzione di tutti gli eventi piastrinici, nonché la proporzione di piastrine positive sia per l'esposizione alla PS (legame dell'annessina V) che per l'espressione della P-selectina (CD62P) (piastrine procoagulanti), che sono positive per il legame della protrombina.

7. Analisi del legame della protrombina mediante microscopia confocale

1. Coniugare la protrombina bovina con il colorante Alexa Fluor 488 utilizzando un kit di marcatura delle proteine (vedere la Tabella dei materiali), seguendo le istruzioni del produttore.
2. Integrare le piastrine umane lavate con 2,5 mM di calcio (0,5 μL di soluzione madre di CaCl₂ 0,5 M in 100 μL di sospensione piastrinica).
3. Mantenere una frazione di piastrine non stimolata e stimolare le frazioni rimanenti con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulssina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o la loro combinazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Dopo la stimolazione, aggiungere protrombina bovina coniugata con AF488 (100 μg/mL) e 1 μL ciascuno di PE-Annexina V e anticorpo CD62P umano APC a 100 μL di sospensioni piastriniche stimolate.
5. Fissare le piastrine aggiungendo un volume uguale di formalina al 2%.
6. Pellettare le piastrine fissate su vetrini coprioggetti rivestiti di poli-D-lisina.
7. Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini per microscopia utilizzando una soluzione anti-sbiadimento.
8. In alternativa, rivestire i vetrini coprioggetti con collagene (100 μg/mL) per 1 ora in una camera umida.
9. Bloccare i vetrini coprioggetti rivestiti con lo 0,5% di BSA in PBS per 1 ora.
10. Etichettare le piastrine con protrombina bovina coniugata AF488 (100 μg/mL) e 1 μL di PE-Annexina V e anticorpo APC anti-CD62P umano.
11. Lasciare aderire le piastrine etichettate per 20 minuti sui vetrini coprioggetti rivestiti di collagene.
12. Lavare i vetrini coprioggetti con piastrine aderenti tre volte con PBS.
13. Fissare i vetrini coprioggetti con paraformaldeide al 2% per 1 ora.
14. Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini per microscopia utilizzando una soluzione anti-sbiadimento.
15. Osservare i vetrini al microscopio confocale con un ingrandimento dell'obiettivo del 63×.
16. Analizza le immagini utilizzando il software Fiji per la quantificazione della fluorescenza.

8. Saggio di generazione di trombina piastrinica fosfolipide dipendente da coaguli

1. Integrare le piastrine umane lavate con 2,5 mM di calcio (0,5 μL di soluzione madre di CaCl₂ 0,5 M in 100 μL di sospensione piastrinica).
2. Mantenere una frazione di piastrine non stimolata e stimolare le frazioni rimanenti con trombina (0,1 U/mL, 0,25 U/mL o 0,5 U/mL), convulssina (20 ng/mL, 50 ng/mL o 100 ng/mL) o la loro combinazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Aggiungere 100 μL di piastrine trattate a una miscela di 50 μL di plasma normale aggregato e 50 μL di soluzione di caolino a bassa torbidità (20 mg/mL), preincubata a 37 °C per 5 minuti.
4. Aggiungere 5 mM di CaCl₂ alla miscela.
5. Monitorare la formazione del coagulo mediante torbidimetria su un lettore di micropiastre, misurando l'assorbanza a 660 nm ogni 60 s per 1 ora.

Results

Una percentuale di piastrine attivate diventa "procoagulante" con un caratteristico aumento dell'espressione superficiale sia della fosfatidilserina (PS) che della P-selectina, che le distingue dalle piastrine "apoptotiche" che sono positive solo per l'esposizione al PS e dalle piastrine "proaggregatorie" che sono positive per l'espressione della P-selectina. Abbiamo scoperto che la trombina induce un aumento dose-dipendente della proporzione di piastrine procoagulanti positive sia per l'espressione di P-selectina che di...

Discussion

Le piastrine procoagulanti mostrano aumenti marcati e sostenuti del calcio intracellulare dopo la stimolazione²⁶, ma possono essere derivati attraverso meccanismi diversi. Vengono generati in seguito a una forte stimolazione con agonisti con collagene e trombina attraverso mediatori distinti, tra cui il più importante afflusso di calcio mitocondriale^18,19 lungo il gradiente elettrochimico attraverso la mem...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione di destrosio citrato acido (ACD) (per 1000 mL)			Tri- Citrato di sodio-                     22 g Acido Citrico-                                                    8 g Destrosio-                                                          24,5 g Acqua-                                                                    Volume di reintegro fino a 1000 ml
Kit di etichettatura delle proteine Alexa Fluor 488	Invitrogen	A10235
APC Topo Anti-Umano CD62P	BD Pharmingen	550888
Protrombina Bovina	Prolytix	BCP-1010
Tampone A (Preparazione			)                                      M.W                Conc. in 1X          Per 100 mL di soluzione 10X HEPES              238,30                20 mM                                      4.766 g NaCl                          58,44            134 mM                                    7,83 g KCl                              74,55              2,9 mM                            216,19 mg MgCl2                  203,30                    1 mM                          203,30 mg NaH2PO4      156,01              0,34 mM                              53,04 mg NaHCO3              84 01                    12 mM                     1,01 g Acqua a 100 mL dopo aver regolato il pH a 6,2 Diluire la soluzione 10X 1:10 (v/v) con acqua Milli Q appena prima della preparazione piastrinica per ottenere la soluzione 1X che deve essere integrata con i seguenti                                 Conc. in 1X          Per 1 ml di soluzione 1X EGTA                   1 mM           Aggiungi 10 μ L (1:100 v/v) 100 mM EGTA  Glucosio               5 mM         Aggiungi 5 μ L (1:200 v/v) 1 M glucosio PGE1                     3 μ M         Aggiungi 3 μ L (1:333 v/v) 1 mM Soluzione PGE1
Tampone B (preparazione piastrinica)			M.W                Conc. in 1X          Per 100 mL di soluzione 10X HEPES              238,30                20 mM                                      4.766 g NaCl                          58,44            134 mM                                    7,83 g KCl                              74,55              2,9 mM                            216,19 mg MgCl2                  203,30                    1 mM                          203,30 mg NaH2PO4      156,01              0,34 mM                              53,04 mg NaHCO3              84 01                    12 mM                     1,01 g Acqua a 100 mL dopo aver regolato il pH a 7,4 Diluire la soluzione 10X 1:10 (v/v) con acqua Milli Q appena prima della preparazione piastrinica per ottenere la soluzione 1X che deve essere integrata con i seguenti                                 Conc. in 1X          Per 1 ml 1X soluzione Glucosio               5 mM         Aggiungi 5 μ L (1:200 v/v) 1 M di glucosio
CaCl2 (0,5 M) (per 50 ml)			Peso molecolare di CaCl2.2H2O = 147,02 Sciogliere 3,675 g di CaCl2.2H2O in 50 ml di acqua Milli Q
CellEvent Caspase-3/7 Reagenti di rilevamento Verde	Invitrogen	C10423	Reagente per la rilevazione dell'apoptosi
Convulxin	Enzo Life Sciences	ALX-350-100
EDTA (0,5 M; pH 8) (per 100 mL)			Peso molecolare di EDTA Na2.2H2 O: 372.24g Pesare 18.612 g e sospendere in 50 ml di acqua Milli Q e controllare il pH (pH~4) Aggiungere lentamente 10N NaOH agitando e monitorare il pH. L'EDTA inizia a solubilizzarsi a circa pH 7 ed è completamente solubile a pH 8. Portare il volume a 100 ml con acqua Milli Q.
EGTA (100 mM; pH 7,4) (per 100 mL)			Peso molecolare: 380,4 Aggiungere 3,804 g di EGTA in 50 ml di acqua Milli Q e controllare il pH (pH~3) Aggiungere 10 N di NaOH goccia a goccia mescolando e monitorare il pH EGTA diventa solubile a pH 7,0 (circa) Regolare il pH a 7,4 Portare il volume a 100 ml con acqua
Milli QFITC Mouse Anti-Human PAC-1	BD	340507
FITC-IETD-FMK Kit di colorazione Caspasi 8 (attivo)	Abcam	ab65614
Mitotracker Rosso CMXRos (colorante per marcatura mitochinaria)	Invitrogen	M7512	Stock= 1 mM (50 µ g disciolto in 90 µ l DMSO) Sub-stock= 100 µ M (10 µ l Magazzino + 90 µ l DMSO) Concentrazione di lavoro= 500nM (0,5 µ l in 100 µ l)
PE Annessina V	BD Pharmingen	560930
Prostaglandina E1	Sigma	P5515	Stock = 20 mM (1 mg disciolto in 141 µ L DMSO) Sub-stock= 1 mM (10 µ l Magazzino + 190 µ L DMSO) Concentrazione di lavoro= 3 µ M (3 µ L in 1 mL)
Rhod-2 AM	Invitrogen	R1244	Stock = 5 mM (1 mg disciolto in 178 µ L DMSO) Sub-stock= 100 µ M (10 µ L Stock + 90 µ L DMSO) Concentrazione di lavoro= 500 nM (0,5 µ L su 100 µ L)
Trombina da plasma umano	Sigma	T7572