Ottimizzazione dell'isolamento e della purificazione delle cellule mesangiali glomerulari murine

Summary

Questo studio ha sviluppato un protocollo ottimizzato per l'isolamento di cellule mesangiali murine (MC) e la loro coltura cellulare ex vivo . Queste cellule possono essere fatte passare più volte, congelate, rianimate e coltivate senza compromettere la crescita cellulare o l'espressione proteica.

Abstract

Le cellule mesangiali (MC) sono cellule stromali situate nello spazio medio del glomerulo, con funzioni fondamentali nell'omeostasi glomerulare. Metodi per isolare, purificare e coltivare MC glomerulari sono stati sviluppati e ottimizzati a partire dagli anni '80 per l'uso nella ricerca biomedica, in particolare nel campo della nefrologia. I topi sono i modelli animali sperimentali più frequentemente utilizzati nella ricerca sulle malattie renali. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per l'isolamento di MC murini e la coltura cellulare ex vivo . Queste cellule possono essere fatte passare più volte, congelate, rianimate e coltivate senza compromettere la crescita cellulare o l'espressione proteica. Questo approccio ottimizzato riduce significativamente la durata dello studio per i ricercatori e consente la conservazione cellulare a lungo termine. L'attrezzatura necessaria per le procedure è facilmente accessibile in un laboratorio biomedico di base e le fasi procedurali sono semplici. L'acquisizione delle cellule bersaglio richiede solo 2-3 settimane, una riduzione di almeno 1 settimana rispetto ai metodi esistenti.

Introduction

Il glomerulo è una rete di capillari che svolge il compito essenziale di filtrare il sangue per formare l'urina¹. Le cellule mesangiali (MC) sono incorporate all'interno della matrice mesangiale, situata tra i capillari glomerulari, e sono posizionate in modo univoco per influenzare la dinamica glomerulare attraverso le loro diverse funzioni². I MC svolgono ruoli cruciali nel glomerulo, tra cui lo sviluppo glomerulare, il supporto strutturale per i capillari glomerulari, la fagocitosi e la produzione della matrice della membrana basale glomerulare³. Lo studio delle cellule mesangiali è fondamentale per far progredire la nostra comprensione della fisiologia e della patologia renale.

Degno di nota è anche il coinvolgimento delle cellule mesangiali in condizioni patologiche. In risposta a lesioni o malattie glomerulari, come la nefropatia diabetica o la glomerulonefrite, le cellule mesangiali possono proliferare e secernere componenti della matrice extracellulare in eccesso, portando a glomerulosclerosi e compromissione della funzionalità renale ^4,5. Comprendere le funzioni e i meccanismi di regolazione delle cellule mesangiali è, quindi, essenziale per lo sviluppo di strategie terapeutiche per le malattie renali.

Le cellule mesangiali murine consentono ai ricercatori di modellare ed esplorare i processi molecolari e cellulari coinvolti in condizioni come la nefropatia IgA⁶, la nefropatia diabetica⁷ e la glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS)^8,9. Dato il loro ruolo nella fibrosi renale e nell'infiammazione, le MC glomerulari murine sono spesso utilizzate negli studi clinici per valutare l'efficacia dei composti terapeutici ^9,10. Inoltre, le cellule mesangiali murine sono uno strumento importante per studiare gli effetti di varie vie di segnalazione sulla funzione renale, tra cui la via RhoA/ROCK¹¹ e la via¹² del fattore di crescita trasformante-beta (TGF-β). Questi studi aiutano a chiarire come queste molecole di segnalazione contribuiscano alla progressione della malattia renale. Utilizzate per la modellazione delle malattie, lo sviluppo terapeutico o la ricerca sulla trasduzione del segnale, le MC murine continuano a fungere da risorsa cruciale per far progredire la nostra comprensione della salute e delle malattie renali.

Mackay et al. hanno stabilito un metodo per acquisire linee cellulari ex vivo di cellule epiteliali glomerulari, mesangiali ed endoteliali da topi transgenici nel 1988¹³. Wilson e Stewart hanno sviluppato un metodo per isolare e purificare i MC primari dal tessuto renale del paziente, che prevede tre cicli di setacciatura e un ampio lavaggio con terreno¹⁴. Menè e Stoppacciaro hanno anche proposto un metodo per isolare le MC primarie dal tessuto renale del paziente o del ratto. Questa tecnica prevede due cicli di setacciatura, due spinte dell'ago e la digestione della collagenasi. Le cellule ottenute da 4-8 reni di ratto sono piastrate su una piastra a sei pozzetti, anche se la resa è relativamente bassa¹⁵. Questi metodi richiedono la dissezione dei reni in piccoli pezzi prima della lavorazione. Inoltre, questi approcci richiedono circa 3-4 settimane per produrre MC purificati.

I topi sono i modelli animali sperimentali più frequentemente impiegati nella ricerca sulle malattie renali. Tuttavia, manca ancora un metodo sistematico per isolare i MC murini. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per l'isolamento di MC murini e la coltura cellulare ex vivo . Questo metodo può essere impiegato quando si utilizzano MC primari di rene murino per la ricerca sperimentale. Rispetto ai metodi precedenti, questo approccio elimina la necessità di tagliare e setacciare i tessuti prima della digestione. Invece, l'intero rene del topo viene macinato utilizzando un macinatore cellulare e digerito direttamente con collagenasi. La soluzione di digestione viene quindi setacciata due volte, con tutte le cellule raccolte sul secondo setaccio e risospese. Questo metodo consente a due reni di topo di produrre abbastanza cellule per seminare due o tre piastre di coltura da 100 mm entro 10 giorni. I MC purificati vengono successivamente ottenuti attraverso la coltura e la purificazione utilizzando un terreno specializzato contenente D-valina. Queste cellule possono essere fatte passare più volte, congelate, rianimate e coltivate senza compromettere la crescita cellulare o l'espressione proteica. L'attrezzatura necessaria per queste procedure è facilmente disponibile per i laboratori biomedici di base e l'intero processo richiede solo 2-3 settimane per ottenere le cellule bersaglio. Questo metodo è adatto per studi che coinvolgono MC murini per studiare malattie o meccanismi correlati ai reni, poiché è efficiente e fa risparmiare tempo.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati conformi alle linee guida ARRIVE e tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con la legislazione nazionale e la direttiva della Commissione europea (2010/63/UE). I topi sono stati alloggiati e mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni, in conformità con i requisiti dei comitati per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale della Cina occidentale, Università del Sichuan. Tutti gli studi sperimentali sugli animali sono stati approvati dai comitati per la cura e l'uso degli animali del West China Hospital, Università del Sichuan. Topi maschi C57BL/6JGpt di otto settimane sono stati utilizzati per l'isolamento delle cellule mesangiali in questo test. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali. La Figura 1 illustra le procedure per l'isolamento e la purificazione delle cellule mesangiali glomerulari murine.

1. Preparazione di reagenti per l'isolamento di MC murini

NOTA: Assicurarsi che tutti i reagenti e le attrezzature siano sterili.

1. Collagenasi di tipo I (750 U/mL): pesare la polvere e scioglierla poco prima dell'uso in RPMI 1640.
2. Terreno di coltura cellulare mesangiale 1: Miscelare RPMI 1640 con 2 mM di glutammina, FBS al 17%, antibiotici (100 unità/mL di penicillina più 10.000 μg/mL di streptomicina) e 0,1 U/mL di insulina.
3. Terreno di coltura cellulare mesangiale 2: combinare RPMI 1640 (D-valina) con 2 mM di glutammina, FBS al 10%, antibiotici (100 unità/mL di penicillina più 10.000 μg/mL di streptomicina), ITS-G (insulina, transferrina, soluzione di selenio 100x) e 0,1 U/mL di insulina. Conservare i terreni di coltura cellulare mesangiale a 4 °C e utilizzarli entro 1 mese dalla preparazione.
4. Terreni di crioconservazione cellulare: Preparare una miscela di terreno RPMI 1640, siero e DMSO in un rapporto 7:2:1.

2. Isolamento dei MC murini

1. Sacrificare umanamente i topi attraverso l'asfissia da CO₂ seguita da lussazione cervicale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Immergere le carcasse in un becher contenente il 75% di alcol per la sterilizzazione, quindi trasferire l'animale su un piano di lavoro asettico.
2. Rimuovere asetticamente i reni del topo usando forbici e pinzette, metterli in una capsula di Petri, sciacquare con EBSS (Earle's Balanced Salt Solution), quindi rimuovere con cura il tessuto connettivo e la capsula renale usando una pinzetta.
3. Tagliare a metà il rene verticalmente, aggiungere 3-4 ml di soluzione di collagenasi I e macinare con un pestello di plastica.
4. Pipettare tutti i tessuti e la soluzione dalla capsula di Petri in una provetta da centrifuga da 15 mL. Sciacquare la capsula di Petri con 1-2 ml di soluzione di collagenasi I per assicurarsi che tutto il tessuto venga trasferito. Porre la soluzione nell'agitatore a 37 °C, agitando a 120 giri/min per 30 min. Quindi, aggiungere un volume uguale di soluzione di arresto (terreno di coltura 1).
5. Pipettare la soluzione dalla provetta da centrifuga da 15 mL, passarla attraverso un filtro cellulare da 100 μm e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga da 50 mL.
6. Far passare il fluido dal passaggio 2,5 attraverso un filtro cellulare da 40 μm, trattenendo solo le celle sul filtro cellulare da 40 μm. Sciacquare ripetutamente il colino con il terreno di coltura 1 per garantire la raccolta del maggior numero possibile di cellule sul colino. Trasferire le cellule raccolte dal filtro in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL.
7. Centrifugare la sospensione a 600 x g per 5 minuti (a temperatura ambiente), quindi risospendere le cellule in una piastra di coltura cellulare in base alla densità cellulare. Generalmente, risospendere le cellule di due reni in due o tre piastre di coltura da 100 mm (10 mL di terreno di coltura 1/100 mm). Collocare le piastre in un incubatore cellulare a 37 °C con il 95% di aria/5% di CO₂.
8. Esaminare la morfologia cellulare e l'adesione al microscopio (40×) il giorno seguente. Se nei terreni di coltura sono presenti cellule morte galleggianti, utilizzare una pipetta per rimuovere i terreni dal fondo della piastra di coltura, facendo attenzione a non disturbare le cellule attaccate.
9. Aggiungere 1-2 ml di PBS lungo il bordo interno della piastra di coltura per risciacquare le cellule. Utilizzare una pipetta per rimuovere tutto il PBS dal fondo della piastra di coltura e infine aggiungere 10 ml di terreno di coltura 1 lungo il bordo interno della piastra di coltura.

3. Purificazione delle MC murine

1. Un giorno dopo la separazione, rimuovere le cellule non aderenti lavando delicatamente e sostituendo il terreno di coltura con un terreno di coltura fresco 1, come descritto al punto 2.8. Osservare le cellule del glomerulo al microscopio a contrasto di fase (40×).
   NOTA: Le forme sferiche luminose rappresentano il glomerulo, mentre le cellule circostanti mostrano caratteristiche simili a ciottoli, caratteristiche delle cellule epiteliali (Figura 2A).
2. Osservare la morfologia cellulare dopo 1-3 giorni (Figura 2B-C). Cellule a forma di stellato e a forma di fuso appariranno intorno alle celle di ciottoli, come mostrato nella Figura 2D.
3. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza (di solito entro 7-10 giorni), lavare le cellule due volte con PBS sterile, quindi tripsinizzare le cellule con una soluzione di tripsina allo 0,25% (2 mL di soluzione di tripsina allo 0,25% per piatto da 100 mm).
4. Il processo iniziale di tripsinizzazione cellulare può richiedere circa 20 minuti. Dopo aver aggiunto la tripsina, mettere la capsula in un'incubatrice a 37 °C. Osservare il processo in tempo reale al microscopio a contrasto di fase (40×) per valutare la tripsinizzazione delle cellule.
5. Terminare il processo di tripsinizzazione aggiungendo un volume uguale di terreno 2 quando la maggior parte delle cellule mostra una morfologia arrotondata e si stacca dalla superficie del piatto.
6. Centrifugare le celle a 600 × g per 5 minuti (a temperatura ambiente), quindi risospenderle nel terreno 2. Generalmente, risospendere le cellule da una piastra da 100 mm in due piastre di coltura da 100 mm (10 mL di terreno di coltura 2/100 mm).
7. Cambiare il terreno di coltura 2 il giorno successivo. Osservare al microscopio numerose cellule sospese e frammenti cellulari (40×), poiché solo le MC possono sopravvivere e proliferare nel terreno di D-valina¹⁶. Cambia il supporto ogni 1-2 giorni per rimuovere le celle morte. Le cellule aderenti nella coltura sono MC (Figura 3A-D). Determinare il tasso di crescita dei MC isolati (Figura 3E).
8. Una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, tripsinizzarle e farle passare. I MC in genere impiegano circa 5-10 minuti per la tripsinizzazione.

4. Conservazione a lungo termine dei MC murini

NOTA: Poiché le cellule primarie possono differenziarsi e mutare con il tempo e passaggi multipli, congelare e conservare le MC dopo la purificazione cellulare per una conservazione a lungo termine.

1. Rimuovere con cautela il surnatante lungo il bordo inferiore della capsula utilizzando una pipetta, lavare le cellule due volte con PBS sterile, quindi tripsinizzare con una soluzione di tripsina allo 0,25% (2 ml di soluzione di tripsina allo 0,25% per piastra da 100 mm). Seguire i passaggi di tripsinizzazione come descritto nei passaggi 3.3-3.8.
2. Dopo la tripsinizzazione, aggiungere un volume uguale di terreno 2 per terminare il processo e trasferire l'intero liquido in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare le cellule a 600 × g per 5 minuti (a temperatura ambiente), scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS per contare le cellule.
3. Utilizzare un contatore automatico di celle per contare le celle. Prelevare 20 μl da 1 mL di soluzione di cellule risospese e aggiungerli a una piastra di conteggio delle cellule dedicata per determinare il numero totale di cellule. In base alla conta cellulare, risospenderle in terreni di crioconservazione cellulare (1 mL di terreno di crioconservazione cellulare per^10-6 cellule).
4. Trasferire la soluzione cellulare in provette per crioconservazione (1 mL di terreno di crioconservazione cellulare per provetta di crioconservazione da 2 mL) ed eseguire il congelamento lento a -80 °C prima di trasferirla in azoto liquido per la conservazione.
   NOTA: Risospendere e seminare le cellule in piastre di coltura cellulare per l'amplificazione, se necessario. Le cellule devono essere utilizzate tra i passaggi 3 e 8 dopo essere state completamente caratterizzate¹⁷.

5. Identificazione dei MC murini

NOTA: Dopo che le celle sono state passate due volte, identificare i MC murini utilizzando le seguenti tecniche.

1. Western blot di MC murini
   NOTA: I reagenti necessari per la procedura sono riportati nella Tabella supplementare 1.
   1. Tripsinizzare le cellule seguendo gli stessi passaggi dei punti 3.3-3.8 e del passaggio 4.1.
   2. Dopo aver raccolto le cellule, lisare le cellule per estrarre le proteine e misurare la concentrazione proteica.
   3. Prelevare una quantità appropriata di campione (di solito 20 ng), aggiungere il tampone di caricamento e denaturare a 100 °C per 5 minuti.
   4. Risolvere la proteina (20 ng) con un gel SDS-PAGE al 10% o un gel SDS-PAGE al 7,5%, quindi trasferirla su una membrana di cellulosa a tensione costante.
   5. Bloccare la membrana con latte scremato al 5%, quindi incubare con l'anticorpo primario a 4 °C su uno shaker per una notte.
   6. Incubare con l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora dopo il lavaggio con TBST (Tris Buffered Saline with Tween 20) tre volte.
   7. Rileva i segnali con il sistema di imaging.
      NOTA: Gli anticorpi primari utilizzati in questo studio includevano anti-αSMA di topo (1:500), anti-vimentina di coniglio (1:2000), anti-fibronectina di coniglio (1:2000) e anti-GAPDH di topo (1:50000). Gli anticorpi secondari utilizzati in questo studio includevano IgG anti-coniglio di capra coniugata con perossidasi (H + L) (1:5000) e IgG anti-topo di capra coniugata con perossidasi (H + L) (1:5000).
2. Colorazione in immunofluorescenza di MC murini
   NOTA: I reagenti necessari per la procedura sono forniti nella Tabella supplementare 2.
   1. Tripsinizzare le cellule seguendo gli stessi passaggi dei passaggi 3.3-3.8 e 4.1.
   2. Risospendere le celle e contarle. Prelevare 1 x 10⁵ cellule e aggiungerle alla piastra di coltura cellulare con fondo di vetro da 15 mm (1 mL di terreno di coltura 2 per fondo di vetro da 15 mm).
   3. Fissare gli MC con paraformaldeide al 4% per 15 minuti (1 mL di paraformaldeide al 4% per fondo di vetro da 15 mm), quindi lavare tre volte con PBS.
   4. Trattare gli MC con Triton X-100 allo 0,1% per 10 minuti per permeabilizzare le membrane cellulari.
   5. Dopo altri tre lavaggi con PBS, bloccare le celle a temperatura ambiente con una soluzione di BSA PBS al 3% per 30 minuti.
   6. Lavare le cellule e incubarle con anticorpi primari anti-αSMA di topo e anti-vimentina di coniglio a 4 °C per una notte.
   7. Incubare per 1 ora con IgG anti-topo d'asino secondarie coniugate a Alexa 594 rosso e IgG anti-coniglio d'asina coniugate a FITC verde a temperatura ambiente.
   8. Utilizzare DAPI per la controcolorazione nucleare per 1 minuto a temperatura ambiente.
   9. Aggiungere il supporto con montaggio in fluoro e coprire con un vetrino. Analizza le cellule utilizzando un microscopio confocale.
      NOTA: Gli anticorpi primari utilizzati in questo studio includevano l'anti-αSMA di topo (1:200) e l'anti-vimentina di coniglio (1:200). Gli anticorpi secondari utilizzati in questo studio includevano IgG anti-topo d'asino coniugate al rosso Alexa 594 (1:400), IgG anti-coniglio d'asino coniugate al FITC verde (1:400) e DAPI (1:1000).
3. Citometria a flusso di MC murini
   1. Tripsinizzare le cellule seguendo gli stessi passaggi dei passaggi 3.3-3.8 e 4.1.
   2. Risospendere le celle e contarle. Prendi 5 x 10⁵ celle e lavale una volta con 3 ml di PBS.
   3. Risospendere le cellule con 100 μL di PBS in una provetta a flusso, quindi aggiungere 1-2 μL di anticorpo anti-topo PDGFRB (CD140b).
   4. Incubare le cellule su ghiaccio per 30 minuti al buio, quindi analizzare mediante citometria a flusso.

Results

Questo studio ha sviluppato un protocollo ottimizzato per l'isolamento di MC murini e la coltura cellulare ex vivo. Per quanto ne sappiamo, non esiste un metodo standard per la convalida dei MC primari ex vivo. Secondo precedenti pubblicazioni, le MC sono caratterizzate dall'espressione di αSMA, Vimentina e Fibronectina ^3,14,15. L'analisi Western blot è stata utilizzata per rilevare i livelli di espressione del...

Discussion

Le malattie legate ai reni sono molto diffuse e i topi sono ampiamente utilizzati come modello animale primario per lo studio di queste condizioni a causa della loro somiglianza genetica con l'uomo e della disponibilità di modelli di malattia ben consolidati. Le cellule mesangiali svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento della normale struttura e funzione del glomerulo fornendo supporto strutturale, regolando la filtrazione glomerulare e partecipando alle risposte immunitarie. Sebbene...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µ m Filtro cellulare	Biosharp	BS-100-CS
Piastra di Petri da 100 mm	Sorfa	230301
Provetta da centrifuga da 15 mL	Sorfa	411000
Piastra per coltura cellulare con fondo in vetro da 15 mm	Sorfa	201200
180 kDa Plus Marcatore proteico prestained	Vazyme	MP201-01
2 mM L-glutammina	BasalMedia	S210JV
4% Paraformaldeide	Biosharp	BL539A
40 µ m Filtro cellulare	Biosharp	BS-40-XBS
50 mL Tubo da centrifuga	Sorfa	41000
Piastra di Petri da 60 mm	Sorfa	230201
75% di alcol	Knowles	64-17-5
96 pozzetti Piastre per colture cellulari, trattate	con TC Servicebio	CCP-96H
Antibiotici (10 μ g/mL di ceftriaxone plus 100 μ g/mL gentamicina)	NCM	C100C5
BCA (acido bicinconinnico) Kit per il dosaggio delle proteine	CWBIO	CW0014S
Cell Count-8	Microscopio	CB101
	FV-3000	Olympus
DMSO	Sigma	D2650
DMSO	Sigma	D2650
Earle Soluzione salina bilanciata (1x EBSS)	Beyotime	C0213
Siero fetale bovino (FBS)	Excell	FSP500
Analizzatore cellulare a fluorescenza	Mira FL	Countstar
Fluoromount media	Southern Biotech	0100-01
Soluzione di insulina, transferrina, selenio 100x (ITS -G)	Gibco	41400045
Microscopio a fluorescenza invertita	Olympus	IX83
	Adilab	PP1101
Kit di preparazione PAGE in un solo passaggio (10%)	Oriscience	PB102
Kit di preparazione PAGE in un solo passaggio (7,5%)	Oriscience	PB101
PE anti-topo CD140b Anticorpo	Biolegend	323605
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Servicebio	G4202
Pestello cellulare in plastica	Biofil	CC-4090
Inibitore della proteinasi Cocktail	Roche	4693159001
Membrana PVDF	Vazyme	E802-01
Insulina umana ricombinante	Solarbio	11061-68-0
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Corning	10-040-CV
SDS-PAGE Tampone di caricamento del campione (5x)	Servicebio	G2013
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (D-valina invece di L-valina)	Procell	WH3923U222
TBS (Tris Buffered Saline)	Servicebio	G0001-2L
Triton X-100	Biosharp	BS084
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200072
Tween 20	Biosharp	BS100
Tipo I collagenasi	Solarbio	CB140