Articolo metodologico

Determinazione della morfologia mitocondriale in cellule vive mediante microscopia confocale

DOI:

10.3791/68167

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3 luglio 2025

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1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

In questo articolo

Sommario

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In questo studio, descriviamo un protocollo passo-passo e sottolineiamo i dettagli chiave per determinare le caratteristiche morfologiche dei mitocondri nelle cellule vive, tra cui la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini e l'analisi dei dati. Questo metodo è comunemente usato per esaminare la morfologia mitocondriale per studiare varie condizioni.

Abstract

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L'equilibrio dinamico della fusione e della fissione mitocondriale contribuisce direttamente all'omeostasi mitocondriale, che influenza numerose funzioni cellulari oltre all'omeostasi dell'adenosina trifosfato (ATP). Pertanto, la valutazione della morfologia mitocondriale in condizioni di stress è essenziale per la ricerca meccanicistica. Questo studio descrive un protocollo dettagliato per l'analisi della morfologia mitocondriale, che comprende la preparazione di una soluzione MitoTracker, la colorazione dei mitocondri, l'ottimizzazione dei parametri di imaging e il rilevamento delle caratteristiche morfologiche. I MitoTracker sono coloranti specifici per mitocondri di uso comune ed economici. Tuttavia, alcuni cambiamenti nella morfologia mitocondriale possono verificarsi a causa di una manipolazione inappropriata, che può essere impercettibile e non riflettere il vero stato dei mitocondri. Pertanto, è necessario capire come analizzare i cambiamenti nella morfologia mitocondriale utilizzando i MitoTracker. Il protocollo ha utilizzato cellule SH-SY5Y stimolate con ioduro di 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+) per illustrare il protocollo di analisi morfologica mitocondriale. Rispetto alle cellule di controllo, le cellule stimolate da MPP+ mostravano mitocondri più piccoli e più frammentati, con parametri morfologici che indicavano una diminuzione dell'impronta mitocondriale. Questi risultati suggeriscono che la colorazione MitoTracker è un metodo efficace e fattibile per l'analisi morfologica mitocondriale che (con piccole modifiche) può essere applicato per studiare varie condizioni.

Introduzione

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La morfologia mitocondriale è mantenuta dall'equilibrio dinamico della fusione e della fissione mitocondriale e, quindi, influenza l'omeostasi energetica e numerose altre funzioni cellulari, portando a varie patologie come malattie neurodegenerative, cancro e infiammazione 1,2,3,4,5 . Per osservare la morfologia mitocondriale, sono state sviluppate diverse colorazioni selettive per i mitocondri, tra cui sia sonde che anticorpi, da utilizzare con un microscopio confocale. Alcune sonde specifiche per i mitocondri, come la tetrametilrosamina e la rodamina 123, funzionano in base al potenziale di membrana mitocondriale (MMP), che limita la loro applicabilità negli studi sulle condizioni di interferenza con MMP 6,7. Al contrario, la colorazione degli anticorpi fornisce una valutazione morfologica indipendente dalle MMP per l'esame della morfologia mitocondriale nelle cellule fissate. Sebbene una colorazione adeguata consenta la valutazione della morfologia mitocondriale in cellule fisse, l'esame della morfologia mitocondriale in cellule vive compromesse da alcuni induttori rimane impegnativo. MitoTracker, una sonda fluorescente cationica permeabile alle cellule e specifica per i mitocondri, offre una soluzione a questa sfida, consentendo la colorazione di cellule vive e fisse. Questa sonda è stata ampiamente utilizzata per esaminare la morfologia mitocondriale negli studi di varie malattie 8,9,10,11. Tuttavia, alcuni studi hanno segnalato problemi come un elevato segnale di fondo e un legame non specifico, anche quando la sonda viene utilizzata in stretta conformità con le linee guida fornite dal produttore. Queste osservazioni evidenziano l'importanza di una comprensione approfondita della preparazione del campione e dell'acquisizione delle immagini per il successo dell'analisi della morfologia mitocondriale.

Per facilitare l'analisi della morfologia mitocondriale, sono stati sviluppati vari programmi e algoritmi di elaborazione delle immagini 12,13,14,15,16. In questo studio, abbiamo impiegato il macro strumento Mitochondrial Network Analysis (MiNA) in ImageJ per analizzare la morfologia mitocondriale13. Questo strumento identifica e caratterizza efficacemente le caratteristiche morfologiche delle reti mitocondriali calcolando nove parametri descrittivi, tra cui il numero di individui (strutture senza rami), il numero di reti (numero di oggetti con almeno un pixel di giunzione), la lunghezza media (lunghezza media di tutti i bastoncelli e rami), la lunghezza mediana (lunghezza mediana di tutti i bastoncelli e rami), la deviazione standard della lunghezza (deviazione standard delle singole lunghezze), Dimensione media della rete (il numero medio di filiali per rete), dimensione mediana della rete (il valore medio del numero di filiali per rete), deviazione standard della dimensione della rete (deviazione standard del numero di filiali per rete) e impronta mitocondriale (area totale del segnale dopo la separazione dello sfondo). In questo protocollo, l'impronta mitocondriale è stata selezionata come parametro rappresentativo.

L'obiettivo di questo studio è fornire un protocollo passo-passo per l'analisi morfologica mitocondriale, concentrandosi sui dettagli chiave. Abbiamo utilizzato cellule SH-SY5Y indotte da MPP+ per dimostrare questo protocollo. MPP+ inibisce il complesso I della catena respiratoria mitocondriale nei neuroni dopaminergici, con conseguente danno alla morfologia e alla funzione mitocondriale 8,17. Il protocollo di analisi morfologica descritto in questo studio consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e la valutazione di parametri rilevanti per definire le caratteristiche morfologiche delle reti mitocondriali.

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Protocollo

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1. Preparazione

  1. Sciogliere MPP+ con dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una soluzione madre da 1 mM e conservarla al buio a -30 °C (vedere la tabella dei materiali).
  2. Sciogliere 50 μg di MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) in 94 μL di DMSO per ottenere una soluzione stock da 1 mM. Aliquotare la soluzione madre in diverse provette per microcentrifuga e conservarla al riparo dalla luce a -30 °C fino a nuovo utilizzo.
  3. Incubare le cellule SH-SY5Y in fiasche con il terreno F-12 Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 di Dulbecco integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) in un ambiente umidificato con il 5% di CO2 e il 95% di aria a 37 °C. Per il passaggio, staccare le cellule con una soluzione di tripsina allo 0,05% per 1 minuto e centrifugare a 100 × g per 3 minuti.

Stimolazione 2. MPP+

  1. Seminare le cellule SH-SY5Y su piastre confocali con fondo di vetro e mantenerle in terreno DMEM/F12 integrato con FBS all'1% (v/v) durante la notte.
  2. Sostituire il terreno di coltura, quindi incubare le cellule con o senza MPP+ per 24 ore.

3. Colorazione MitoTracker

  1. Preriscaldare DMEM/F12, quindi diluire la soluzione madre MitoTracker con DMEM/F12 per ottenere una soluzione di lavoro da 50 nM. Mantenere la soluzione al riparo dalla luce durante l'intera procedura.
  2. Rimuovere il terreno di coltura cellulare e lavare le piastre confocali 2 volte con DMEM/F12 fresco.
  3. Incubare le cellule in ciascuna piastra con 1 mL della soluzione di lavoro MitoTracker per 15 minuti a 37 °C al buio.
  4. Rimuovere la soluzione di lavoro MitoTracker e lavare 2 volte con DMEM/F12.
  5. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 a ciascuna piastra e incubare nell'incubatore cellulare prima dell'imaging.

4. Parametri di imaging per microscopio confocale

  1. Preequilibrare il microscopio per le operazioni successive. Sotto il pannello di acquisizione, regolare i parametri relativi al percorso della luce impostando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione.
  2. Impostare i parametri come segue: dimensione del foro stenopeico, 1,2 UA; dimensione della scansione dei pixel, 1.024 x 1.024; tempo di permanenza dei pixel, 2,4 μs (media 2x)  (mantenerlo costante ai fini della calibrazione).

5. Ottimizzazione dei parametri di imaging

ATTENZIONE: Evitare l'esposizione degli occhi alle radiazioni dirette e diffuse di un laser visibile e/o invisibile.

  1. Utilizzare la luce alogena per mettere a fuoco le cellule utilizzando un obiettivo planocromatico 60x (1,4 NA) per evitare la fototossicità.
  2. Regolare la potenza del laser e l'alta tensione (HV) appena al di sotto del livello di saturazione, impostare il fattore di zoom su 3 e quindi acquisire le immagini.
  3. Sposta la regione di interesse e concentrati sulle celle per acquisire immagini senza modificare le impostazioni.

6. Analisi dei dati

NOTA: i dati sono stati analizzati utilizzando ImageJ preinstallato con il plug-in MiNA13. Per ottenere misurazioni accurate e pertinenti, le immagini dovrebbero acquisire mitocondri risolti in modo indipendente con colorazione pulita e luminosa.

  1. Per migliorare la qualità dell'immagine prima della trasformazione binaria e della scheletrizzazione, aprire l'immagine ed eseguire l'elaborazione preliminare. Utilizzare lo strumento ROI per selezionare l'area di una singola cella. Applicazione del processo | Filtri | Funzione Maschera di contrasto per migliorare la nitidezza e utilizzare la funzione Processo | Funzione Enhance Contrast per ridurre la sovraamplificazione del rumore. Per rimuovere il rumore di sale e pepe in modo specifico, utilizzare il metodo Processo | Filtri | Funzione mediana (vedi Figura supplementare S1).
  2. Per costruire un modello morfologico semplificato per calcolare i parametri descrittivi, convertire l'immagine in binaria tramite soglia (fare clic su Elabora | Binario | Crea binario), quindi scheletra l'immagine binaria utilizzando la funzione Scheletratura (fare clic su Elabora | Binario | Scheletrare) (vedi Figura S2 supplementare).
  3. Raggruppa tutti i pixel all'interno dello scheletro utilizzando il pulsante Analizza | Scheletro | Funzione Analizza scheletro (2D/3D). Semplifica l'analisi utilizzando lo strumento MiNA per calcolare nove parametri descrittivi nell'immagine scheletrata (vedi Figura S3 supplementare).

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Risultati

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Questo protocollo delinea una procedura dettagliata e passo-passo per l'analisi morfologica mitocondriale attraverso tre moduli di ottimizzazione interdipendenti: standardizzazione dei protocolli di preparazione dei campioni, ottimizzazione sistematica dei parametri ottici per l'imaging al microscopio confocale e linee guida per l'elaborazione computazionale delle immagini. Un protocollo ottimale di preparazione dei campioni è fondamentale per ottenere dati di imaging mitocondriale affidabili. La valutazione sistematica ...

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Discussione

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Il presente studio stabilisce una metodologia sistematica per l'analisi della morfologia mitocondriale in cellule vive in condizioni di stress. Le fasi procedurali cruciali dell'imaging mitocondriale riguardano: un'adeguata concentrazione di sonde MitoTracker, il lavaggio accurato delle piastre confocali prima dell'acquisizione dell'immagine, la riduzione al minimo dei disturbi dello stato cellulare e l'impostazione di parametri di imaging adeguati.

L'uso di c...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81974501).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ioduro di 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+)MacklinM875357Utilizzato per indurre lo stress ossidativo
Piatto confocaleNIDO801001Utilizzato per coltivare le cellule
Microscopio confocaleNikonC2Utilizzato per acquisire immagini
Dulbecco's Modified Eagle Miscela di Mezzi/Nutrienti F-12ThermoFisher Scientifico11320033Utilizzato per fornire nutrimento alle cellule
Dimetilsolfossido (DMSO)BeyotimeST038Utilizzato per sciogliere la sonda mitotracker
Siero fetale bovino (FBS)ThermoFisher ScientificoA3161001CUtilizzato per fornire nutrimento alle cellule
ImmagineJIstituti Nazionali di SanitàImmagineJUtilizzato per analizzare la morfologia mitocondriale
MitoTracker Rosso CMXRosThermoFisher ScientificoCodice: M7512Utilizzato per visualizzare i mitocondri
Soluzione salina tampone fosfato (PBS)ThermoFisher ScientificoC10010500BTUtilizzato per lavare le cellule su piastre confocali
Cella SH-SY5YATCCCodice CRL-2266Utilizzato per dimostrare il flusso di lavoro dell'analisi della morfologia mitocondriale
Adattatore per palco TI-SH-UNikonMEC59110Utilizzato per fissare i campioni

Riferimenti

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