Method Article

Analisi multimodale delle microplastiche nell'acqua potabile utilizzando una tubazione di analisi della nanomembrana di silicio

DOI:

10.3791/68200

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June 13th, 2025

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1SiMPore Inc., 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 3URnano, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo che mostra un substrato otticamente trasparente e piatto per la cattura e l'analisi semplificate delle particelle contaminanti nell'acqua potabile. Qui viene presentata la Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP): una pipeline flessibile per la cattura, la quantificazione e l'identificazione di particelle in mezzi liquidi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'impatto biologico dell'inquinamento da microplastiche nel cibo umano e nelle fonti d'acqua è in gran parte sconosciuto e le fonti di acqua potabile non sono esenti da questa contaminazione da microplastiche. In questo articolo, dimostriamo un approccio semplificato per l'acquisizione, la quantificazione e l'identificazione delle microplastiche nell'acqua potabile. Presentiamo un flusso di lavoro analitico denominato Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) che sfrutta le nuove nanomembrane di nitruro di silicio che consentono un significativo "fattore di concentrazione", che consolida le particelle sospese in un'area di osservazione planarizzata per l'analisi delle particelle individuate, quantificabili e multimodali sullo stesso substrato. I principali vantaggi di SNAP derivano dall'uso di membrane ultrasottili a base di nitruro di silicio alloggiate in dischi filtranti di dimensioni convenzionali, che consentono la cattura e l'analisi diretta di MP polimerici su uno sfondo non polimerico. I campioni di acqua potabile provenienti dalla regione di Rochester, New York, sono stati raccolti da fonti di rubinetto residenziali e analizzati utilizzando SNAP. Le particelle in ciascun campione sono state caratterizzate mediante microscopia ottica ed elettronica a scansione (SEM), spettroscopia Raman e spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX) e vari costituenti identificati sono stati quantificati in proporzione al totale delle particelle catturate.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le microplastiche sono definite come polimeri sintetici di dimensioni inferiori a cinque millimetri di dimensione 1,2. L'inquinamento da microplastiche (MP) è una preoccupazione crescente per la salute umana, l'ambiente e l'ecologia. La contaminazione da MP è stata riscontrata in fonti d'acqua di tutti i tipi; acqua dolce, oceani e persino fonti di acqua potabile3. Gli MP sono generati dalla scomposizione delle fonti primarie di plastica4, così come i tessuti sintetici 5,6,7. Gli MP sono onnipresenti e sono stati trovati nei tessuti umani, come la placenta umana, le feci e il sangue 8,9,10. C'è un crescente interesse per la ricerca sulle MP , come dimostrano più di 4.100 e 4.600 pubblicazioni rispettivamente nel 2023 e nel 2024 (dati PubMed; parola chiave "microplastiche"), nonché una crescente preoccupazione pubblica per quanto riguarda l'esposizione umana alle MP . In risposta a una crescente preoccupazione pubblica, diversi organismi di regolamentazione governativi come lo Stato della California11 e diversi paesi dell'UE12, hanno attuato (o attueranno) regolamenti sui livelli di MP nell'acqua potabile. Considerando tutto quanto sopra, l'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti ha recentemente annunciato che i parlamentari sono un nuovo contaminante preoccupante. Tuttavia, la valutazione del rischio umano è gravemente ostacolata dalla mancanza di metodi per l'individuazione affidabile e riproducibile delle MP.

La caratterizzazione delle MP si basa su metodi analitici come la microscopia ottica ed elettronica13 e le tecniche spettroscopiche e spettrometriche 1,14,15 per comprendere le caratteristiche visive delle MP7 e la loro composizione, rispettivamente. I campioni contenenti MP dovrebbero includere più analisi per caratterizzare, identificare e quantificare gli MP e richiedere almeno spettroscopia/spettrometria (ad esempio, spettroscopia Raman, spettroscopia a infrarossi o gascromatografia a pirolisi-spettrometria di massa, ecc.) secondo alcuni requisiti minimi di riviste per la misurazione della plastica in campioni ambientali, come Science of the Total Environment16. La spettroscopia Raman è più versatile della spettroscopia a infrarossi (IR), soprattutto per quanto riguarda l'identificazione dei materiali nei campioni biologici. La spettroscopia Raman è una tecnica di diffusione della luce, che consente di analizzare particelle più piccole più facilmente rispetto all'IR, una tecnica di assorbimento della luce che richiede particelle più grandi e ha più vincoli sul posizionamento del campione17. È stato precedentemente suggerito che i substrati per la spettroscopia Raman che comprendono silicio o ossido di silicio possono produrre risultati affidabili con un rumore di fondo minimo18.

I substrati per alcune tecniche analitiche che sono solitamente compatibili con un tipo di analisi (ad esempio, i substrati rivestiti d'oro necessari per la spettroscopia IR) non sono spesso compatibili con la microscopia a trasmissione e/o riflettanza. Successivamente, il sottocampionamento replicato è popolare tra i ricercatori per produrre campioni appropriati per ogni analisi separata, ma il sottocampionamento richiede molto tempo e potrebbe escludere il particolato a bassa abbondanza 1,2,6. In genere, i trasferimenti manuali di particolato da un substrato all'altro sono necessari per analizzare la stessa particella per la caratterizzazione e l'identificazione con diverse modalità analitiche, ma questi trasferimenti manuali lenti aumentano la probabilità di distorsione, contaminazione e perdita, oltre a limitare l'analisi delle MP solo alle particelle di dimensioni maggiori che possono essere manipolate manualmente13. Questi flussi di lavoro non ottimali introducono numerose sfide e problemi di affidabilità, contribuendo alla significativa variabilità nella quantificazione delle MP riportata in letteratura 3,7.

Qui, presentiamo un flusso di lavoro analitico che chiamiamo Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP) per catturare, caratterizzare, identificare e quantificare le MP e dimostrare l'utilità di SNAP analizzando campioni di acqua potabile provenienti dalla regione di Rochester, NY. SNAP è reso possibile da dischi filtranti di dimensioni convenzionali di 25 mm di diametro con nanomembrane di silicio integrate (vedere la tabella supplementare S1 per le proprietà della membrana), che offrono un substrato uniforme per la concentrazione e l'analisi di MP dall'acqua potabile utilizzando più tecniche15,19. Dopo aver concentrato e catturato in sequenza le MP su nanomembrane con dimensioni di cut-off decrescenti (nitruro di silicio microporoso (MPSN) da 20 μm con pori cilindrici e nitruro di silicio microfessurato da 8,0 μm (MSSN) con pori prismatici rettangolari), SNAP facilita tre fasi analitiche consecutive: 1) colorazione del campione, microscopia ottica e quantificazione MP, 2) identificazione delle particelle tramite spettroscopia Raman, seguita da 3) caratterizzazione delle particelle tramite microscopia elettronica a scansione (SEM), consentendo analisi multiple delle stesse particelle catturate su un substrato di nanomembrana.

Dimostriamo più pipeline SNAP utilizzando sia dischi filtranti a nanomembrana di silicio (SiN) non rivestiti che dischi filtranti a nanomembrana di silicio rivestiti d'oro (Au-SiN): Pipeline A) SNAP eseguito su SiN e caratterizzazione sequenziale degli stessi MP attraverso molteplici tecniche analitiche; Pipeline B) SNAP eseguito su Au-SiN con spettroscopia Raman; e Pipeline C) SNAP eseguito su Au-SiN con SEM dotato di spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX) (Figura 1). Le varianti SNAP sono quindi flussi di lavoro analitici flessibili e semplificati che possono essere utilizzati per una serie di tipi di campioni e tecniche analitiche. A differenza dei metodi pubblicati in precedenza che si basano su membrane polimeriche11, i vantaggi di SNAP derivano dall'uso di nanomembrane di silicio, in cui le MP polimeriche sintetiche vengono catturate su una membrana non polimerica a base di silicio, consentendo l'identificazione composizionale di MP su uno sfondo non polimerico. Inoltre, le nanomembrane di silicio offrono piani focali uniformi a differenza delle membrane polimeriche, che tendono a raggrinzirsi, consentendo molteplici tecniche automatizzate di microscopia e spettroscopia.

In precedenza abbiamo caratterizzato l'uso di nanomembrane di silicio per analisi MP mediante modellazione analitica, modellazione di particelle e campioni di acqua potabile e aria19,20, nonché confrontando le loro proprietà di filtrazione e microscopia ottica utilizzando particelle modello con quattro membrane ampiamente utilizzate15. In questo protocollo, dimostriamo euristicamente l'utilità di SNAP per l'analisi delle MP in quattro campioni di acqua potabile. I campioni sono stati raccolti da quattro fonti d'acqua distinte intorno all'area metropolitana di Rochester, NY. Ogni campione incluso in questo studio ha avuto origine da una fonte d'acqua superficiale distinta, come il lago Ontario, il lago Hemlock, un mix di Hemlock e Ontario e il lago Canandaigua (Figura 2). Le particelle catturate da queste fonti di acqua potabile includevano plastiche diffuse come il polistirene (PS) e il polietilene (PE), metalli pesanti come ferro, silice e particelle non sintetiche.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Procedure di controllo della qualità epreparazioni di soluzioni ultrapure 

  1. Pulizia del cappuccio e dei guanti a flusso laminare
    1. Indossare DPI (dispositivi di protezione individuale): camice da laboratorio in cotone 100% e guanti in nitrile.
      NOTA: I DPI sono continui per tutto il protocollo.
    2. Spruzzare i guanti in nitrile con alcol isopropilico (IPA) al 99%. Strofinare le mani, quindi risciacquare con ~18 MΩ, 0,22 μm di acqua filtrata. Fallo 3 volte per rimuovere l'agente distaccante dai guanti.
    3. Piega una salvietta delicata in fibra naturale in quarti, quindi spruzza con IPA al 70%. Strofinare la superficie della cappa da dietro a davanti con movimenti lunghi, ripiegando nuovamente la delicata salvietta per attività su una superficie inutilizzata ogni due passate. Continuare a pulire la cappa fino a quando tutte le superfici non sono state pulite, sostituendo la salvietta con una nuova una volta sporca.
    4. Scopri il tappetino a rullo in silicone e arrotolalo sulla superficie del cofano per raccogliere eventuali particelle rimanenti. Per pulire il rullo in silicone, spruzzare con IPA al 99% e strofinare con una mano guantata, quindi risciacquare con 18 MΩ, 0,22 μm di acqua filtrata. Ripetere 3 volte, quindi lasciare asciugare all'aria nella cappa.
    5. Risciacquare i guanti come al punto 1.1.2.
  2. Acqua ultrapura e generazione di IPA.
    1. Riempire un becher da 1 L con 18 MΩ di acqua e posizionarlo nella cappa.
    2. Adescare una siringa da 60 ml e collegare un filtro per siringa da 0,22 μm filtrando almeno 200 ml di acqua da 18 MΩ attraverso la siringa e il filtro collegato.
      NOTA: Una pompa a siringa consente di risparmiare tempo, ma non è necessario eseguire il protocollo descritto.
    3. Sciacquare 3 volte un contenitore di vetro con tappo a vite con acqua filtrata da 18 MΩ, 0,22 μm. Riempire con 0,22 μm di acqua filtrata da 18 MΩ filtrata con siringa.
    4. Ripetere i passaggi 1.2.1-1.2.3 con la concentrazione % di IPA desiderata invece di 18 MΩ, 0,22 μm di acqua filtrata per generare IPA ultrapuro.

2. Cattura di particelle da campioni liquidi tramite filtrazione

NOTA: Il protocollo seguente può essere utilizzato con campioni liquidi diversi dall'acqua. I metodi convalidati di raccolta dei campioni dovrebbero essere lasciati alla discrezione dello sperimentatore in base alle esigenze del suo studio e del campione.

  1. Indossa i DPI.
    NOTA: Assicurarsi che i guanti e le superfici del cappuccio siano puliti secondo i passaggi 1.1.2-1.1.5.
  2. Spruzzare una guarnizione in silicone con IPA Ultrapure 99%, strofinare con le dita guantate, quindi risciacquare con acqua Ultrapura. Ripetere l'operazione 3 volte per ogni guarnizione.
    NOTA: Il numero di guarnizioni da utilizzare nella filtrazione è uguale al numero di dischi filtranti da utilizzare, più 1. Fare riferimento alla Figura 1B per l'immagine visiva dell'assemblaggio.
  3. Utilizzando la siringa innescata al punto 1.1.2, sciacquare l'interno della siringa da 60 ml con l'acqua ultrapura prelevando 30 ml di acqua ultrapura e 30 ml di aria nella siringa. Avvitare il filtro di una siringa, quindi agitare energicamente ed erogare. Ripeti l'operazione 3 volte.
    NOTA: Se necessario, è possibile utilizzare siringhe di qualsiasi dimensione in base al volume del campione.
  4. Assemblare l'apparato di filtrazione come mostrato nel grafico visivo di montaggio nella Figura 1B.
    NOTA: Utilizzare una pinzetta pulita per maneggiare i dischi filtranti e le guarnizioni durante il montaggio e lo smontaggio.
    1. Per le filtrazioni sequenziali, assicurarsi che ci sia una guarnizione tra il disco e la fritta di supporto, una guarnizione tra ogni disco e una guarnizione tra il disco e l'imbuto di filtrazione.
    2. Assicurarsi che i dischi siano ordinati con il filtro di taglio più grande nella parte superiore della pila e il filtro di taglio più piccolo nella parte inferiore.
  5. Accendere l'aspirapolvere sull'apparecchio in modo che ci sia un flusso negativo attraverso la pila di dischi filtranti.
  6. Misurazione della contaminazione di fondo
    NOTA: Il seguente processo consente una valutazione della pulizia della siringa e della generazione di terreni ultrapuri, nonché una determinazione delle particelle di fondo fornite dai componenti del sistema.
    1. Con la siringa risciacquata, erogare lentamente 50 ml di acqua ultrapura sulla nanomembrana al centro del disco superiore per assicurarsi che tutto il liquido erogato venga filtrato.
      NOTA: Se si filtrano volumi di campione maggiori (ad es. >50 mL), si consiglia un imbuto di filtrazione in vetro. Pulire l'imbuto filtrante in vetro come al punto 2.3. Ulteriori strumenti di laboratorio possono comportare un ulteriore rischio di contaminazione da particelle. Mantenere la diligenza con le procedure di pulizia e confermare sempre la pulizia con filtrazioni in bianco prima di utilizzare i campioni di interesse.
    2. Lasciare filtrare l'acqua ultrapura. Tenere acceso l'aspirapolvere per un ulteriore minuto dopo la filtrazione. Una volta che il campione è completamente asciutto, spegnere l'aspirapolvere.
    3. Rimuovere con cautela i dischi del filtro dalle guarnizioni utilizzando una pinzetta pulita e posizionare i dischi nell'apposito contenitore pulito ed etichettato per la conservazione, come una capsula di Petri di vetro o una scatola oscurata.
    4. Immagine dei dischi filtranti al microscopio per l'analisi ottica, il conteggio delle particelle, ecc.
  7. Per i campioni liquidi, pulire una guarnizione aggiuntiva come al punto 2.2. Procurarsi una nuova siringa per ogni campione di terreno liquido e ripetere il passaggio 2.3.
  8. Prelevare la quantità desiderata di campione e dosare lentamente il campione sulla nanomembrana al centro del disco superiore.
  9. Una volta completata la filtrazione del campione, eseguire 3 risciacqui con 1 ml di acqua ultrapura per assicurarsi che tutte le particelle nel campione siano state sufficientemente risciacquate da tutte le superfici sulla membrana al centro del disco filtrante.
  10. Tenere acceso l'aspirapolvere per un altro minuto per asciugare completamente il campione risciacquato 3 volte, quindi spegnere l'aspirapolvere.
    1. Ripetere i passaggi 2.7-2.10. per ogni replica da eseguire del campione di interesse.

3. Preparazione e colorazione del colorante fluorescente

NOTA: La colorazione fluorescente con rosso del Nilo e/o blu di tripano può interferire con i laser di spettroscopia Raman di interesse.

  1. Colorazione con Rosso Nilo (NR)
    1. Indossa i DPI.
    2. Pulire i guanti e il cappuccio come nei passaggi 1.1.2-1.1.5.
    3. Completare la filtrazione del campione come descritto nei passaggi 2.7-2.10.
    4. Sciacquare due contenitori di vetro con tappo a vite con acqua ultrapura 3x.
    5. Preparare una soluzione 0,1 mg/mL di NR in IPA ultrapuro al 99% in un contenitore di vetro pulito.
    6. Capovolgere delicatamente 10 volte per mescolare.
    7. Filtrare la soluzione NR con un filtro per siringa da 0,22 μm nel secondo contenitore di vetro con tappo a vite.
      NOTA: Il filtro utilizzato per prefiltrare l'NR deve avere un cutoff inferiore rispetto al filtro utilizzato per filtrare i campioni.
    8. Posizionare il disco filtrante da colorare sulla fritta di supporto del pallone di raccolta sottovuoto.
    9. Pipettare 20 μl della soluzione NR 0,1 mg/mL sulla nanomembrana al centro del disco filtrante.
      NOTA: La macchia deve coprire completamente la superficie porosa della nanomembrana. Se 20 μl non sono sufficienti, aggiungere ulteriore colorante fino a quando tutte le aree porose della nanomembrana sono adeguatamente ricoperte di colorante.
    10. Incubare la macchia per 5 minuti.
    11. Filtrare sottovuoto la macchia una volta completata l'incubazione.
    12. Risciacquare 3 volte con 1 mL di IPA Ultrapure 99% per rimuovere eventuali macchie NR in eccesso.
      NOTA: Procedere alla sezione sulla colorazione Trypan Blue di seguito dopo questo passaggio se è necessario eseguire la controcolorazione.
    13. Lasciare riposare il disco filtrante sulla fritta di supporto con l'aspirapolvere acceso per 2 minuti per filtrare e asciugare il liquido residuo. Se non si asciuga dopo 2 minuti, trasferire il disco filtrante utilizzando una capsula di Petri di vetro pulita in un forno a 70 °C per 2-5 minuti.
    14. Una volta asciutta, eseguire la microscopia a fluorescenza come descritto al punto 2.6.4 e procedere alla sezione 4.
  2. Colorazione con Trypan Blue (TB)
    1. Indossa i DPI.
    2. Pulire i guanti e il cappuccio come descritto nei passaggi 1.1.2-1.1.5.
    3. Completare la filtrazione del campione dai passaggi 2.7-2.10 o iniziare con il passaggio 3.2.4.
    4. Sciacquare due contenitori di vetro con tappo a vite con acqua ultrapura 3x.
    5. Preparare la macchia allo 0,4% di TB in un contenitore.
      NOTA: Il filtro utilizzato per prefiltrare il TB deve avere un cutoff inferiore rispetto al filtro utilizzato per filtrare i campioni.
    6. Capovolgere delicatamente 10 volte per mescolare.
    7. Filtrare la soluzione colorante TB con un filtro per siringa da 0,22 μm nel secondo contenitore con tappo a vite in vetro.
      NOTA: Il filtro utilizzato per prefiltrare il TB deve avere un cutoff inferiore rispetto al filtro utilizzato per filtrare i campioni.
    8. Posizionare il disco filtrante da colorare sulla fritta di supporto del pallone di raccolta sottovuoto.
    9. Pipettare 20 μl della colorazione 0,4% TB sulla nanomembrana al centro del disco filtrante.
      NOTA: La macchia deve coprire completamente la superficie porosa della nanomembrana. Se 20 μl non sono sufficienti, aggiungere ulteriore colorante goccia a goccia fino a quando tutte le aree porose della nanomembrana sono adeguatamente coperte dalla macchia.
    10. Incubare la macchia per 5 minuti.
    11. Filtrare sottovuoto la macchia dopo l'incubazione per 5 minuti.
    12. Risciacquare con 1 mL di acqua ultrapura 3x.
    13. Lasciare riposare il disco filtrante sulla fritta di supporto con l'aspirapolvere acceso per 2 minuti per filtrare e asciugare il liquido residuo. Se non si asciuga dopo 2 minuti, trasferire il disco filtrante utilizzando una capsula di Petri di vetro pulita in un forno a 70 °C per 2-5 minuti.
    14. Una volta asciutta, eseguire la microscopia a fluorescenza come descritto al punto 2.6.4 e procedere alla sezione 4.

4. Quantificazione di particelle tramite microscopia a fluorescenza

  1. Acquisizione di immagini al microscopio ottico
    1. Immobilizzare il disco filtrante su un vetrino da microscopio utilizzando una guarnizione in silicone o utilizzare un vetrino di allineamento specifico per l'uso del disco filtrante con un tavolino da microscopio. Spostare il disco del filtro da acquisire sul tavolino del microscopio.
    2. Acquisire immagini della nanomembrana utilizzando l'illuminazione in campo chiaro in modo che i conteggi massimi rilevati siano ~ 90% della portata massima della telecamera del rivelatore.
      NOTA: Questo valore del 90% è ~59.000 per un rivelatore a 16 bit con livelli di bianco a 65.535.
    3. Immagine della nanomembrana utilizzando l'illuminazione fluorescente in modo che l'intensità massima dei pixel sia circa ~25% della portata massima della telecamera del rivelatore.
    4. Salvate l'immagine in formato TIFF composito a 16 bit.
  2. Quantificazione delle particelle tramite microscopia a fluorescenza
    1. Utilizzando la piattaforma di analisi delle immagini, separare i canali fluorescenti del TIFF composito generato nella versione 4.1.4 dal canale di campo chiaro utilizzando la funzione Split-Channels .
    2. Soglia le intensità dei pixel utilizzando la funzione Soglia a un valore di 10.000.
      NOTA: Se è presente blumazione sulle particelle, la soglia è troppo bassa e deve essere aumentata.
    3. Salva un'immagine separata in formato PNG.
    4. Smacchia l'immagine per rimuovere i pixel di disturbo utilizzando la funzione Smacchia .
    5. Spartiacque l'immagine utilizzando la funzione Spartiacque .
      NOTA: Questa funzione separa le particelle adiacenti di dimensioni simili, al costo di rompere grandi particelle contigue in pezzi più piccoli. Poiché spesso sono presenti molte più particelle piccole che particelle grandi, questo può essere un buon compromesso ma può avere effetti indesiderati, come la rottura di fibre lunghe in filamenti di piccole particelle. Ispeziona i risultati delle immagini prima di accettare i dati.
    6. Impostare la scala delle immagini fluorescenti con soglia misurando la larghezza di un poro nell'immagine in campo chiaro. Utilizzare la larghezza dei pori misurata per impostare la scala in pixel/μm.
      NOTA: Per i pori rettangolari, la larghezza più piccola corrisponderà all'etichetta del prodotto. Per i pori circolari, il diametro corrisponderà all'etichetta del prodotto che specifica la dimensione dei pori (cioè il taglio) della nanomembrana.
    7. Applica la funzione Conta particelle della piattaforma di analisi delle immagini all'immagine fluorescente con soglia, valutando l'area, il min e il max.
    8. Elabora le immagini fluorescenti e in campo chiaro per creare compositi che visualizzano i domini fluorescenti.
    9. Soglia dell'immagine fluorescente utilizzando lo stesso valore del passaggio 4.2.2.
    10. Unisci i canali utilizzando la piattaforma di analisi delle immagini. Assegnate il canale fluorescente al canale Rosso e l'immagine in campo chiaro al canale Grigi .
    11. Salva il composito come file PNG.

5. Spettroscopia Raman

  1. Accendere lo strumento Raman e il computer associato, consentendone l'avvio.
  2. Aprire il software sul computer collegato allo strumento Raman.
  3. Quando il software viene inizializzato, assicurarsi che l'attività corrente del sistema e lo stato del rilevatore sulla barra multifunzione inferiore della schermata del programma riportino rispettivamente Pronto e siano di colore verde.
  4. Se il pulsante Autocalibrazione (AC) nella parte inferiore dello schermo è rosso, eseguire l'autocalibrazione desiderata e attendere che termini prima di continuare.
  5. Se si utilizza solo un laser e un reticolo:
    1. Fare clic su Esci nella schermata Autocalibrazione, quindi selezionare il laser e il reticolo desiderati dai rispettivi elenchi a discesa in Configurazione strumento nella scheda Acquisizione .
    2. Torna al pulsante rosso AC nella parte inferiore dello schermo e fai clic su Laser/Reticolo corrente e consenti l'esecuzione della routine di calibrazione.
  6. Se si utilizzano tutti i laser e le griglie, è sufficiente selezionare Tutti i laser e le griglie e consentire al sistema di funzionare.
  7. Se si utilizza più di un laser e/o reticolo, selezionare i laser/reticoli personalizzati e selezionare tutte le impostazioni desiderate. Quindi, attendere l'esecuzione della calibrazione.
  8. Selezionare l'obiettivo 20x long working distance (LWD) sulla torretta dello strumento e all'interno del software in Impostazioni strumento nella scheda Acquisizione .
  9. Se questo obiettivo non è disponibile, utilizzare un obiettivo alternativo a basso ingrandimento (ad es. 5x o 10x) con una distanza di lavoro che si adatti all'altezza del disco filtrante.
    NOTA: Iniziare con un obiettivo di ingrandimento inferiore per facilitare la navigazione iniziale attraverso la nanomembrana del disco filtrante.
  10. Posizionare il disco del filtro sul tavolino del microscopio in modo che si trovi all'interno del percorso ottico.
  11. Fare clic su Acquisizione video nella barra multifunzione superiore per attivare l'ottica di visualizzazione.
  12. Utilizzare le rotelle di messa a fuoco grossolana e fine sullo strumento per mettere a fuoco la nanomembrana del disco filtrante.
  13. Squadrare approssimativamente i pori con le linee del cursore del punto sullo schermo del computer.
  14. Ruotare delicatamente il disco filtrante sul tavolino per ottenere questo allineamento quadrato oppure utilizzare un vetrino di allineamento specifico per l'uso del disco filtrante in un tavolino da microscopio.
  15. Nella scheda Acquisizione in alto a destra, assicurati che la modalità illuminatore selezionata sia Campo scuro per ottenere i migliori risultati.
  16. Per acquisire un'immagine unita, accedere alla scheda Video nella barra multifunzione Schede dati.
  17. Passa al primo campo visivo desiderato, quindi fai clic sul pulsante Mosaico in alto a destra della finestra video e aggiungi alla mappa. Naviga fino all'angolo opposto esterno dell'area desiderata con il joystick dello strumento e aggiungi alla mappa.
  18. Esegui l'acquisizione del mosaico con ViewSharp per assicurarti che tutte le aree siano correttamente a fuoco nell'immagine finale.
    NOTA: Gli obiettivi con ingrandimento più basso impiegheranno meno tempo per l'acquisizione del mosaico di immagini, mentre gli obiettivi con ingrandimento più elevato richiederanno più tempo.
  19. Una volta creato il mosaico di immagini, fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e premi Invia a ParticleFinder.
  20. Passare alla scheda ParticleFinder nella barra multifunzione in alto a destra per interagire con le impostazioni di soglia.
  21. Per assicurarsi che siano selezionate le particelle corrette, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Immagine nella scheda dati di ParticleFinder per selezionare le caselle Centro, Particella e Trasparenza . Impostate il cursore della trasparenza su 50% e la dimensione in pixel del centro su 2px.
    NOTA: La selezione Centro posizionerà un punto al centro di ogni particella e la selezione Particella posizionerà una sovrapposizione su ogni area determinata come particella, con una trasparenza del 50%. Queste impostazioni individueranno ogni particella e definiranno i bordi di ogni particella.
  22. Se necessario, modificare la soglia delle particelle e i parametri di selezione della morfologia/dimensione nella scheda ParticleFinder sul lato destro del programma per assicurarsi che tutte le particelle e i loro parametri di dimensione/forma siano identificati correttamente. Fare riferimento alla Tabella supplementare S2 per un esempio di come i parametri morfologici possono essere applicati.
    1. Se il rilevamento automatico delle particelle non è sufficiente, passare a quello manuale e regolare in modo incrementale i valori di soglia fino a quando la maggior parte degli oggetti corretti non viene identificata come particella.
    2. Se la morfologia delle particelle rilevate necessita di ulteriori perfezionamenti, selezionare la casella accanto ad Applica filtri morfologici. Selezionare i parametri adatti e le loro intensità nei menu a discesa risultanti.
      NOTA: L'ordine in cui vengono selezionati i parametri può influire sull'output.
  23. Se le dimensioni, la forma o altre qualità morfologiche delle particelle sono fattori critici, selezionare la casella accanto a Applica prefiltro particelle, quindi selezionare e modificare i parametri in base alle esigenze.
  24. Una volta che le particelle sono state identificate e le loro forme/bordi selezionati sono accettabili, naviga nell'elenco di anteprima scorrevole delle immagini delle particelle nella sezione Risultati . Seleziona le particelle di interesse facendo clic sull'immagine della particella associata.
  25. Attiva la visualizzazione in diretta con il pulsante della videocamera nella parte superiore dello schermo.
  26. Passa all'obiettivo LWD 50x facendo clic sul numero di ingrandimento e selezionando l'obiettivo corrispondente nel menu a discesa, all'interno dell'applicazione nella barra multifunzione in basso.
  27. Se necessario, riportare a fuoco le particelle con la manopola di regolazione fine.
  28. Acquisisci immagini di singole particelle o analizzale con la spettroscopia Raman e salva le immagini come file separati con nomi appropriati.
  29. Assicurarsi che l'area desiderata della particella da analizzare con la spettroscopia Raman sia posizionata correttamente sotto la posizione del raggio laser.
  30. Una volta selezionata l'area corretta della particella per l'analisi, premere il pulsante STOP ALL nella parte superiore della finestra per disattivare l'ottica di visualizzazione.
  31. Impostare il laser su 532 nm, all'1% di potenza per le particelle non colorate, e a 785 nm o 830 nm per le particelle colorate in fluorescenza.
  32. Impostare il tempo di acquisizione a 10 s e gli accumuli a 5.
  33. Seleziona la scheda Spectra dal menu delle schede dati, quindi premi il pulsante di riproduzione per avviare la visualizzazione in tempo reale (RTD).
    NOTA: Utilizzare le informazioni ottenute durante l'RTD per ottimizzare le impostazioni.
  34. Una volta soddisfatti delle impostazioni e dei risultati, premere STOP ALL per interrompere l'RTD.
  35. L'acquisizione finale può ora essere raccolta premendo il pulsante circolare Acquisizione dello spettro accanto al pulsante RTD.
  36. Salvare gli spettri raccolti come file separati con nomi appropriati.
  37. Ripetere i passaggi 5.28-5.36. per ogni particella di interesse.
  38. Al termine del campione, rimuovere il disco del filtro e riportare l'obiettivo sul 20X LWD sia manualmente sul cannocchiale che all'interno del software.
  39. Ripetere i passaggi 5.10-5.37 per i nuovi campioni.

6. Identificazione spettrale

  1. Se non è disponibile un database spettrale Raman acquistato o costruito autonomamente, accedere alla libreria di spettroscopia open source all'indirizzo: https://www.openanalysis.org/openspecy/
    NOTA: OpenSpecy è un database di spettroscopia Raman e IR open source che include 636 spettri da tre diverse librerie di 276 polimeri e materiali applicabili all'identificazione di MP e fibre ambientali21. I dati spettrali pre e post-elaborati sono ugualmente validi per l'uso con questa risorsa.
  2. Salva gli spettri Raman come singoli file .csv.
    1. Etichettare la colonna A come numero d'onda seguito dai numeri d'onda degli spettri e la colonna B deve essere etichettata come Intensità seguita dai valori di intensità di picco per numero d'onda.
  3. Apri gli spettri trascinando e rilasciando il file .csv nella barra di ricerca in alto a sinistra.
  4. Attiva Pre-elaborazione e identificazione.
  5. In Pre-elaborazione, attiva Rumore segnale di soglia, Normalizzazione min-max, Smoothing/Derivativa, Numeri d'onda conformi e Correzione linea di base.
    NOTA: Le impostazioni specifiche possono essere regolate in base alle caratteristiche individuali degli spettri analizzati.
  6. In Identificazione, selezionare Raman come tipo di spettro e Derivato come trasformazione libreria.
    NOTA: Questa libreria può essere utilizzata anche per la spettroscopia IR. La finestra di analisi mostrerà uno spettro bianco, lo spettro caricato per l'analisi e uno spettro rosso, la sospetta corrispondenza di identificazione.
  7. Con tutti gli spettri che non restituiscono una corrispondenza r > 0,70 o correlazioni ragionevoli della forma del picco, utilizzare i primi 5 risultati suggeriti come punto di partenza per la ricerca di potenziali corrispondenze come preferito.
  8. Assicurarsi che i valori di picco misurati siano entro ±10 numeri d'onda da un picco corrispondente negli spettri di riferimento selezionati prima di confermare una corrispondenza per quel picco.
  9. Registra le correlazioni spettrali, i relativi valori di correlazione e il database da cui proviene la corrispondenza sospetta.
  10. Scarica i file in base alle esigenze individuali.

7. Microscopia elettronica a scansione

NOTA: Se non è stato rivestito il disco del filtro prima dell'analisi SEM, passare alla sezione 7.2.

  1. Rivestimento metallico di campioni per SEM
    1. Montare il disco filtrante su un tronchetto SEM in acciaio utilizzando del nastro di carbonio.
    2. Inserire in uno sputterer e pompare la camera a 50 mTorr.
    3. Aprire la valvola di isolamento Ar (Argon).
    4. Spurgare il sistema introducendo Ar nella camera tramite valvola a spillo a una pressione di 300 mTorr, quindi evacuare la camera fino a 50 mTorr. Ripeti 3 volte.
    5. Regolare la pressione finale a 100 mTorr tramite la valvola a spillo.
    6. Utilizzando un target Au, depositare l'Au sul disco filtrante tramite sputtering.
      NOTA: Altre fonti target (ad esempio, Pt, Ir, Si, ecc.) possono essere utilizzate in alternativa al posto di Au; La corrente di 20 mA produce 0,1 Angstrom/s di deposizione a 100 mTorr.
    7. Sfiatare il sistema e rimuovere il disco del filtro. Mantenere il disco del filtro aderente al tronchetto in acciaio inossidabile.
  2. Acquisizione di immagini SEM
    1. Fissare il mozzo al supporto Zeiss Auriga multistadio con una vite di fermo.
    2. Accendere il SEM e i computer che lo eseguono e consentire l'avvio di ciascuno di essi.
    3. Aprire il software allegato al SEM.
    4. Verificare che il sistema sia sotto vuoto (5e-6 Torr).
    5. Sfiatare il blocco del carico premendo Vent sul corpo principale della camera del blocco del carico e aprire il blocco del carico.
    6. Montare il supporto multistadio sulla maschera di inserimento rivestita in teflon e fissare il braccio di trasferimento utilizzando la piastra a vite allegata.
    7. Chiudere il blocco del carico e svuotare il blocco del carico premendo Store sul corpo principale della camera del blocco del carico.
      NOTA: Il completamento avviene quando le luci verdi smettono di lampeggiare sul pulsante Store .
    8. Caricare il supporto multistadio sul tavolino nella camera di osservazione principale aprendo il cancello di trasferimento.
    9. Premere Transfer sul corpo principale del blocco del carico. Il cancello si abbasserà ed esporrà la camera interna.
    10. Inserire il braccio di blocco del carico (avvitato nel supporto multistadio) e fissare il supporto multistadio al tavolino.
    11. Svitare il braccio di trasferimento del blocco del carico e ritrarre completamente il braccio in modo che risieda nel blocco del carico.
    12. Chiudere il cancello di trasferimento premendo Transfer.
    13. Aprire la valvola di isolamento premendo EHT on nell'angolo in basso a destra del software.
    14. Regolare la distanza di lavoro in modo che sia di 5 mm nella zona dati del software e che la tensione di accelerazione sia di 20 kV.
    15. Localizzare la membrana del disco filtrante utilizzando i joystick XY e Z.
    16. Solleva il tavolino usando il joystick Z finché l'immagine non viene messa a fuoco.
    17. Correggi l'astigmatismo regolando le manopole dello stigma XY e la rotella di messa a fuoco sulla console centrale.
    18. Campionare le particelle all'ingrandimento desiderato regolando la rotella di ingrandimento sulla console centrale, acquisendo immagini con risoluzione 2.048 x 1.536 in formato tiff a 8 o 16 bit.
  3. Analisi delle particelle EDX
    1. Disattivare il CCD ChamberScope sul desktop del computer SEM.
      NOTA: Se questo passaggio non viene completato, il rilevatore EDX sarà sommerso dal segnale e non verranno registrati dati.
    2. Raffreddare il rilevatore EDX aprendo il software APEX EDX sul computer EDX, accendendo il rilevatore nel menu nell'angolo in alto a destra.
    3. Acquisire un'immagine SEM a bassa risoluzione che può essere utilizzata per la mappatura, facendo clic su Acquisisci immagine.
    4. Apri il menu della scheda Mappatura nella parte superiore della schermata del software.
    5. In Impostazioni, regola la risoluzione (256 x 256) e il tempo di permanenza dei pixel (0,16 μs) e il numero di fotogramma (32-64) per fornire un tempo di acquisizione stimato che dovrebbe essere di ~5 minuti.
    6. Fai clic su Crea mappa nell'angolo in alto a sinistra del menu.
    7. Selezionare Conferma anteprima elemento per regolare manualmente la ricerca degli elementi o fare affidamento sui picchi identificati automaticamente dal software.
    8. Al termine, generare un report utilizzando la funzione AutoReport nella sezione in alto a destra del software di mappatura.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pezzi grezzi di processo e contaminazione di fondo
Un risultato in bianco accettabile è quello che non contiene particelle o ne contiene così poche che la contaminazione di fondo (cioè di processo) (se presente) non ha un'alta probabilità di confondere o interrompere i risultati dell'esperimento. Un risultato del bianco non ottimale è quello che contiene molte particelle che saranno difficili da distinguere dalla contaminazione di fondo.

Il livello accettabile di contaminazione del processo dovrebbe essere pari o il più vicino possibile allo zero, ma se non è possibile raggiungere lo zero, la coerenza nel numero di particelle di fondo osservate è fondamentale. Eseguire diversi campioni vuoti per determinare la coerenza dei risultati. La diligenza nei protocolli di controllo della qualità (fare riferimento alla Sezione 1), la mitigazione della contaminazione e le condizioni ambientali adeguate durante la lavorazione sono fondamentali per mantenere bassi i livelli di contaminazione di fondo. I risultati della contaminazione di fondo e l'accettabilità possono anche dipendere fortemente dal cut-off delle nanomembrane utilizzate e dalla pulizia generale delle condizioni di laboratorio. Si tenga presente che quando si analizzano particelle più piccole con membrane di cut-off inferiori (ad esempio, < 8 μm), l'abbondanza relativa delle particelle di interesse e dei contaminanti di fondo di dimensioni simili aumenterà in modo esponenziale, richiedendo livelli più elevati di rigore nel controllo di qualità22. Sebbene qualsiasi livello di contaminazione non sia accettabile, purché le condizioni siano strettamente controllate e si raggiunga un alto grado di coerenza, è comunque possibile eseguire buone analisi delle microplastiche ambientali o analisi di interesse.

Filtrazione del campione
Per generare un'analisi multimodale fedele è necessaria una filtrazione ideale del campione, come mostrato nell'esempio di cascata di dati nella Figura 3. Tale filtrazione del campione si tradurrà in particelle ben disperse sulla superficie della nanomembrana (ad esempio, con circa un terzo della copertura della superficie della membrana). Le particelle scarsamente disperse, come nel caso dell'aggregazione di particelle (grandi grumi di particelle sovrapposte), confonderanno sia i metodi di conteggio manuale che quelli automatizzati, poiché le particelle sovrapposte non sono facilmente differenziabili con sicurezza. Tali dati sono solitamente esclusi dall'analisi, il che può portare alla perdita di preziose informazioni di interesse. Le particelle ben disperse, come mostrato nella Figura 4A, B, assicurano che qualsiasi analisi spettroscopica o di quantificazione non sia complicata da particelle impilate o sovrapposte di composizione variabile, che potrebbero restituire risultati più difficili da interpretare, identificare e quantificare con precisione.

Colorazione rosso Nilo e blu tripano
Immagini rappresentative dei casi di colorazione ottimale delle particelle fluorescenti sono mostrate nella Figura 3B su un disco filtrante SiN con cut-off da 20 μm. Il sottorisciacquo della colorazione NR o TB dalla superficie della nanomembrana può creare risultati falsi positivi. Le particelle residue che sono costituite da una delle macchie trattenute sulla superficie della membrana a causa di un risciacquo insufficiente possono essere erroneamente interpretate come particelle colorate. Un segno che si è verificato un risciacquo insufficiente è se le aree della nanomembrana prive di particelle o pellicole/residui residui rilevabili dal campione filtrato sono fluorescenti durante l'osservazione, come mostrato nella Figura 5A. Dopo l'imaging, fintanto che il disco filtrante è stato mantenuto in condizioni di pulizia, è possibile effettuare un risciacquo riposizionando il singolo disco filtrante a nanomembrana sull'apparato di filtrazione sottovuoto (meno le guarnizioni), accendendo il vuoto e filtrando un altro volume di IPA ultrapuro al 99% (per NR) o acqua ultrapura (per TB) sulla nanomembrana del disco filtrante. Registrare il volume totale del mezzo di risciacquo aggiuntivo utilizzato. Per ottenere i migliori risultati, acquisire immagini al microscopio dell'intera superficie della nanomembrana prima di eseguire un risciacquo per tenere conto di eventuali contaminazioni potenzialmente causate dalla fase di risciacquo.

Spettroscopia Raman
La spettroscopia Raman eseguita su SiN non rivestito può produrre un picco prominente a seconda della lunghezza d'onda del laser e questo picco può mascherare segnali a bassa abbondanza approssimativamente all'interno della regione del numero d'onda23 di 520 cm-1. Se gli spettri Raman di interesse sono sufficientemente separati dal picco di fondo del silicio o del nitruro di silicio, l'utilizzo di dischi filtranti SiN non rivestiti dovrebbe produrre risultati di spettroscopia Raman adeguati. In questo rapporto, le pipeline B e C hanno entrambe utilizzato dischi filtranti Au-SiN. Il rivestimento in oro di Au-SiN maschera il picco Si intrinseco, consentendo di raccogliere spettri a bassa abbondanza in modo più affidabile vicino o a 520 cm-1 numeri d'onda. Inoltre, l'Au-SiN può essere utilizzato con la spettroscopia IR se il Raman non è disponibile. Iniziare sempre con le impostazioni di potenza più basse (ad esempio, l'intensità del laser) sullo strumento e poi aumentare gradualmente, poiché alcune particelle di interesse possono essere fragili, come le particelle ossidate, e possono essere danneggiate o distrutte dal laser.

Quando si analizzano le particelle scelte con la spettroscopia Raman, è fondamentale determinare l'affidabilità di uno spettro restituito. Alcune particelle possono auto-emettere fluorescenza e questa fluorescenza aggiungerà rumore nella misurazione spettrale che potrebbe mascherare o complicare l'interpretazione del segnale delle particelle. Questo rumore assumerà la forma di una banda ad alta intensità che si estende su un'ampia gamma di numeri d'onda, fondendo i dati sottostanti. Gli spettri appropriati, dimostrati nella Figura 3C e nella Figura 4C,D, anche prima della correzione della linea di base, avranno picchi chiaramente definiti su intervalli più brevi di numeri d'onda. Se non si verificano picchi almeno tre volte più grandi di qualsiasi segnale circostante, è probabile che gli spettri raccolti siano rumore di fondo o che siano necessarie diverse impostazioni dello strumento per analizzare la particella in questione. Assicurarsi che sia selezionata la lunghezza d'onda del laser corretta per ogni campione. I laser a lunghezza d'onda inferiore, come un laser a 532 nm, non sono in grado di gestire in modo sufficiente il segnale generato dalla fluorescenza. Un laser a lunghezza d'onda più elevata, come un laser a 782 nm o 830 nm, può ignorare sufficientemente la fluorescenza per restituire uno spettro. A seconda del tipo di campione, laser diversi saranno adatti a diversi tipi di particelle e, se possibile, potranno essere scambiati durante la raccolta dei dati su un singolo disco filtrante.

Per determinare la composizione delle particelle, gli spettri raccolti vengono confrontati con quelli di un database di spettri di riferimento. L'identificazione affidabile di un dato spettro di particelle produrrà un coefficiente di Pearson (r) maggiore del 70% (r > 0,70). I dati Raman non ottimali sono mostrati nella Figura 5B, dove sono < 0,70. I risultati dell'identificazione delle MP sono utili per determinare le potenziali fonti di inquinamento da MP. Per visualizzare i risultati dell'identificazione delle particelle, è possibile visualizzare un'immagine e gli spettri della particella analizzata come nelle Figure 3C e 4C.

Microscopia elettronica a scansione
Entrambi i dischi filtranti SiN e Au-SiN sono compatibili con il SEM subito dopo la cattura delle particelle mediante filtrazione. Se i dischi del filtro SiN non sono rivestiti con Au o Pt prima del SEM e dopo la cattura delle particelle, alcune particelle possono essere più facilmente "caricate" dal fascio di ionizzazione del SEM, il che può far brillare la particella o apparire molto luminosa nelle immagini. Questa luminosità/bagliore può causare problemi di visualizzazione a causa dello scarso contrasto, come il mascheramento della morfologia della particella. Per mitigare, eseguire la microscopia ottica/a fluorescenza e la spettroscopia Raman prima del SEM per contrassegnare eventuali particelle difficili da analizzare o piccole particelle di interesse per la successiva analisi SEM/EDX, quindi rivestire la nanomembrana con Au o Pt come indicato nella sezione 7 del protocollo ed eseguire SEM/EDX.

Il rivestimento di SiN o Au-SiN con Au o Pt dopo la cattura delle particelle e prima dell'analisi SEM aiuta a prevenire questo effetto di carica durante l'imaging, poiché le particelle non sono più suscettibili alla ionizzazione sotto lo strato metallico smaltito. Questo rivestimento migliora il contrasto e la risoluzione, in modo da ottenere una maggiore comprensione morfologica di una data particella, come si vede nella Figura 3D (fibra vs frammento) o morfologie superficiali, come fosse e fessure su particelle ossidate. Le particelle di rivestimento metallico prima dell'analisi SEM impediranno in modo permanente che vengano ulteriormente analizzate con la spettroscopia o l'imaging a fluorescenza, rendendo ancora possibili solo le analisi SEM/EDX. Il rivestimento delle particelle e l'esecuzione di SEM/EDX dovrebbero quindi essere le fasi finali di qualsiasi processo, se previsto.

Le misure EDX possono essere eseguite sulle particelle catturate sia prima che dopo il rivestimento metallico. EDX può rivelare la composizione elementare specifica di una determinata particella o area, che si abbina bene con qualsiasi particella che sia inferiore al limite di dimensione di rilevamento per l'analisi Raman, o composizioni elementari che possono essere difficili da analizzare con determinate lunghezze d'onda del laser Raman come metalli, leghe, particolato saturo d'acqua e particelle che emettono una forte fluorescenza se esposte ai raggi laser Raman disponibili per l'uso. In questo studio, le particelle sono state rivestite con uno strato di Au. L'imaging SEM è stato eseguito con un ingrandimento compreso tra 200x e 3.000x con una potenza del fascio di 20 kV e una lunghezza focale di 5 mm. Le rispettive immagini SEM delle particelle selezionate sono mostrate nella Figura 3D.

I risultati EDX rappresentativi sono mostrati nella Figura 3F. Gli elementi rilevati con una percentuale di peso inferiore all'1% possono essere considerati tracce o inaffidabili a seconda della sensibilità dello strumento; Pertanto, abbiamo fissato una soglia all'1%. Se le particelle selezionate per l'analisi EDX sono state rivestite, una quantità rilevabile del rivestimento sarà presente nel rapporto dei dati elementari. Se si utilizzano dischi filtranti SiN non rivestiti, si osserveranno i segnali Si e N, come mostrato nella Figura 3F. La maggior parte delle particelle polimeriche sintetiche conterrà anche gli elementi C, H e O, purtroppo, poiché anche la maggior parte delle particelle non sintetiche provenienti da fonti biologiche sono costituite dagli stessi elementi, ma le particelle non sintetiche potrebbero anche includere elementi come S, come nel caso delle proteine. Questa somiglianza nella composizione è il motivo per cui il metodo di controcolorazione con il rosso del Nilo e il blu di tripano è utile per distinguere tra particelle sintetiche e non sintetiche, ma non è uno strumento di identificazione esaustivo, poiché il rosso del Nilo è anche in grado di colorare anche particelle non sintetiche in alcuni casi. Per confermare i risultati, è necessario utilizzare parametri di analisi aggiuntivi come quelli suggeriti in precedenza in combinazione con qualsiasi procedura di colorazione. Inoltre, l'EDX può essere uno strumento utile per identificare potenzialmente le particelle che sono al di fuori del limite dimensionale di rilevamento per la spettroscopia Raman (ad esempio, nanoplastiche che misurano < 1 μm).

figure-results-1
Figura 1: Tubazioni SNAP. (A) Schemi delle tubazioni SNAP, caratterizzazione delle stesse particelle sulla stessa nanomembrana attraverso una serie di diverse tecniche analitiche. Tubazione A) dimostra 1) Le particelle catturate di interesse da campioni di acqua potabile tramite filtrazione sottovuoto sono 2) colorate con rosso del Nilo e blu di tripano per la differenziazione delle particelle polimeriche sintetiche rispetto a quelle non sintetiche, rispettivamente, seguite da 3) identificazione delle particelle tramite spettroscopia Raman e 4) SEM/EDX per caratterizzare la morfologia delle particelle e l'identificazione elementare. Conduttura B) dimostra 1) Cattura di particelle su Au-SiN seguita da 2) Spettroscopia Raman. Pipeline C) dimostra 1) Cattura di particelle su Au-SiN seguita da SEM/EDX. (B) Schema del disco filtrante e della guarnizione in silicone nella configurazione di filtrazione nell'apparato per vuoto, raffigurante la filtrazione sequenziale attraverso una nanomembrana MPSN da 20 μm e poi da 8,0 μm MSSN, separata da guarnizioni in silicone. Abbreviazioni: SNAP = Pipeline di analisi della nanomembrana di silicio; SEM = microscopia elettronica a scansione; EDX = spettroscopia a raggi X a dispersione di energia; MPSN = nitruro di silicio microporoso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Fonti di raccolta dei campioni di acqua potabile. Una mappa regionale pubblicata dalla Monroe County Water Authority che descrive i luoghi da cui ciascuno dei quattro campioni di acqua potabile è stato raccolto nella regione di Greater Rochester, NY. I campioni provenivano da diverse fonti di acqua superficiale: il lago Ontario (blu), il lago Hemlock (verde), sia il lago Hemlock che il lago Ontario (giallo) e il lago Canandaigua (viola). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Sintesi delle analisi della conduttura A SNAP eseguite su particelle catturate da campioni di acqua potabile. (A) Immagine in scala di grigi delle particelle catturate da un campione rappresentativo di acqua potabile su un SiN cut-off di 20 μm. (B) Immagine sovrapposta a falsi colori di particelle controcolorate per rappresentare il rosso del Nilo (particelle rosse di falsi colori) e il blu di tripano (particelle di blu di falsi colori). (C) Spettri Raman di riferimento (rosso) e raccolti (bianco) che identificano una particella colorata con rosso del Nilo come polietilene con valore r di Pearson di 0,97, con immagine rappresentativa della particella analizzata. (D) Micrografia elettronica di due diversi tipi di particelle che dimostra l'analisi della morfologia delle particelle di una fibra (pannello superiore) e di un frammento (pannello inferiore), entrambi riprendendo la colorazione Trypan Blue. (E) Quantificazione di particelle colorate con rosso di Nilo catturate in sequenza su nanomembrane cut-off da 20 μm e 8 μm. (F) Analisi elementare EDX riassuntiva di un frammento selezionato casualmente e dettagli analitici dei risultati con immagine SEM rappresentativa della particella analizzata. Abbreviazioni: SNAP = Pipeline di analisi della nanomembrana di silicio; SEM = microscopia elettronica a scansione; EDX = spettroscopia a raggi X a dispersione di energia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Riepilogo delle analisi della conduttura SNAP B eseguite su particelle catturate da campioni di acqua potabile. Analisi spettrale Raman di tre particelle randomizzate provenienti da quattro campioni di acqua potabile per uso domestico acquisiti su dischi filtranti Au-SiN da 20 μm MPSN e 8,0 μm MSSN. Immagini rappresentative in campo scuro dell'area totale attiva della membrana per l'Au-SiN da 20 μm e 8 μm sono mostrate rispettivamente in A e B. Le particelle appaiono gialle in questa modalità di imaging mentre lo sfondo rimane scuro, facilitando il conteggio automatico delle particelle. Spettri Raman rappresentativi di particelle sintetiche e non sintetiche su (C) 20 μm e (D) 8,0 μm Au-SiN. I conteggi totali delle particelle per (E) 20 μm e (F) 8,0 μm Au-SiN sono raggruppati in base agli intervalli di dimensioni determinati dal software di ricerca automatica delle particelle. Abbreviazioni: SNAP = Pipeline di analisi della nanomembrana di silicio; SEM = microscopia elettronica a scansione; EDX = spettroscopia a raggi X a dispersione di energia; MPSN = nitruro di silicio microporoso; MSSN = microfessura Nitruro di silicio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Risultati dell'imaging a fluorescenza subottimale e della spettroscopia Raman. (A) Un'immagine a fluorescenza non ottimale delle particelle colorate (pannello sinistro), dove la membrana ha trattenuto la colorazione rosso Nilo, probabilmente dovuta al risciacquo insufficiente. Due particelle, una fibra colorata con Trypan Blue e un frammento colorato con Nile Red (pannello di destra), sono state selezionate per la spettroscopia Raman. (B) Risultati della spettroscopia Raman subottimali in cui il coefficiente di Pearson (r) è inferiore al 70% (r < 0,70). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare S1: Proprietà delle nanomembrane di silicio all'interno dei dischi filtranti. In questa tabella sono illustrate le proprietà delle membrane all'interno dei dischi filtranti SiN, tra cui la dimensione minima dei pori, la porosità percentuale, lo spessore delle membrane con e senza rivestimento di Au, l'area attiva della membrana e la permeanza del gas attraverso la membrana con pressione positiva applicata a una pressione costante impostata. Cut-off (cioè dimensione dei pori), porosità, spessore e area della membrana determinati misurando le caratteristiche sulle immagini SEM. I dati sulla permeanza del gas sono riportati come media ± deviazione standard (n = 10) per la pressione positiva N 2 applicata a 103,42 kPa. Abbreviazioni: Au = Oro; Six Ny = Nitruro di silicio non stechiometrico. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S2: Conteggi e parametri delle particelle di ParticleFinder. Da ciascun campione sono stati prelevati mosaici di immagini dell'intera area della membrana e ogni mosaico di immagini è stato analizzato per raccogliere il conteggio totale delle particelle. In questa tabella sono illustrati i parametri utilizzati e l'ordine in cui determinare il conteggio totale delle particelle per ogni immagine campione e il conteggio delle particelle a determinate frazioni dimensionali. I parametri variano da campione a campione in base al tipo, alla quantità e alla forma delle particelle, nonché alla riflettività specifica di ciascuna membrana durante l'imaging. I dati di questa tabella sono visualizzati nella Figura 4. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mitigazione dell'inquinamento da microplastiche è un argomento di crescente preoccupazione; E il primo passo per la mitigazione è identificare la presenza di contaminazione. Un metodo semplificato di acquisizione e analisi immediata è fondamentale per far risparmiare tempo agli investigatori e preservare le metriche sensibili dei campioni. Questo rapporto descrive i flussi di lavoro flessibili basati sulle variazioni dei nostri metodi SNAP sviluppati per l'analisi di tali MP in campioni liquidi, utilizzando un unico substrato per tutte le analisi condotte. Il campione deve essere filtrato sotto vuoto in modo tale che le particelle vengano catturate e isolate su una nanomembrana di silicio alloggiata all'interno di un disco filtrante. Una mitigazione sufficiente della contaminazione di fondo è fondamentale per ottenere risultati significativi. Eventuali particelle contaminanti sulla siringa di erogazione o sull'imbuto sottovuoto in vetro durante la filtrazione possono contaminare il campione ed essere catturate contemporaneamente, quindi seguire diligentemente i protocolli di controllo qualità della Sezione 1 è fondamentale per ottenere risultati accurati. Si raccomanda di effettuare controlli con solo terreno di coltura per informare gli sperimentatori della contaminazione di fondo specifica per i singoli processi e le condizioni di laboratorio. Il protocollo qui descritto si basa sulla filtrazione sotto vuoto di un campione liquido, nonché sulla cattura e l'isolamento delle particelle dal campione su due diversi dischi filtranti SiN cut-off. Per tutte le condutture, la cattura e l'isolamento delle particelle devono precedere gli altri metodi, ma tutti gli altri metodi di identificazione possono essere eseguiti nell'ordine più adatto per lo sperimentatore.

Per questo studio sono stati utilizzati due microscopi a fluorescenza per dimostrare la ripetibilità dei risultati tra gli strumenti. Le istruzioni descrivono in dettaglio l'uso di un Olympus BX61 per la microscopia a fluorescenza a causa della predominanza del suo utilizzo ed è stato utilizzato secondo le istruzioni dello strumento utilizzando il campo chiaro per l'imaging in scala di grigi, canale TRITC (Es. ~543 nm; Em. ~593 nm) per l'imaging di particelle colorate NR e il canale Cy5 (Es. ~649 nm; Em. ~667 nm) per l'imaging di particelle colorate con TB, a seconda dei casi. Per visualizzare i risultati della colorazione, si consiglia di costruire una sovrapposizione delle immagini del canale (utilizziamo FIJI/ImageJ per l'elaborazione delle immagini, successivamente denominata piattaforma di analisi delle immagini), con una risoluzione di 2.048 x 2.040 pixel e una profondità di 16 bit. Le immagini dell'intera nanomembrana possono essere visualizzate come nella Figura 4A, B o come regioni di interesse selezionate come mostrato nella Figura 3A, B.

Il rosso del Nilo è comunemente usato per colorare i polimeri sintetici MP, ma può colorare i polimeri non sintetici da fonti biologiche a causa della sua natura lipofila e idrofobica, introducendo potenzialmente falsi positivi che distorcono i risultati della quantificazione MP 24,25,26. Una fase di controcolorazione con Trypan Blue, come descritto nella sezione 3 del protocollo, è raccomandata per aiutare nella differenziazione degli eventi falsi positivi, ma non è una soluzione esaustiva e dovrebbe essere abbinata a metriche di analisi aggiuntive per confermare i risultati. La fluorescenza delle particelle del rosso del Nilo è un problema per l'analisi della spettroscopia Raman in quanto può aumentare significativamente il segnale di fondo. In questo studio, tuttavia, abbiamo controcolorato i polimeri con il rosso del Nilo e il blu di tripano prima della spettroscopia Raman con un laser a 830 nm, ed è stato osservato poco rumore, come mostrato nella Figura 3.

Alcune lunghezze d'onda dei laser adatti alla spettroscopia Raman non sono in grado di ignorare la fluorescenza delle particelle colorate, come un laser a 532 nm, e quindi possono introdurre notevoli difficoltà nella corretta stima della composizione della particella di interesse. Il rivestimento metallico delle particelle dopo l'acquisizione è utile per migliorare il contrasto durante l'imaging SEM, ma è incompatibile con qualsiasi successiva analisi spettroscopica o fluorescente. Prendere nota di tutte le misurazioni desiderate prima della configurazione sperimentale per assicurarsi che il flusso di processo e i tipi di rivestimento siano presi in considerazione correttamente. I dischi filtranti Au-SiN possono essere utilizzati per tutte le analisi menzionate in cui la microscopia a trasmissione non è cruciale per il flusso di lavoro, o quando viene utilizzata la spettroscopia Raman o IR.

I metodi qui mostrati, così come le nanomembrane utilizzate per catturare e isolare le particelle di interesse, possono essere modificati per soddisfare le esigenze dei singoli ricercatori. Le nanomembrane sono adatte per una serie di analisi spettroscopiche e lo sperimentatore può scambiare il terreno filtrato con un altro terreno campione di interesse, inclusi, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, tessuti animali digeriti27, prodotti farmaceutici iniettabili e campioni di olio. Per questo studio sono stati utilizzati due strumenti di spettroscopia Raman e le istruzioni descrivono in dettaglio l'uso di uno strumento Raman Horiba XploRA Plus, che ha raccolto ed elaborato tutti i dati mostrati nella Figura 4. È inoltre importante riconoscere il limite di dimensione di rilevamento per ciascun microscopio Raman, per garantire che le particelle di interesse possano essere adeguatamente analizzate con la dimensione dello spot dei laser dello strumento. Per visualizzare i risultati dell'identificazione delle particelle con Raman, gli spettri di riferimento e del campione, oltre a un'immagine della particella analizzata, possono essere visualizzati come nella Figura 3C e nella Figura 4C.

La sezione 6 del protocollo descrive in dettaglio le istruzioni per l'identificazione delle particelle utilizzando una libreria spettrale open-source. La cattura planarizzata delle particelle su una membrana uniformemente piatta, così come la serie regolare di pori della membrana, consente un imaging prevedibile e automatizzato. Sia gli spessori di 400 nm o 1.000 nm del SiN che la loro composizione in nitruro di silicio li dotano di un'eccellente trasparenza ottica, ma possono anche restituire un intenso picco di silicio in alcuni parametri spettroscopici dello strumento. Prestare attenzione quando si utilizza SiN nudo, non rivestito in metallo con analisi Raman. Il picco Si può funzionare come un segnale di calibrazione, ma l'intensità del picco può anche mascherare i segnali di spettri a bassa intensità nella stessa regione del numero d'onda del segnale Si. Tali picchi di Si non sono stati osservati quando si utilizza il laser a 830 nm in questo studio.

La natura ultrasottile del SiN (400 nm o 1.000 nm di spessore) e dell'Au-SiN (520 nm o 1.120 nm di spessore) qui utilizzati li ha dotati delle loro eccellenti proprietà di filtrazione, ottiche e spettroscopiche. Tuttavia, queste membrane devono essere protette da danni fisici, ad esempio da un'eccessiva pressione differenziale (ad es. ≥-206 kPa), dal contatto diretto con pinzette o dita o da un posizionamento improprio della guarnizione. Il disco filtrante che ospita le membrane le protegge e ne facilita la manipolazione in condizioni di normale utilizzo. Quando si manipolano i dischi del filtro, toccare solo l'anello esterno nero e mai l'area della membrana attiva. Sebbene non sia qui riportato quantitativamente, la raccolta di particelle catturate su una piccola quantità di superficie della membrana (3 x 3 mm per 20 μm e 3 x 0,7 x 3 mm per membrane cut-off da 8,0 μm, rispettivamente) riduce potenzialmente il tempo totale di analisi del campione, riducendo il tempo necessario per trovare e analizzare le particelle di interesse. Questo "fattore di concentrazione" è degno di future esplorazioni e potrebbe offrire un vantaggio unico dei dischi filtranti SiN per i ricercatori. In combinazione con le loro portate normalizzate per l'area superficiale più elevate rispetto ad altre membrane ampiamente utilizzate per la caratterizzazione MP15, le routine automatizzate di imaging delle particelle che richiedono solo l'imaging di un'area relativamente più piccola di SiN uniformemente piatto e a fuoco possono ridurre ulteriormente i tempi totali di analisi. Tuttavia, eventuali benefici legati al fattore di concentrazione ipotizzato devono ancora essere dimostrati empiricamente confrontando i tempi totali di elaborazione (dalla filtrazione all'analisi dell'immagine) su dischi filtranti convenzionali e SiN.

Abbiamo dimostrato euristicamente l'utilità delle variazioni SNAP su campioni locali di acqua di rubinetto. Il protocollo qui descritto si concentra sulla cattura di MP da fonti di acqua potabile intorno a Rochester, NY. La raccolta dei campioni si è svolta come segue: per ogni raccolta dei campioni, almeno un litro d'acqua è stato fatto passare attraverso il rubinetto prima dell'inizio della raccolta. Le bottiglie di polipropilene nuove e sigillate sono state portate al rubinetto in funzione e aperte direttamente prima del ritiro. Le bottiglie non sono state sciacquate con acqua potabile prima della raccolta. Ogni campione era costituito da due flaconi da 500 ml raccolti, uno dopo l'altro. Ogni campione d'acqua proveniva da un sistema di tubazioni di una casa distinta e il materiale delle tubazioni non era coerente durante il campionamento. Variabili come la quantità di acqua utilizzata di recente, il tempo di raccolta, l'età delle tubature e l'età della casa da cui proviene il campione non possono essere controllate in questo studio. Questo non era un protocollo di raccolta dei campioni convalidato. Ogni sperimentatore dovrebbe sviluppare e convalidare le proprie procedure di raccolta. Tuttavia, ai fini della completa divulgazione dei metodi, è inclusa la descrizione di cui sopra. I dischi filtranti consentono analisi ripetute sullo stesso substrato per una serie di metodi analitici. Non sono necessari sottocampionamenti o campioni multipli al di fuori delle repliche di prova standard. L'eliminazione della necessità di sottocampionamento e di campioni multipli aumenta la sicurezza nell'acquisizione di informazioni su target a bassa abbondanza. Oltre a consentire metodi di analisi multimodali, i dischi filtranti SiN offrono un netto vantaggio rispetto ad altri mezzi di filtrazione analoghi grazie alla qualità che consente di risparmiare tempo grazie a una velocità di filtrazione più rapida per unità di area15.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JR e JM sono fondatori e azionisti di SiMPore Inc. JR è co-inventore di una domanda di brevetto che consente l'uso di filtri al nitruro di silicio come quelli illustrati in questo studio.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peng Miao di Horiba Scientific ha generosamente sostenuto questa pubblicazione con l'uso e l'esperienza del loro sistema di spettroscopia Raman XploRA Plus. L'imaging al microscopio elettronico è stato eseguito presso l'Integrated Nanosystems Center (URnano) dell'Università di Rochester. La microfabbricazione è stata effettuata presso il Semiconductor and Micro-systems Fabrication Laboratory (SMFL) del Rochester Institute of Technology.

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata in parte dal National Institute of Environmental Health Sciences nell'ambito del premio n. R44ES031036 a SiMPore e presso il Lake Ontario MicroPlastics Center (LOMP) nell'ambito del National Institute of Environmental Health Sciences Award No. P01 ES035526 e il Premio della National Science Foundation n. OCE-2418255 all'Università di Rochester. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali di alcuna agenzia di finanziamento.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 L Bicchiere di vetroPyrex1000-1L
L Pallone di raccolta sottovuoto in vetroMillipore SigmaZ290459-1EA
Camice da laboratorio 100% cotoneLandauLA-3172
Imbuto filtrante in vetro da 100 mLAdvantec311000https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
alcol isopropilico al 99%Fisher ScientificA416-20
APEX EDSEDAXEDX software utilizzato per eseguire analisi EDX sulle particelle catturate.
Denton Prep Sputtering SystemDenton VacuumDESK II : 293618089Sistema di rivestimento Gold
FIJI, piattaforma di analisi delle immaginiImageJV 1.54FFIJI (FIJI è solo ImageJ) - una distribuzione di ImageJ 
Bottiglia di vetro con tappo a viteCorning 1395-250
KimwipesKimtech06-666-11C
LabSpec6Software Horiba ScientificHoriba Raman contenente ParticleFinder e ViewSharp
Cappa a flusso laminareAir ScienceVLF-72A
Microscopio Olympus  / NikonBX61 / Ti2eQualsiasi microscopio con fluorescenza adeguata può essere utilizzato per la microscopia ottica. 
MPSN SiN filtraSiMPore Inc.FD25-8.0-Au; FD25-8.0-NC
FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
Siringhe monoject 60 mL Coviden8881560265
Nile Red powderTCIN0659
Guanti in nitrileAnsell Microflex19-167-17
OpenSpecyopenanalysis.orgOpen source, libreria spettrale
FornoVWR1310Gravity Forno a convezione
P20 PipettaBrandtech705872
Puntale per pipettaPremium FialeGS 151140R
Supporto poroso frittaAdvantec311000Parte del pacchetto
Strumento RamanHoribaXplora PLUS
Tappo in gommaAdvantec311000Parte del pacchetto
Strumento SEMZiessAuriga AurigaSeries, postazione di lavoro con traversa modulare
Guarnizioni in siliconeSiMPoreGASKET-25-RGuarnizioni PDMS a colata trasparente, spessore 0,8 mm
Rullo in siliconeSanyue ( ASIN: B07XDTNPS3)Rullo in silicone -  8 x 5 x 2 pollici
Software SmartSEMZeissV8SEM utilizzato per utilizzare il flacone spray Zeiss Auriga
UlineS-7273
Filtri per siringhe Thermo ScientificCH2225-PES0.22 µ Filtri per siringa m luer lock, 25 mm
pompa a siringaNew Era Pump Systems, Inc.NE-1000Opzionale, ma consigliato
Trypan Blue - 0,4%Pinzetta Millipore SigmaT8154-20ML
SiMPoreK6TWZR
Pompa a vuotoWelch847-676-8800
Tubo a vuotoGraingerZUSA-HT-4037
1

References

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