Questo protocollo introduce un metodo rapido per l'imaging vascolare tridimensionale quantitativo a montaggio intero utilizzando la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso. L'efficacia del metodo è dimostrata utilizzando il sistema arterioso dell'arco faringeo del modello di embrione di pollo, con forze emodinamiche quantificate tramite fluidodinamica computazionale.
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Articolo metodologico
Imaging rapido ad alta risoluzione a montaggio intero della vascolarizzazione di piccoli animali per studi quantitativi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nei piccoli modelli animali di sviluppo e malattie cardiovascolari, le simulazioni computazionali del flusso sanguigno specifiche per soggetto consentono valutazioni quantitative di metriche emodinamiche difficili da misurare sperimentalmente. Le simulazioni fluidodinamiche computazionali fanno luce sui ruoli critici della meccanica nella funzione cardiovascolare e nella progressione della malattia. L'acquisizione di immagini volumetriche di alta qualità dei recipienti di interesse è fondamentale per l'accuratezza e la riproducibilità delle misurazioni morfologiche e dei risultati della quantificazione del flusso. Questo studio propone un metodo rapido, economico e accessibile per l'imaging ad alta risoluzione a montaggio intero della vascolarizzazione di piccoli animali utilizzando la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso. Il protocollo di preparazione del campione light-sheet iDISCO+ modificato (immunolabeling-enabled tridimensional-dimensional imaging of solvent-cleared organs) prevede (1) l'etichettatura della vascolarizzazione con un agente fluorescente, (2) la conservazione del campione e (3) la resa trasparente del campione. A differenza del classico iDISCO+, che utilizza la colorazione immunoistochimica, gli autori etichettano l'endotelio vascolare con poli-L-lisina marcata FITC, un colorante fluorescente non specifico economico e altamente resistente al foto-sbiancamento, in un processo chiamato "endo-pittura". L'etichettatura rapida riduce il tempo di preparazione del campione da circa quattro settimane a meno di 3 giorni. Inoltre, l'uso del solvente minimamente pericoloso etilcinnamato (ECi) come agente di pulizia e soluzione di imaging rende i campioni più sicuri da maneggiare e conformi a una gamma più ampia di strutture di imaging. Il protocollo proposto viene applicato per ottenere stack di immagini al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso ad alta risoluzione del sistema cardiovascolare in embrioni di pollo che vanno dal giorno 3 (HH18) al giorno 8 (HH34). Questo studio dimostra ulteriormente l'idoneità di questo metodo per la quantificazione vascolare attraverso la ricostruzione 3D e la modellazione emodinamica computazionale di un embrione di pollo del giorno 5 (HH 26).
Introduzione
L'imaging volumetrico è necessario per studi accurati della fisiologia e delle malattie cardiovascolari. L'imaging quantitativo produce stack di immagini ad alta risoluzione con dimensioni volumetriche intatte. I campioni devono essere conservati per mantenere la loro morfologia e il volume del lume in vivo , nonché riprodotti con una capacità uniforme ad alta risoluzione. Da stack di imaging ad alta risoluzione, l'utente può generare rendering vascolari tridimensionali ad alta fedeltà che consentono una visualizzazione completa delle forme, della struttura e della connettività dei vasi1.
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Protocollo
L'Office of Laboratory Animal Welfare interpreta la politica del Servizio Sanitario Pubblico come applicabile al modello di pulcino come "animale vertebrato" solo dopo la schiusa. Questi embrioni sono allo stesso modo esenti dalla giurisdizione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC). Le domande frequenti del National Institutes of Health sono disponibili all'indirizzo: http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy.
1. Raccolta, etichettatura e fissazione degli embrioni
- Fashion ha estratto aste capillari di vetro con diametro....
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Risultati
Il protocollo di imaging rapido ad alta risoluzione a montaggio intero qui presentato (Figura 1, Tabella 1) produce lumi dei vasi chiaramente delineati, come mostrato nella Figura 2, Figura 3 e Figura 4, dove l'endotelio vascolare dell'embrione di pollo è fluorescente GFP e quindi delineato in verde in tutti gli stadi embrionali dallo sviluppo precoce a quello maturo del cuore (Figu.......
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Discussione
La capacità di studiare la biologia in 3D è fondamentale per una comprensione accurata della complessità morfologica, della struttura degli organi interni e delle connessioni vascolari. Immagini vascolari 3D accurate e affidabili sono fondamentali anche per le simulazioni emodinamiche computazionali specifiche per soggetto, che sono spesso l'unico mezzo affidabile per quantificare i parametri emodinamici chiave come lo sforzo di taglio della parete e la distribuzione della pressione. Qui.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da un American Heart Association Career Development Award, Burroughs Wellcome Fund Career Award presso la Scientific Interface, Additional Ventures Single Ventricle Research Fund e dalla UCSD School of Medicine Microscopy Core (Grant P30 NS047101). Gli autori ringraziano il Dr. Bobby Thompson per la sua introduzione all'endo-painting, l'UCSD School of Medicine Microscopy Core e Robert Porter (UCSD) per il supporto sperimentale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #5 pinze | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55-pinze | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 0,03 pollici diametro interno tubo in silicone | VWR | 32829-182 | |
| 20 μ L puntali per pipette | VWR | 76322-134 | |
| Piastra di Petri da 35 mm | VWR | 10799-192 | |
| Siringa di plastica da 5 mL | VWR | BD 309646 | |
| diclorometano (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | fare riferimento alla scheda di sicurezza. Conservato nell'armadio laterale sotto la cappa aspirante |
| Etilcinnamato (ECi) | Sigma-Aldrich | 112372 | Conservato a 4 gradi; C |
| Forbici curve fini | Strumenti per la scienza fine | 14061-09 | |
| FITC-poly-L-lisina | Sigma-Aldrich | P3069 | Negozio a -20 ° C (polvere, soluzione madre), 4º C (soluzione di lavoro) |
| Microscopio a fluorazione | EVIDENT SCIENTIFIC | MVX10 | |
| Tubi capillari in vetro (0,75 mm ID) | Sutter Instrument | FG-GB100-75-10 | |
| Microscopio a foglio luminoso | Zeiss | Z.1 | |
| Metanolo | Sigma-Aldrich | M1775 | Fare riferimento a MSDS. Conservato in armadio infiammabile sotto cappa aspirante |
| Microforge | Narishige International USA, Inc. | MF2 | |
| Micromanipolatore | World Percision Instrrument | M3301R | |
| Paraformaldeide (PFA) 4% | Thermo Scientific | J19943. K2 | Fare riferimento alla scheda di sicurezza. Immagazzinato a -20 ° C (polvere), 4 gradi; C (soluzione di lavoro al 4%) |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Cytiva | SH30256.01 | Memorizzato su software |
| open source | SimVascular | ||
| Tyrode' s Soluzione | realizzata internamente |
Riferimenti
- Lindsey, S. E., Butcher, J. T., Vignon-Clementel, I. E. Cohort-based multiscale analysis of hemodynamic-driven growth and remodeling of the embryonic pharyngeal arch arteries. Development. 145 (20), dev162578(2018).
- Lindsey, S. E., Vignon-Clementel, I. E., Butcher, J. T.
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Ristampe e permessi
