In questo studio, è stata sviluppata una tecnica di rilevamento a sandwich basata su doppi anticorpi per il rilevamento rapido di antigeni fecali infettati da Helicobacter pylori.
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Articolo metodologico
Rilevamento rapido dell'antigene fecale dell'infezione da Helicobacter pylori basato sulla tecnologia di rilevamento a sandwich di doppi anticorpi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'Helicobacter pylori può essere parassitario della mucosa gastrica, che può causare una serie di malattie gastrointestinali dopo l'infezione ed è strettamente correlato alla gastrite, all'ulcera gastrica e al cancro gastrico. L'elevata prevalenza dell'infezione da H. pylori in regioni con scarse infrastrutture mediche e aree igienico-sanitarie inadeguate rimane un notevole problema di salute pubblica. Di conseguenza, lo sviluppo di metodi di screening rapidi, semplici ed economici per la rilevazione di H. pylori in contesti con risorse limitate è di fondamentale importanza.
In questo studio, abbiamo condotto uno screening basato sulla comunità nel villaggio di Shitan, nella provincia del Guangdong, un'area remota e sottosviluppata caratterizzata da una popolazione permanente di circa 300 residenti con un livello di istruzione generalmente basso. Abbiamo impiegato un doppio test anticorpale a sandwich per la rilevazione dell'antigene fecale di H. pylori , un metodo scelto per la sua potenziale applicabilità in contesti con scarse risorse. Sono stati arruolati un totale di 261 partecipanti del villaggio e i loro campioni fecali sono stati analizzati utilizzando questa tecnica. Per la convalida comparativa, gli stessi campioni sono stati sottoposti ad analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR). Rispetto ai risultati della qPCR, la sensibilità e la specificità del rilevamento dell'antigene di H. pylori nelle feci erano del 60,24% e dell'80,08%. I risultati hanno dimostrato una forte concordanza tra il metodo di rilevamento dell'antigene fecale e la qPCR (Kappa = 0,630). Questo studio ha chiarito sistematicamente i principi, le procedure, le metodologie e le applicazioni cliniche del rilevamento dell'antigene fecale per l'infezione da H. pylori , con l'obiettivo di esplorare la tecnologia del sandwich di doppi anticorpi a base di lattice e stabilire nuove strategie e linee guida pratiche per la sua diagnosi ausiliaria.
Introduzione
L'Helicobacter pylori (H. pylori, Hp) è unbatterio gram-negativo 1 microaerofilo a forma di spirale. Grazie alla sua capacità di colonizzare e infettare cronicamente lo stomaco umano2, questo patogeno è stato identificato come un importante fattore eziologico nello sviluppo dell'adenocarcinoma gastrico 3,4. Nel 2015, ~4,4 miliardi di persone nel mondo hanno sofferto di infezione da H. pylori 5. La prevalenza dell'infezione da H. pylori mostra notevoli variazioni geografiche, con i paesi in via di sviluppo che registrano tassi significativamente più elevati rispetto alle nazioni sviluppate. In particolare, nei paesi a basso reddito e tra alcune popolazioni vulnerabili, il tasso di infezione può raggiungere il 75%6.
Sebbene i metodi di rilevamento tradizionali come la gastroscopia siano accurati, la loro applicazione nello screening su larga scala e nel follow-up di routine è limitata a causa della loro invasività, del costo elevato e della bassa accettazione da parte deipazienti7. Pertanto, la ricerca di metodi diagnostici non invasivi, semplici e rapidi è diventata una direzione importante della moderna ricerca di medicina clinica. Lo scopo principale di una diagnosi non invasiva di H. pylori è quello di rilevare in modo accurato, sicuro e conveniente se il paziente è infetto da H. pylori senza esame endoscopico. Il test dell'urea del respiro (UBT ), il test dell'antigene fecale (FAT)8 e il test sierologico9 sono tecniche non invasive molto diffuse.
Tra queste, l'UBT è la procedura meno intrusiva e più accurata disponibile10. La sensibilità e la specificità dell'UBT sono superiori al 95%11. Tra i metodi diagnostici non invasivi disponibili, l'UBT ha dimostrato di essere il più accurato e affidabile, come si è visto in uno studio di convalida condotto in Iraq, l'UBT può essere raccomandato come prima scelta grazie alle sue prestazioni più elevate rispetto ad altri metodi12. Tuttavia, l'UBT ha anche i suoi svantaggi, come il costo elevato e la necessità di analisi spettrometriche di massa, che limitano l'applicazione in ambienti remoti o con risorse limitate13.
Lo sviluppo di un metodo diagnostico rapido, non invasivo ed economico per rilevare l'infezione da H. pylori è estremamente necessario, in particolare nelle regioni con risorse limitate. In questo studio, abbiamo sviluppato una tecnologia di rilevamento rapido per l'antigene fecale di H. pylori basata sulla tecnologia di rilevamento a sandwich di doppi anticorpi, in grado di rilevare l'antigene di H. pylori in campioni fecali in modo rapido, efficace e a basso costo. Questa tecnologia offre vantaggi significativi, tra cui convenienza, non invasività, facilità d'uso e adattabilità alle aree remote. Ipotizziamo che il metodo a sandwich di doppi anticorpi per rilevare l'antigene fecale di H. pylori dimostrerà sensibilità e specificità paragonabili alla qPCR, posizionandolo come uno strumento praticabile per la diagnosi clinica non invasiva.
Abbiamo dettagliato in modo completo i principi, le procedure, i punti di forza metodologici e l'applicabilità clinica del rilevamento dell'antigene fecale per l'infezione da H. pylori . Per convalidarne la praticità, abbiamo condotto un'indagine epidemiologica e uno screening nel villaggio di Shitan, nella città di Qingyuan, nella provincia del Guangdong, in Cina, che è un'area remota e sottosviluppata con una popolazione permanente di circa 400 persone e un livello di istruzione limitato. I nostri risultati dimostrano che la tecnologia di rilevamento rapido dell'antigene di H. pylori nelle feci qui progettata può essere completata entro 20 minuti. Si evidenzia che il rilevamento rapido dell'antigene di H. pylori nelle feci è uno strumento potenziale e promettente per una diagnosi rapida e affidabile dell'infezione da H. pylori in aree remote e arretrate.
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Protocollo
Questo studio trasversale è stato approvato dal Comitato etico dell'Ospedale del popolo provinciale del Guangdong (numero di approvazione: KY2024-445-01) e i dati personali di tutti i soggetti dello studio sono stati strettamente riservati durante lo studio. Tutti i partecipanti hanno firmato il consenso informato scritto prima degli esperimenti. I residenti del villaggio di Shitan nella città di Qingyuan, nella provincia del Guangdong, nel 2024 sono stati selezionati come soggetti di ricerca e non c'erano restrizioni di età e sesso. Il test del doppio sandwich di anticorpi (un esperimento qualitativo) descritto di seguito è stato eseguito da personale medico e tecnico professionale secondo le istruzioni. L'intera popolazione permanente del villaggio è stata selezionata per questo studio, indipendentemente dal fatto che fosse sana o avesse sintomi o qualsiasi malattia esistente correlata a malattie gastrointestinali.
1. Selezione del paziente
- Escludere i pazienti che hanno utilizzato inibitori della pompa protonica o bismuto, bloccanti del recettore H2 o antibiotici nel 1 mese precedente.
- Chiedi a tutti i partecipanti di compilare il questionario in forma anonima. Il contenuto del questionario comprende cinque domande: Mangi tre pasti regolarmente? Bevi alcolici? Sei a conoscenza di H. pylori? Pensi che sia necessario effettuare un'ispezione di H. pylori ? Comprendi le conseguenze negative dell'infezione da H. pylori ?
2. Procedura per il rilevamento dell'antigene dell'infezione fecale da H. pylori
NOTA: L'algoritmo per il test dell'antigene delle feci di H. pylori è stato progettato per garantire l'accuratezza e l'affidabilità dei risultati, tenendo conto della semplicità e dell'igiene. L'intero processo è suddiviso in cinque fasi: raccolta dei campioni, elaborazione dei campioni, conservazione dei campioni, rilevamento e interpretazione dei risultati. Il diagramma di flusso di lavoro e il diagramma schematico del rilevamento del campione sono mostrati nella Figura 1 e nella Figura 2.
- Raccolta campioni
NOTA: Per la raccolta dei campioni devono essere utilizzati contenitori specifici per l'antigene di H. pylori . I campioni non devono essere mescolati con acqua, urina, disinfettanti e acque reflue.- Al termine della defecazione, rimuovere il coperchio superiore dell'apposito contenitore per estrarre l'asta di campionamento.
- Inserire il sample asta continuamente in cinque diverse posizioni dello sgabello per il campionamento, assicurandosi che l'estremità filettata del sample asta sia completamente inserita nello sgabello.
- Reinserire l'asta di campionamento nella provetta del reagente al termine del campionamento; Il volume del campione è di ~5-50 mg in totale.
- Elaborazione dei campioni
- Agitare la provetta del reagente da un lato all'altro per ~10 s per miscelare accuratamente il campione di feci nel diluente (ingredienti principali: acido etilendiammina tetraacetico, tetrasodio idrato 0,018 g/mL e cloruro di sodio 0,01 g/mL).
- Conservazione dei campioni
- Testare i campioni il prima possibile dopo il campionamento; conservarli a temperatura ambiente per non più di 6 ore e in condizioni refrigerate (non più di 72 ore a 2-8 °C e non più di 6 mesi congelati a -25 °C--15 °C) se necessario per rallentare la degradazione dell'antigene e l'attività microbica.
NOTA: I campioni possono essere congelati e scongelati ripetutamente fino a 3 volte e sia i campioni refrigerati che quelli congelati devono essere riportati a temperatura ambiente prima del test.
- Testare i campioni il prima possibile dopo il campionamento; conservarli a temperatura ambiente per non più di 6 ore e in condizioni refrigerate (non più di 72 ore a 2-8 °C e non più di 6 mesi congelati a -25 °C--15 °C) se necessario per rallentare la degradazione dell'antigene e l'attività microbica.
- Rilevamento del campione
- Aprire il coperchio bianco del tubo del reagente e mantenere il tubo del reagente eretto.
- Premere il coperchio fino al punto più basso in modo che il campione fluisca sulla scheda di prova, passando attraverso l'area di rilevamento (T) e l'area di controllo qualità (C) rivestite con l'anticorpo anti-Hp del topo.
- Interpretazione dei risultati
- Attendere 10-20 minuti in modo che qualsiasi antigene di H. pylori nel campione, se legato all'anticorpo, formi una reazione cromogenica macroscopica nell'area di rilevamento. Questo di solito appare come una linea rossa o viola che contrasta con la linea nell'area del controllo qualità.
- La presenza o l'assenza della reazione cromatica e la profondità del colore sono correlate alla concentrazione dell'antigene di H. pylori nel campione. Confrontare le cartelle colori per interpretare i risultati in modo rapido e accurato (vedere la Figura 3).
3. Estrazione del DNA
- Mettere una quantità adeguata di feci in una provetta, aggiungere la soluzione di PBS e mescolare accuratamente agitando. Centrifugare la miscela a 12.000 × g per 5-10 minuti, quindi raccogliere con cura 200 μl di surnatante per un'ulteriore estrazione.
- In base al numero di campioni, preparare un numero uguale di provette da centrifuga da 1,5 mL. A ciascuna provetta, aggiungere in sequenza 20 μL di proteinasi K (20 mg/mL), 10 μL di biglie magnetiche, 200 μL di surnatante del campione e 200 μL di tampone di lisi A. Mescolare accuratamente capovolgendo le provette, quindi incubare in un bagno di metallo a 55 °C per 10 minuti.
- Al termine della pirolisi, posizionare la provetta da centrifuga sul telaio magnetico, lasciarla riposare e lasciare che l'adsorbimento avvenga per 1 minuto sulle perline. Dopo che il liquido nel tubo è completamente chiarificato, scartare il surnatante e cercare di evitare di disturbare le microsfere magnetiche.
- Rimuovere le provette dal rack magnetico e posizionarle su un rack per provette da centrifuga da 1,5 mL. Utilizzando una pipetta, aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio E a ciascuna provetta, mescolare accuratamente per 1 minuto, quindi rimettere le provette nel rack magnetico. Lasciare riposare le provette per 1 minuto, scartare il surnatante dopo la chiarificazione ed evitare di aspirare le microsfere magnetiche.
- Ripetere il processo di lavaggio aggiungendo 500 μL di tampone di lavaggio W2 a ciascuna provetta. Mescolare accuratamente per 1 minuto, posizionare le provette sulla griglia magnetica e lasciarle riposare per 1 minuto. Eliminare il surnatante con cura dopo che la soluzione si è chiarificata, assicurandosi che le microsfere magnetiche rimangano indisturbate.
- Aggiungere 100 μl di eluente, mescolare e incubare a 55 °C per 5 minuti.
- Posizionare le provette sulla griglia magnetica e lasciarle riposare per 2 minuti. Una volta chiarificata la soluzione, trasferire con cura l'acido nucleico eluito in una nuova provetta da centrifuga, evitando l'aspirazione delle microsfere magnetiche.
- Valutare la purezza del DNA estratto misurando l'assorbanza a 260 nm (A260) e 280 nm (A280). Calcola il rapporto A260/A280 , che idealmente dovrebbe essere maggiore di 1,8 per il DNA ad alta purezza.
4. qPCR per la rilevazione di H. pylori e resistenza agli antibiotici
NOTA: Abbiamo eseguito la qPCR per il rilevamento dell'infezione da H. pylori amplificando il gene ureA . Tutti i prodotti per il controllo di qualità negativo sono acqua sterile e purificata. Il prodotto per il controllo di qualità positivo nel kit di rilevamento dell'acido nucleico di H. pylori è costituito da perle standard inattivate di H. pylori (ATCC 43504). A, C, T, ≤ 30 con una tipica curva a forma di S è considerata positiva.
- In base al numero di campioni da testare, estrarre il preparato liofilizzato di H. pylori dal kit e centrifugarlo rapidamente per mantenere la polvere liofilizzata sul fondo del tubo.
- Aprire con cautela il coperchio del preparato liofilizzato; prelevare l'acido nucleico del campione da sottoporre a prova; aggiungere 25 μl di acido nucleico del campione al preparato liofilizzato; e coprire bene il tubo.
- Agitare e mescolare il reagente PCR in modo uniforme per 8-10 s, quindi centrifugarlo rapidamente per 3-5 s.
- Per ciascun campione su una piastra a 32 pozzetti, preparare 25 μl della miscela di reazione PCR (polvere liofilizzata [contenente l'enzima Taq (5 U/μL), desossiribonucleosiside trifosfato (2,5 mmol/L), enzima UNG (2 U/μL), primer ureA forward (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') e reverse (5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') (40 μmol/L)]) e 25 μl (2,5 μg) del DNA estratto.
- Eseguire la scheda qPCR su piastra a 32 pozzetti sulla macchina qPCR. Programmare il termociclatore: 42 °C e 95 °C (entrambi per un ciclo) per 2 min ciascuno; 95 °C per 10 s e 65 °C per 45 s (due passaggi sono un ciclo) per 10x; 95 °C per 10 s e a 58 °C per 45 s (due fasi sono un ciclo) per 35 cicli.
- Analizza i dati utilizzando un software specifico per qPCR e lascia che lo strumento selezioni automaticamente le soglie di base.
5. Analisi statistica
- Utilizzare il test del chi-quadrato per analizzare i dati sperimentali per valutare la coerenza tra questo metodo e i risultati della qPCR e confrontare il tasso di positività di questa tecnologia di screening con i dati del tasso di positività dell'infezione da H. pylori su scala più ampia (ad esempio, a livello nazionale). Considera le differenze statisticamente significative a P < 0,05.
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Risultati
Questionario
Nello studio sono stati arruolati un totale di 261 partecipanti, di cui 144 femmine e 117 maschi, di età compresa tra i 4 e i 99 anni. L'età media dei soggetti era di 48,30 ± 17,61 anni. C'erano 17 minori (0-17 anni), 202 adulti (18-64 anni) e 42 anziani (>64 anni). I risultati del questionario sono riportati nella Tabella 1. La maggioranza (90,8%) dei soggetti ha ritenuto necessario effettuare lo screening di H. pylori .
Ri...
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Discussione
L'H. pylori rappresenta una delle infezioni batteriche più diffuse in tutto il mondo15. I risultati del questionario hanno rivelato che il 55,2% della popolazione non era a conoscenza di H. pylori, mentre il 90,8% riteneva che lo screening di H. pylori fosse necessario. Questi risultati sottolineano l'importanza di implementare programmi di screening di H. pylori in aree economicamente svantaggiate e remote16
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit per estrazione del DNA | Fornitore verificato - Jiangsu mole biotechnology co., ltd | 20230223 | Nessuno |
| Kit per il rilevamento dell'antigene fecale H. pylori | Fornitore verificato - Hangzhou nuohui healthy technology co., ltd | 20213401126 | Nessuno |
| Kit per il rilevamento dell'acido nucleico H. pylori | Fornitore verificato - Jiangsu mole biotechnology co., ltd | 20230226 | Nessuno |
| PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale | Shanghai Hongshi tecnologia di trattamento medico co., ltd | 20183221659 | Nessuno |
| Soluzioni per prodotti e servizi statistici | Società IBM | Nessuno | Nessuno |
Riferimenti
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