Articolo metodologico

Nuovo modello di isole per lo studio 3D delle interazioni endoteliali e cellulari β: rilevanza per lo screening degli agenti citoprotettivi

DOI:

10.3791/68220

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17 aprile 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata per generare sferoidi stabili degli isolotti pancreatici murini, e metodi dettagliati per la colorazione, la pulizia e il montaggio 3D, adattati alla loro piccola dimensione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo dettaglia un metodo ottimizzato per la produzione di piccoli sferoidi stabili, la loro coltura e l'imaging 3D, per lo studio delle interazioni endoteliali e delle cellule β produttrici di insulina in un modello 3D di isolotti pancreatici. Gli sferoidi da 150-200 μm, che rispecchiano la gamma più bassa di dimensioni degli isolotti, sono stati preparati da un rapporto selezionato che combina 1 cellula endoteliale intra-isolotta (cellule MS-1) a 20 cellule secretrici di insulina (β-TC-6). Sono dettagliate le sfide di colorazione, pulizia e montaggio di piccoli sferoidi e il loro attacco tramite l'uso dell'agarosio a basso punto di fusione e la tecnica di pulizia CUBIC, oltre a punti chiave per un'analisi efficiente della struttura 3D con diverse sonde. I dati indicano che NTPDASI-ectonucleotidasi 3 non colocalizza con l'insulina nel modello sferoide, suggerendo livelli di maturità e funzionalità variabili di β-TC6 e che la procedura completa può essere applicata anche a isolotti pancreatici isolati, con chiara sondaggio dei vasi intra-isolotti. Questi risultati sottolineano l'efficacia del protocollo di imaging 3D nel rivelare l'organizzazione complessa delle cellule pancreatiche e le interazioni all'interno del modello dell'isolot.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il trapianto di isoli pancreatici è spesso complicato da una reazione infiammatoria istantanea mediata dal sangue (IBMIR), che danneggia significativamente le cellule endoteliali intra-isole (IEC) con un impatto sulla perfusione e sulla funzione dell'innesto. A lungo termine, una massa ridotta di isolotti funzionali e la perdita dell'indipendenza insulinica sono descritte nei pazienti, 4 anni dopo iltrapianto. Sebbene siano stati sviluppati modelli murini o ratti di trapianto di isolotti, mancano modelli standardizzati per indagare bersagli farmacologici per il precondizionamento degli isolotti, particolarmente rilevanti nel contesto dei danni indotti da innesti guidati da citochinedall'IBMIR. In effetti, un costrutto sferoideo è particolarmente adatto per l'identificazione di nuovi bersagli farmacologici e la valutazione di molecole citoprotettive contro disfunzioni cellulari indotte da citochine. Inoltre, offre un approccio alternativo per limitare l'uso di modelli animali di diabete di tipo 1 e trapianti di isolotti.

Trovare le condizioni appropriate per la colorazione, lo sgombero ottico e le condizioni di montaggio per piccoli sferoidi di dimensioni di isolotti rimane una sfida. In letteratura, pochissimi studi descrivono la manipolazione di piccoli sferoidi e le loro caratteristiche strutturali chiave. La difficoltà deriva anche dalla necessità di bilanciare la penetrazione dei tessuti, la conservazione del segnale e l'integrità strutturale mantenendo al contempo la natura delicata di queste strutture cellulari 3D in miniatura. Inoltre, i metodi convenzionali di colorazione spesso faticano a ottenere un'etichettatura uniforme degli sferi. Questo problema è aggravato dall'organizzazione cellulare densa, che può ostacolare la diffusione dei reagenti a causa della penetrazione limitata di anticorpi ecoloranti 3,4. Infine, il processo di pulizia ottica, cruciale per ridurre il fondo di diffusione della luce e migliorare la profondità di immagigine, deve essere ottimizzato con cura per evitare di disturbare la struttura dello sferoide o alterare le proprietàbiologiche 5.

Montare piccoli sferoidi per la microscopia 3D rappresenta un'altra sfida. I mezzi di montaggio tradizionali potrebbero non fornire un supporto adeguato a queste strutture delicate, potenzialmente portando alla loro deformazione o collasso durante l'imaging. Inoltre, l'adattamento dell'indice di rifrazione necessario per una qualità ottimale dell'imaging deve essere controllato con precisione per garantire una visualizzazione accurata in tutta la profondità dellosferoide 6,7. Lo sviluppo di protocolli adattati a piccoli sferoidi è ulteriormente complicato dalla diversità di tipi cellulari e dalle condizioni sperimentali utilizzate nelle colturesferoidi 3. Infine, la necessità di approcci specializzati per mantenere l'integrità di più popolazioni cellulari durante i processi di colorazione e eliminazione è fondamentale per la valutazione delle risposte cellulari.

Per affrontare le sfide specifiche dello studio dello stress mediato da IBMIR, è stato progettato un modello sferoide a 2000 cellule, combinando IEC murina e cellule β secernente insulina, con un rapporto di 1:20 di cellule IEC a β simili a quello osservato in un isolotto pancreatico. Inoltre, esperimenti precedenti hanno stabilito che la struttura mantiene la vitalità per 96 ore, fornendo così un modello 3D fisiologicamente rilevante per l'osservazione di risposte cellulari indotte da stress brevi (intervalli di ore) o più lunghe (giorni) e la loro modulazione farmacologica. Il modello sferoideo è costituito da cellule endoteliali intra-isole murine MS-1, caratteristiche della microvascolatura dell'isolotto e cellule costitutive secernente di insulina β, β-TC-68. È stato progettato per imitare da vicino la gamma di dimensioni più piccola degli isolotti pancreatici (50-200 μm di diametro) e il loro numero mediodi cella 9.

Viene riportata una nuova metodologia di raccolta e colorazione specificamente ottimizzata per la manipolazione di piccoli sferoidi (150-200 μm di diametro), consentendo una penetrazione ottimale di coloranti fluorescenti e anticorpi in tutta la struttura sferoidea e un minimo di background. Il protocollo incorpora una procedura di montaggio che utilizza agarosio a basso punto di fusione (LMPA) per fornire un supporto strutturale delicato a sferoidi delicati, consentendo al contempo un abbinamento ottimale dell'indice di rifrazione. LMPA è una forma modificata di agarosio con gelificazione ridotta (circa 27 °C) e temperatura di fusione (circa 65 °C) che preserva l'integrità del campione durante l'incasionamento e crea una matrice otticamente chiara con autofluorescenzaminima 4,6. Infine, il metodo cleared unobsted brain/body imaging and computational analysis (CUBIC)10 viene impiegato per la pulizia ottica, al fine di consentire la massima visualizzazione delle strutture interne e la preservazione dell'integrità delle delicate interazionicellula-cellula 5,6,10.

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Protocollo

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L'uso del tessuto pancreasico umano e tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Ministero dell'Istruzione Superiore e della Ricerca del governo francese (Direzione Generale per la Ricerca e l'Innovazione, Unità Bioetica) e registrati con il numero DC-2019-3439. Il consenso informato veniva ottenuto da tutti i tutori legali dei soggetti.

1. Preparazione degli sferoidi

NOTA: La linea IEC murina MS-1 e la linea cellulare β-pancreatica murina β-TC6 sono state coltivate simultaneamente per ottenere una quantità cellulare sufficiente per la coltura degli sferoidi. Gli MS-1 sono stati colti in fiaschette a cellule aderenti T75 in un mezzo ad alto contenuto di glucosio DMEM contenente 4,5 g/L di glucosio, con il 5% di siero fetale bovino e 1% di Penicillina/Streptomicina in un'atmosfera umida a 37 °C. I passaggi sono stati eseguiti alla confluenza (2 giorni di coltura) dopo il distacco utilizzando Tripsina EDTA 1x e tre lavaggi in soluzione Hank Balanced (HBSS). β-TC6 sono state colte in T75 per cellule aderenti difficili in un mezzo DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente 4,5 g/L di glucosio, con 15% di siero fetale bovino e 1% di penicillina/streptomicina in un'atmosfera umida a 37 °C. I passaggi sono stati eseguiti alla confluenza β-TC6 (coltura di 10 giorni) dopo il distacco con Tripsina EDTA 1x e 3 lavaggi in soluzione Hank Balanced (HBSS).

  1. Prepara la lastra della cultura sferoide
  2. Lavare la piastra con 500 μL di soluzione antiaderente fornita dal produttore per prevenire l'adesione cellulare e favorire la formazione degli sferoidi.
  3. Centrifugare la piastra a 1.300 x g per 5 minuti in un rotore a secchio oscillante dotato di portapiastre a temperatura ambiente.
  4. Osserva la lastra al microscopio luminoso per assicurarti che non rimangano bolle nei micropozzi. Se sì, centrifuga una seconda volta a 1.300 x g per 5 minuti.
  5. Elimina il risciacquo antiaderente e lava il pozzo 3 volte con 1 mL di HBSS caldo.
  6. Scartare l'HBSS e sostituirlo con 500 μL di mezzo sferoideo caldo: DMEM High Glucosio contenente 4,5 g/L di glucosio, siero fetale bovino al 10% e 1% di penicillina/streptomicina.
  7. Mantieni la piastra a 37 °C in un'atmosfera umida mentre prepari la sospensione sferoide.
  8. Incubare MS-1 e β-TC6 simultaneamente con la soluzione di tripsina e contare le cellule viventi in ciascuna linea di lignaggio.
    NOTA: Alla semina, gli sferoidi si formano utilizzando il rapporto 1 IEC a 20 cellule β tipico degli isolotti pancreatici. Utilizzare una piastra di coltura sferoida da 24 pozzi, con ogni pozzo contenente 300 micropozzi che potrebbero ospitare uno sferoide composto da 2000 cellule, per un totale di 600.000 cellule per pozzo. Nella presente indagine, le misurazioni hanno rivelato volumi sferoidi identici occupati dalle linee cellulari selezionate β-TC6 e MS1 dopo la coltura sferoida a 48 ori.
  9. Mescola insieme le due linee cellulari per corrispondere al rapporto 1-20 per 24 pozzi e poi sospenderle in 24 mL di mezzo sferoide.
    NOTA: Utilizzare una pipetta da 10 mL o 25 mL in movimento aspirazione-flusso per omogeneizzare la sospensione.
  10. Pipettare 1 mL per ogni pozzo e procedere con un movimento di aspirazione-flusso per distribuire uniformemente la sospensione della cella nel pozzo.
  11. Centrifuga la piastra a 130 x g per 5 minuti in un rotore a secchio oscillante dotato di portapiastre a temperatura ambiente.
  12. Osserva la lastra al microscopio per assicurarti che le cellule siano distribuite equamente tra i micropozzi.
    NOTA: Durante questa fase di centrifugazione, utilizzare alti tassi di accelerazione e decelerazione (70%-90% delle scale di accelerazione e decelerazione), altrimenti gli ammassi cellulari si sposteranno sul lato del micropozzo.
  13. Incubare la piastra a 37 °C, 5% diCO2.
  14. Monitorare la formazione e la crescita delle sferoidi usando un microscopio ottico.
    NOTA: Gli sferoidi β-TC6 / MS-1 dovrebbero iniziare a formarsi dopo 24 ore di coltura, raggiungendo una forma sferica dopo 48 ore. La vitalità può essere monitorata dal blu di tripano dopo la rottura della sferoidea da parte della tripsina in campioni duplicati ed è stata mantenuta per 96 ore (80%-90%).

2. Raccolta e colorazione degli sferoidi

  1. Sospezioni delicatamente gli sferoidi con una pipetta P1000 nel loro mezzo.
  2. Espelle gli sferoidi in piccoli volumi in un Falcon da 15 mL e centrifuga a 130 x g per 5 minuti a temperatura ambiente
  3. Aspirare delicatamente il mezzo evitando il pellet contenente gli sferi.
  4. Lava il pellet due volte con 2 mL di HBSS, delicatamente, per evitare dissociazioni degli sferoidi, e centrifuga a 130 x g per 5 minuti.
  5. Sotto un cappuccio chimico, scartare l'HBSS e risospendere gli sferoidi in 1 mL di soluzione PFA al 4% durante la notte a 4 °C per fissarli.
  6. Centrifugare il tubo a 130 x g per 5 minuti, eliminare la soluzione al 4% di PFA e lavare 3 volte con 2 mL di 1x PBS (preparato in acqua ultrapura di laboratorio di qualità).
  7. Risospensa in 2,5 mL di HBSS.
  8. Distribui la sospensione sferoidea in una piastra a 6 pozzi.
  9. Sotto una lente d'ingrandimento binoculare, seleziona manualmente da 20 a 30 sferoidi con una pipetta P200 e mettili in un tubo da 1,5 mL.
    NOTA: Ogni tubo da 1,5 mL è una condizione di colorazione contenente da 20 a 30 sferi. Sotto i 20 sferoidi raccolti, diventa difficile vederli quando vengono successivamente risospesi.
  10. Bilanciare i volumi dei tubi da 1,5 mL e centrifugare a 800 x g per 5 minuti.
    NOTA: Da questo momento in poi, tutti i passaggi di aspirazione della soluzione vengono eseguiti con l'aiuto di una lente d'ingrandimento. È molto difficile vedere gli sferoidi sotto luce artificiale. Esegui sempre i passaggi seguenti durante il giorno, mantenendo i tubi tenuti contro la luce del giorno. Tutte le soluzioni sono aspirate con una punta P1000 sormontata da una punta P10 all'estremità.
  11. Rimuovi quanta più HBSS possibile senza sospendere di nuovo gli sferi.
  12. Risospendere gli sferoidi in 400 μL di soluzione di tempra (0,5 M glicina in 1x PBS (pH 7-7,4)) per evitare qualsiasi rumore di fondo futuro causato dagli aldeidi residui della fissazione del PFA. Incubare a 37 °C per 2 ore.
  13. Centrifuga a 800 x g per 5 minuti e pipetta con la soluzione di tempra.
  14. Risospendere in 400 μL di tampone di penetrazione (0,2% Triton X-100, 0,3 M glicina, 20% DMSO in 1x PBS). Questo aiuterà a migliorare la penetrazione di anticorpi e sonde nucleari. Incubare a 37 °C per 2 ore.
    NOTA: Da questo punto in poi, gli sferoidi si depositano da soli e non si aggrappano più alla parete del tubo. La centrifugazione non è più necessaria se i volumi sono delicatamente aspirati senza disturbare il pellet sferoide. Se necessario, centrifuga a 800 x g per 5 minuti.
  15. Scartare il buffer di penetrazione e incubare 400 μL di buffer bloccante (0,2% Triton X-100, 1% BSA, 10% DMSO, 5% siero di capra in 1x PBS) durante la notte a 37 °C.
  16. Scartare il tampone bloccante e incubare durante la notte a 37 °C in 300 μL di soluzione primaria di anticorpi (0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% siero di capra in 1x PBS).
    NOTA: Gli anticorpi primari utilizzati sono: anti-CD31 (concentrazione finale di 2,2 μg/mL), anti-Integrina β1 (1,43 μg/mL), anti-Insulina (0,66 μg/mL) e anti-topoNTPDasi3 11 (diluizione 1:1000) (vedi Tabella dei Materiali). Gli IgG di controllo di rispettivi isotipi identici dovrebbero essere validati sulla stessa struttura per accertare la marcatura positiva tramite microscopia fluorescente.
  17. Scartare la soluzione primaria di anticorpi e lavare 3 volte con 400 μL di tampone di lavaggio (0,2% Tween 20, 1% BSA in 1x PBS). Scuoti per 5 minuti tra un lavaggio e l'altro.
  18. Incubare 300 μL della soluzione secondaria di anticorpi (DAPI (2 μg/mL), 0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% Siero di Capra in 1x PBS) durante la notte a 37 °C. Proteggi i tubi con carta stagnola.
    NOTA: Il DAPI va sempre aggiunto alle condizioni di colorazione, poiché questo facilita la ricerca degli sferoidi durante l'imaging microscopico e aiuta a non sbiancare i diversi fluorofori/coloranti. Tutti gli anticorpi secondari hanno una concentrazione finale di 2 μg/mL (vedi Tabella dei Materiali).
  19. Scartare la soluzione secondaria di anticorpi e lavare 3 volte con 400 μL di un secondo tampone di lavaggio: 0,2% Tween 20, 1% BSA in 1x PBS. Tieni l'ultimo lavaggio e conserva i tubi a 37 °C fino al montaggio lo stesso giorno.

3. Preparazione della soluzione

  1. Preparazione della soluzione di pulizia ottica
    NOTA: La soluzione di clearing ottico segue la procedura CUBIC10 ed è stata preparata come proposto da Gunasingh etal. 4. Le proporzioni dei componenti sono indicate in percentuali del peso finale della soluzione (p/w), perché l'etilendiamina Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Idrossipropilica) è troppo viscosa per essere pipetrata e deve essere pesata.
    1. In una bottiglia di vetro, pesa il 9% (a/p) di etiledeniammina N,N,N,N′,N′-Tetrakis (2-Idrossipropil) di urea, 44% (a/a) di saccarosio, 0,1% (a/a) di Triton X-100 e 24,9% (a/w) di acqua ultrapura di qualità da laboratorio.
      NOTA: Sono necessari circa 60 g di soluzione per liberare una piastra a 24 pozzi.
    2. Aggiungi una barra magnetica adattata al diametro della bottiglia.
    3. Riscalda e mescola la soluzione a 56 °C. Tieni una bottiglia di vetro di controllo piena d'acqua sullo stesso piatto per monitorare l'aumento della temperatura.
    4. Controlla la velocità di mescolare per mantenere un vortice liquido liscio e mescola la soluzione finché tutti i composti non sono completamente dissolti. La soluzione dovrebbe essere completamente liquida e trasparente. Questo può richiedere fino a 1 ora.
    5. Tieni a temperatura ambiente, protetto dalla luce.
      NOTA: La soluzione di dissipazione deve essere preparata almeno 24 ore prima della pulizia ottica, per permettere alla soluzione di degassare ed eliminare eventuali bolle che possa contenere. Per evitare di introdurre bolle, non scuotere mai più la soluzione. Mai conservare in frigorifero.
  2. Preparazione della soluzione LMPA al 2%
    1. Pesa 0,5 g di LMPA su una bilancia di precisione e mettila in una fiaschetta Erlenmeyer da 100 mL.
      ATTENZIONE: Non prendere un Erlenmeyer di volume più piccolo, perché c'è rischio di ustioni se trabocca.
    2. Sciogli in 25 mL di 1x PBS a temperatura ambiente.
    3. Incorpora accuratamente la polvere nella 1x PBS mescolando delicatamente la fiaschetta Erlenmeyer.
      ATTENZIONE: Per il passo successivo, è essenziale utilizzare dispositivi protettivi: guanti e una mascherina per occhi e viso, per proteggersi da schizzi e ustioni.
    4. Riscalda la fiaschetta Erlenmeyer nel microonde.
    5. Osserva quando la soluzione inizia a bollire (presenza di bolle nel liquido) e rimuovi immediatamente prima che esploda.
    6. Mescola delicatamente l'Erlenmeyer per incorporare la polvere.
      ATTENZIONE: Non mescolare troppo forte, perché il liquido potrebbe traboccare, bollire troppo e schizzare.
    7. Rimettere l'Erlenmeyer nel microonde, ripetere finché la LMPA non sarà completamente sciolta.
    8. Rimuovere l'Erlenmeyer e, prima che la LMPA si solidifichi, aggiungere rapidamente 1 mL di soluzione LMPA al 2% in tubi da 1,5 mL. Conserva a temperatura ambiente.
      NOTA: Il processo richiede tempo. Prepara la soluzione in anticipo e conservala per un uso successivo.

4. Montaggio e liberazione ottica

  1. Preriscalda la centrifuga a 40 °C, eseguendo un lungo ciclo per preparare la piastra campione.
    NOTA: I gel LMPA sono a 30 °C. Non far funzionare la centrifuga sotto i 40 °C. Se la centrifuga lo permette, aumentare a 50 °C.
  2. Liquefare aliquote di LMPA al 2% in un bagno d'acqua o in uno scaldabagno a tubo a 70 °C per 5-10 minuti.
  3. Abbassare e mantenere la temperatura del LMPA al 2% a 55 °C.
  4. Posiziona delicatamente la piastra di imaging sul riscaldatore di piastre preriscaldato a 50 °C.
    NOTA: Fai attenzione a non rompere o graffiare il fragile polimero usato come base per i pozzi.
  5. Fai attenzione che la piastra sia calda prima di aggiungere il LMPA al 2%. A questo punto non deve funzionare.
  6. Pipetta 200 μL di LMPA al 2% in ogni pozzo. Copri l'intero fondo del supporto per ottenere una prima base liquida, che permette una distribuzione più fluida degli sferoidi.
  7. Scartare il buffer di lavaggio dai tubi, risospendere gli sferoidi a 300 μL di LMPA al 2% e pipetarli direttamente nel loro pozzo. Esegui sempre una rissospensione delicata per evitare bolle.
  8. Copri la piastra con carta stagnola per proteggere i fluorofori.
  9. Pesa rapidamente il piatto senza la carta stagnola e riportalo al riscaldatore del piatto.
  10. Prepara una piastra da 24 pozzi, aggiungendo acqua per l'equilibrio.
  11. Rimuovi rapidamente la piastra con la carta stagnola dal riscaldatore per proteggere i fluorofori accoppiati agli anticorpi secondari. Tieni in mano e non posare su una superficie fredda.
  12. Rimuovi la carta stagnola e mettila nella centrifuga a piastra.
  13. Centrifugare a 1000 x g per 15 minuti a 40 °C. Controlla la temperatura del rotore, che dovrebbe essere a temperatura ambiente.
  14. Durante la centrifugazione, prepara un vassoio per il ghiaccio: appiattisci il ghiaccio in modo che il piatto possa essere posizionato su una superficie piana.
  15. Rimuovi il piatto e mettilo sul ghiaccio, coprendo il vassoio o il piatto con carta stagnola. Lascia il piatto sul ghiaccio per 10 minuti.
  16. Rimuovi la piastra dal ghiaccio e lasciala nell'alluminio per stabilizzarla a temperatura ambiente per 20 minuti.
  17. Pipetta da 1 a 1,5 mL di soluzione per pozzo, coprire con carta stagnola e lasciarla liberare otticamente a temperatura ambiente, protetta dalla luce, per almeno 48 ore.
    NOTA: Non conservare mai la piastra a 4 °C. L'LMPA può contrarsi, staccarsi dal fondo del pozzo e galleggiare nella soluzione di clearing. Immagine entro una settimana dallo svuotamento.

5. Imaging

  1. Usa un microscopio a disco confocale rotante, scegli (almeno) l'obiettivo 30x.
  2. Mantieni le soluzioni di clearing, poiché servono a omogeneizzare gli indici di rifrazione e a rendere più semplice l'imaging 3D.
  3. Trova gli sferoidi selezionando il canale DAPI per evitare di sbiancare gli altri fluorofori.
  4. Acquisire immagini utilizzando la funzione Z-stack. Seleziona la parte superiore e inferiore dello sferoide e distanzia le tacce ottiche a 10 μm di distanza.
    NOTA: L'acquisizione e l'analisi delle immagini sono state effettuate sulla piattaforma di imaging del CRBS, PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra.

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Risultati

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Per valutare l'efficacia dell'etichettatura e dello clearing ottico, diversi modelli sono stati sottoposti allo stesso protocollo e successivamente fissi (Figura 1). Sferoidi con rapporti di 1 IEC a 20 celle di β e da 1 IEC a 50 β sono stati coltivati secondo il metodo sopra descritto. Da notare che il rapporto 1 IEC per 20 cellule β approssima quello di un isolotto pancreatico umano. L'uso del blu di tripano per colorare gli sferoidi disturbati ha confermat...

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Discussione

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È stato sviluppato un modello sferoideo che incorpora cellule murine IEC MS-1 e β murine β-TC6, imitando la struttura tridimensionale degli isolotti pancreatici. Questo modello è adatto all'analisi della disfunzione IEC indotta dallo stress in 72 ore e del suo impatto sulla vitalità e funzione delle β cellule, con rilevanza per la ricerca sui trapianti di isolini. È importante sottolineare che lo sferoide costituito da cellule murine era omogeneo per natura e con una rilevante linea endo...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori sono debitori a Pascal Kessler, della piattaforma di imaging PICSTRA, per l'assistenza esperta nella microscopia a disco rotante e nell'estrazione dei dati grezzi di etichettatura dallo stack Z. Gli autori desiderano riconoscere il gentile dono degli isolotti umani purificati da parte del dott. W. Bietiger, del dott. A. Langlois e del dottor K. Bouzakri del Centro Europeo per lo Studio del Diabete (CEED, Strasburgo, Francia)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
µ-piastra a 24 pozzi Nero ID 14 mm IBIDI82426
AggreWell 800 (24 pozzi)StemCell34815
Soluzione antiaderente per risciacquare StemCell7010
Anticorpi anti-CD31 [P2B1]abcamab24590Concentrazione finale 2.2 & micro; g/mL
Anti-Integrina e beta; 1 Anticorpo, clone MB1.2MerckMAB1997 Concentrazione finale 1,43 & micro; g/mL
Fiaschetta per colture cellulari, T-75, superficie, superficie : Cell+, tappo filtroSarstedt83.3911.302β-TC6 cultura
Fiaschetta per coltura cellulare, T-75, superficie: Standard, tappo a vite a 2 posizioniSarstedt83.3911.02Cultura MS-1
Dicloridrato DAPIThermofisher,D1306Concentrazione finale 2 & micro; g/mL
Dimetilsolossido  SigmaD8418-250ML
DMEM, glucosio alto, GlutaMAX e trade; Integratore, piruvatoThermofischer scientific31966047
Dulaglutide
DulaglutideLillyPenna Trulicity 1,5 mg
Siero bovino fetaleBiowestS1810-500
GlicinaSigmaG7126-1KG
Anticorpo secondario anti-porcellino d'India capra (H+L) Altamente adsorbito incrociatato, Alexa Fluor & trade; 555TermofischerA21435Concentrazione finale 2 & micro; g/mL
Anticorpo secondario altamente adsorbito incrociato per capre IgG (H+L), Alexa Fluor & trade; 488Termofischer  A-11029Concentrazione finale 2 & micro; g/mL
Anticorpo secondario anti-coniglio (H+L) per capre, Alexa Fluor & trade; 633TermofischerA-21071Concentrazione finale 2 & micro; g/mL
Anticorpo secondario anti-ratto IgG (H+L) adsorbito incrociato per capra, Alexa Fluor & trade; 555TermofischerA21434Concentrazione finale 2 & micro; g/mL
Siero per capreSigmaS26-100ML
HBSS senza calcio e senza calcio magnesio e nbsp; & Rosso fenoloCorning21-022-CV
Insulina (C27C9) MAb del coniglioSegnalazione cellulare3014SConcentrazione finale 0,66 e micro; g/mL
Isolotti pancreati umani isolati Centro Europeo e Acuto; en d'Etude du Diabete (CeeD)Un gentile regalo del dottor Karim Bouzakri. Grado clinico, isolato secondo le linee guida.
Bassa temperatura di gelificazione AgaroseMerckA9414-10G
Celle MS-1ATCCCRL-2279
Soluzione di paraformaldeide, 4% in PBS 1xFischer scientifico15670799
PBS 10xEuromedexET330-ADiluito 1x in acqua ultrapura di qualità da laboratorio
Penicillina-StreptomicinaPAN BiotechP06-07100
Anticorpi anti-porcellino policlonale NTPDdase 3 per porcellino d'India & nbsp;mN3-1CI4; mN3-2C (I4,I5); mN3-3C(I4,I5) https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpDiluizione 1:1000
Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Idrossipropile) etilediamina Sigma122262-1L
Disco rotante Olympus IXplore SPIN Olympus Scientific Solutions
Saccarosio per la biologia molecolareSigmaS0389-1KG 
Triton X-100 Grado di Laboratorio di BioqualitàEuromedex2000-A
Tripsina/EDTA (10 volte)PAN BiotechP10-025100
Preadolescente-20Euromedex//
UreaSigmaU-5128
Celle β-TC6ATCCCRL-11506

Riferimenti

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