Articolo metodologico

Identificazione delle specie di Mycobacterium mediante il metodo del chip DNA Microarray

DOI:

10.3791/68234

⸱

24 giugno 2025

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un metodo di chip di microarray di DNA per identificare le specie di Mycobacterium , che migliorerà l'accuratezza diagnostica e l'efficienza delle malattie correlate per uso clinico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta un metodo di chip di microarray di DNA progettato per l'identificazione accurata delle specie di Mycobacterium . Sfruttando i principi di amplificazione e ibridazione della PCR asimmetrica, questo metodo prende di mira 17 micobatteri comuni, compresi quelli del complesso Mycobacterium tuberculosis e vari micobatteri non tubercolari. È applicabile a un'ampia gamma di campioni clinici come espettorato, pus, liquido di lavaggio broncoalveolare, liquido cerebrospinale e liquido di puntura da pazienti con sospetto di malattie micobatteriche. Il test prevede l'amplificazione di sequenze target nel genoma di Mycobacterium attraverso la PCR asimmetrica, seguita dall'ibridazione con le sonde sul chip microarray. L'esclusiva disposizione delle sonde (ripetuta 5 volte in un microarray di 12 righe x 10 colonne) e l'uso di sonde di controllo ne migliorano l'affidabilità. Gli studi clinici con 1.724 campioni hanno dimostrato prestazioni elevate. Il metodo ha raggiunto il 100% di specificità clinica, sensibilità e concordanza complessiva rispetto ai risultati del sequenziamento, ad eccezione di due rari campioni di micobatteri non tubercolari oltre il suo ambito di rilevamento. Questo metodo di chip DNA microarray offre un miglioramento significativo rispetto alle tecniche diagnostiche tradizionali, riducendo i tempi di diagnosi e fornendo una rilevazione più completa, avendo così un grande potenziale nella diagnosi e nella gestione delle malattie micobatteriche.

Introduzione

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Il micobatterio, un genere di batteri, comprende un gruppo eterogeneo di organismi con implicazioni significative per la salute umana e animale. Il Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi (TBC), è stato a lungo un flagello per la salute globale. Nonostante decenni di sforzi nella prevenzione e nel trattamento, la tubercolosi rimane una grave minaccia per la salute pubblica, responsabile di un numero impressionante di decessi annuali e di nuoveinfezioni in tutto il mondo1,2. Anche i micobatteri non tubercolari (NTM) sono sempre più riconosciuti come patogeni importanti, soprattutto in specifiche popolazioni di pazienti e in contesti ambientali.

L'identificazione accurata delle specie di Mycobacterium è la pietra angolare di un'efficace gestione della malattia 3,4. I metodi diagnostici tradizionali hanno dei limiti intrinseci. Le tecniche basate sulla cultura, su cui storicamente si è fatto affidamento, sono notoriamente dispendiose in termini di tempo. Il processo di isolamento e coltura dei micobatteri può richiedere settimane o mesi, durante i quali i pazienti possono sperimentare la progressione della malattia e la potenziale trasmissione ad altri. Inoltre, alcune specie di micobatteri sono estremamente difficili da coltivare, portando a risultati falsi negativi e a un trattamento ritardato o errato 5,6.

La colorazione acido-resistente, un altro metodo comunemente usato, può identificare i micobatteri in base alle loro proprietà uniche della parete cellulare che resistono alla decolorazione. Tuttavia, manca della specificità per distinguere tra diverse specie di Mycobacterium, fornendo solo un'indicazione generale della presenza di micobatteri7. Metodi molecolari come la reazione a catena della polimerasi (PCR) sono emersi come alternative per superare alcuni di questi inconvenienti. La PCR è in grado di rilevare il DNA micobatterico più rapidamente rispetto ai metodi di coltura, consentendo una diagnosi più rapida. Tuttavia, i test PCR convenzionali in genere mirano a un numero limitato di geni e potrebbero non offrire un'identificazione completa delle specie, soprattutto quando si trattadi specie di Mycobacterium 5 strettamente correlate.

La tecnologia dei microarray di DNA ha rivoluzionato i campi della microbiologia e della diagnostica. Offre la capacità di analizzare contemporaneamente più bersagli genetici, fornendo una visione più completa e dettagliata della popolazione microbica 8,9. Recenti ricerche in questo settore hanno ulteriormente messo in luce il potenziale e l'importanza delle tecniche molecolari avanzate per l'identificazione dei Mycobacterium. Ad esempio, uno studio di Wang et al.10 ha dimostrato la maggiore sensibilità e specificità di un chip di microarray di DNA modificato nel rilevare rare specie di Mycobacterium in un contesto clinico. I loro risultati hanno sottolineato il valore dell'ottimizzazione continua della tecnologia dei microarray. Un altro studio di Wang e colleghi11si è concentrato sull'integrazione dei dati di microarray di DNA con gli esiti clinici nei pazienti con TBC. I risultati hanno fornito informazioni sul valore prognostico di un'accurata identificazione delle specie di Mycobacterium e sul potenziale della medicina personalizzata.

Principio di prova
Questo kit utilizza la tecnologia dei chip DNA microarray, combinata con l'amplificazione e i principi di ibridazione della reazione a catena della polimerasi asimmetrica (PCR), per l'identificazione delle specie di Mycobacterium . Il kit include un chip di identificazione delle specie Mycobacterium e reagenti di amplificazione PCR asimmetrica. Il chip è fissato con sonde specie-specifiche per il rilevamento e l'identificazione delle specie di Mycobacterium . Gli obiettivi di rilevamento includono 17 specie o gruppi clinicamente comuni, come il complesso Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae e Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum e Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai e Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi e Mycobacterium smegmatis.

Il rilevamento di queste 17 specie di Mycobacterium è fondamentale per una diagnosi clinica accurata e una gestione personalizzata del paziente. Il complesso Mycobacterium tuberculosis (MTBC) è prioritario a causa del suo ruolo nella tubercolosi, che richiede l'isolamento immediato e la terapia multifarmaco per frenare la trasmissione e affrontare la resistenza ai farmaci. Le specie all'interno del complesso Mycobacterium avium-intracellulare (MAC), come M. avium e M. intracellulare, colpiscono prevalentemente individui immunocompromessi (ad esempio, HIV/AIDS) o quelli con malattia polmonare cronica, che richiedono regimi prolungati a base di macrolidi. I micobatteri a crescita rapida (RGM) come M. abscessus e M. fortuitum sono noti per la resistenza agli antibiotici e spesso causano gravi infezioni della pelle, dei tessuti molli o polmonari, richiedendo combinazioni aggressive di chirurgia e antibiotici mirati (ad esempio, amikacina, macrolidi). Le specie ambientali come M. gordonae o M. smegmatis sono contaminanti frequenti, ma possono causare infezioni opportunistiche in contesti specifici, richiedendo un'attenta correlazione clinica per evitare trattamenti non necessari. Agenti patogeni come M. marinum (associato all'esposizione acquatica) e M. ulcerans (che causa l'ulcera di Buruli) hanno nicchie epidemiologiche distinte, che guidano le valutazioni della storia di esposizione. Specie rare ma clinicamente rilevanti (ad esempio, M. szulgai, M. malmoense) imitano la tubercolosi e richiedono regimi specie-specifici. L'identificazione accurata è fondamentale, poiché la durata del trattamento, la selezione del farmaco (ad esempio, la sensibilità alla rifampicina in M. kansasii rispetto alla resistenza intrinseca negli NTM) e la prognosi variano drasticamente. La diagnostica molecolare e i test di sensibilità antimicrobica sono essenziali per ottimizzare i risultati, in particolare nelle popolazioni immunocompromesse o nelle infezioni complesse.

In primo luogo, le sequenze bersaglio nel genoma di Mycobacterium vengono amplificate attraverso la PCR asimmetrica. Quindi, i prodotti amplificati vengono ibridati con le sonde sul chip. Se il micobatterio bersaglio è presente nel campione, i prodotti amplificati si legheranno specificamente alle sonde corrispondenti sul chip. Infine, scansionando i segnali di ibridazione sul chip, è possibile determinare le specie di Mycobacterium nel campione.

Utilizzando la tecnologia di micro-arraying del chip genetico, sul substrato vengono fissate sonde specifiche per il rilevamento dei suddetti geni e varie sonde di controllo. Ogni sonda di rilevamento e di controllo viene ripetuta 5 volte, formando un microarray di 12 righe x 10 colonne. La disposizione della sonda è mostrata nella Figura 1. Ogni chip contiene quattro microarray identici e ogni microarray può rilevare un campione.

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Protocollo

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Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Quanzhou First Hospital Affiliated al Fujian Medical University (Approvazione n. 2024-K035). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti prima della raccolta dei campioni clinici. I pazienti sono stati informati sullo scopo dello studio, sulle procedure coinvolte e sul loro diritto di recedere in qualsiasi momento senza compromettere le loro cure mediche.

1. Requisiti del campione

NOTA: Quando si raccolgono campioni da pazienti con tubercolosi clinicamente sospetta e malattie da micobatteri non tubercolari (NTM) per i test con questo kit, attenersi alla seguente procedura:

  1. Raccogliere campioni come espettorato, pus o secrezioni, liquido di lavaggio broncoalveolare, liquido di puntura (incluso liquido cerebrospinale, liquido pleurico e peritoneale, liquido pericardico, liquido articolare e bile) e urina dai pazienti.
    1. Per i campioni di espettorato:
      1. Istruire il paziente a sciacquare la bocca con acqua pulita al mattino e quindi a tossire l'espettorato profondo in un contenitore sterile per la conservazione dei campioni, sigillarlo e inviarlo per il test.
      2. Aggiungere 1-2 volte il volume di NaOH al 4%, agitare e mescolare uniformemente.
      3. Dopo 15-20 minuti, aggiungere un volume uguale di tampone fosfato a pH 6,8 e mescolare uniformemente.
      4. A temperatura ambiente, centrifugare a 2.000 × g per 15 minuti ed eliminare il surnatante. Aggiungere 1 mL di NaCl allo 0,9% tramite una pipetta e mescolare accuratamente; Utilizzare per il rilevamento.
    2. Per campioni di pus o secrezioni:
      1. Sciacquare la superficie con soluzione fisiologica sterile. Raccogli il pus o la secrezione con un tampone sterile, sigillalo e invialo per il test.
      2. Aggiungere 3 volte il volume di NaOH al 4% e agitare accuratamente per mescolare bene.
      3. Lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 20 minuti (agitarlo manualmente 2 volte durante questo periodo), centrifugare a 2.000 × g a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di NaCl allo 0,9% tramite una pipetta e mescolare uniformemente; Utilizzare per il rilevamento.
    3. Per il liquido di lavaggio broncoalveolare:
      1. Iniettare 10-20 mL di soluzione fisiologica attraverso una provetta protetta per il lavaggio broncoalveolare (PBAL).
      2. Raccogliere il campione in un flacone sterile mediante aspirazione a pressione negativa e inviarlo per il test.
    4. Per il liquido cerebrospinale:
      1. Raccogliere almeno 2 mL di campione utilizzando una tecnica asettica.
      2. Centrifugare a 2.000 × g per 15 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% tramite una pipetta, mescolare accuratamente e utilizzare per il test.
    5. Per i campioni di urina:
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la prima quantità completa di urina al mattino o nelle urine centrali e notturne. L'urina può essere raccolta anche mediante cateterismo.
      1. Raccogliere il campione in un contenitore sterile e lasciare riposare il campione di urina raccolto per 4-5 ore.
      2. Centrifugare a 2.000 × g per 15 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% tramite una pipetta, mescolare accuratamente e utilizzare per il test.
  2. Conservazione dei campioni
    NOTA: I campioni su terreno solido non devono essere conservati congelati, poiché il congelamento può influire sulle operazioni successive.
    1. Conservare i campioni esistenti nel mezzo liquido a -70 °C per non più di 5 anni.
    2. Conservare tutti i campioni a 2-8 °C per non più di 2 mesi.
  3. Trasporto dei campioni
    1. Quando si trasportano i campioni isolati di prova, assicurarsi di utilizzare un contenitore chiuso che soddisfi i requisiti di biosicurezza nelle condizioni consentite dalle normative.

2. Preparazione dell'esperimento

  1. Preparazione di soluzioni per il lavaggio dei trucioli
    NOTA: Preparare la soluzione di lavaggio dei trucioli I e la soluzione di lavaggio dei trucioli II in base al numero di trucioli. Il volume deve essere tale che i trucioli possano essere completamente immersi durante il lavaggio. Mescolatele in modo omogeneo ed equilibratele a temperatura ambiente (10-30 °C). La concentrazione finale di SSC è 2x e la concentrazione finale di SDS è 0,2%.
    1. Per preparare la soluzione di lavaggio dei trucioli I, mescolare 20 SSC, acqua distillata (o acqua purificata) e 10% di SDS nel rapporto di 10:88:2 in sequenza per preparare la soluzione di lavaggio dei trucioli I. Ad esempio, quando si prepara un volume totale di 600 ml, misurare prima 60 ml di 20x SSC e 528 ml di acqua distillata (o acqua purificata) e metterli in un becher da 1 litro e mescolare uniformemente con un'asta per mescolare. Quindi, aggiungere 12 ml di SDS al 10% e mescolare di nuovo in modo uniforme.
    2. Per preparare la soluzione di lavaggio dei trucioli II: la concentrazione finale di SSC è 0,2x. Miscelare 20x SSC e acqua distillata (o acqua purificata) in un rapporto di 1:99 per ottenere la soluzione di lavaggio dei trucioli II. Prendendo come esempio la preparazione di un volume totale di 600 mL, misurare 6 mL di 20x SSC e 594 mL di acqua distillata (o acqua purificata) e metterli in un becher da 1 L e mescolare uniformemente.
      NOTA: Se la soluzione SDS al 10% sviluppa precipitati di flocculante bianco, riscaldarla a 50 °C, mescolare accuratamente e quindi preparare il tampone di lavaggio per microarray. Se il Washing Buffer I sviluppa precipitati di flocculante bianco, riscaldarlo a 50°C, mescolare accuratamente, equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  2. Preparare 350 ml di miscela di acqua e ghiaccio.
  3. Prepara l'acqua distillata (o acqua purificata).

3. Preparazione degli strumenti e dei materiali

  1. Selezione e configurazione dello strumento
    1. Identificare e preparare lo scanner di chip per microarray, assicurandosi che sia calibrato e pronto per l'uso.
    2. Impostare lo strumento di estrazione dell'acido nucleico, verificandone le funzioni e caricando i reagenti necessari.
    3. Posizionare la scatola di ibridazione della scatola di ibridazione del chip del microarray genetico nella posizione appropriata e confermare le sue condizioni di funzionamento adeguate.
  2. Preparazione degli strumenti di pipettaggio
    1. Raccogli micropipette con specifiche di 0,1-10 μL, 2-20 μL e 20-200 μL, insieme ai corrispondenti puntali per pipette puliti e sterili. Assicurarsi che le micropipette siano calibrate accuratamente e che i puntali siano inseriti correttamente.
  3. Predisposizione delle apparecchiature ausiliarie
    1. Preparare un bagnomaria a temperatura costante e impostarlo alla temperatura desiderata (50 °C).
    2. Posizionare la microcentrifuga in grado di centrifugare provette da centrifuga da 1,5 mL e controllarne il bilanciamento e le impostazioni di velocità.
    3. Organizzare provette da centrifuga pulite e sterili (200 μl e 1,5 mL) e strisce a otto pozzetti (200 μl) pulite e sterili opzionali sui rack delle provette da centrifuga.
  4. Disponibilità delle apparecchiature per la manipolazione dei campioni
    1. Posizionare un agitatore a temperatura costante in una posizione comoda e impostare i parametri di agitazione appropriati.
    2. Metti da parte due contenitori per lavare le patatine e assicurati che siano puliti e asciutti.
    3. Disporre le griglie per vetrini e una centrifuga e tenere a portata di mano un contenitore per centrifugare ed essiccare le patatine.
  5. Preparazione dell'amplificatore PCR
    1. Accendere l'amplificatore PCR e programmarlo secondo il protocollo sperimentale, assicurandosi che sia pronto per eseguire reazioni di amplificazione.

4. Estrazione dell'acido nucleico

NOTA: Eseguire l'operazione nell'area di preparazione del campione e seguire questi passaggi:

  1. Preparazione
    1. Aggiungere 80 μL di soluzione di estrazione dell'acido nucleico nella provetta di estrazione dell'acido nucleico e aggiungere 1 mL di NaCl allo 0,9%.
  2. Raccolta di campioni isolati
    1. Per avviare la raccolta dei campioni, esaminare la fonte dei campioni, indipendentemente dal fatto che provengano da un mezzo solido o da un mezzo liquido.
    2. Per raccogliere campioni di terreno solido, utilizzare un anello di inoculazione sterile per prelevare una colonia visibile dal mezzo solido appropriato. Se i batteri sono cresciuti fino a coprire l'intero terreno, scegli una quantità corrispondente di prato batterico. Posizionarlo con cura nella provetta di estrazione dell'acido nucleico contenente la soluzione di estrazione dell'acido nucleico, facendo attenzione a evitare il più possibile di raccogliere il mezzo solido.
    3. Per i campioni di terreno liquido, aspirare 10-20 μl della sospensione batterica con una torbidità uguale o superiore a 1 standard McFarland. Iniettarlo nella provetta di estrazione dell'acido nucleico contenente la soluzione di estrazione dell'acido nucleico.
      NOTA: Dopo la raccolta del campione, sia da mezzo solido che liquido, i campioni sono pronti per la successiva operazione di estrazione dell'acido nucleico.
  3. Estrazione con acidi nucleici
    1. Dopo aver aggiunto i campioni pretrattati o isolati del passaggio 1.1 sopra menzionato, utilizzare lo strumento di estrazione rapida degli acidi nucleici per estrarre gli acidi nucleici. Porre gli acidi nucleici estratti a -20 °C per la conservazione temporanea.
      NOTA: Come indicatore dell'efficienza di estrazione, l'estrattore automatico può estrarre campioni con una carica di acido nucleico virale superiore a 100 copie/mL. Il tempo di conservazione temporanea non deve superare i 2 mesi.

5. Amplificazione PCR

  1. Preparazione del sistema di reazione PCR
    1. Nell'area di stoccaggio e preparazione dei reagenti, preparare provette da centrifuga da 200 μl o strisce a otto pozzetti in base al numero di campioni da testare e contrassegnare in anticipo i numeri dei campioni. Estrarre i reagenti di amplificazione PCR dal kit, lasciarli scongelare e sciogliere naturalmente, agitare delicatamente e mescolare in modo uniforme, quindi centrifugare rapidamente per far sì che i reagenti si raccolgano sul fondo delle provette.
    2. In base al numero di campioni, aliquotare i reagenti di amplificazione PCR in provette da centrifuga da 200 μl o strip a otto pozzetti a un volume di 18 μl per provetta. Chiudere ermeticamente i tappi delle provette e quindi trasferirli nell'area di preparazione della miscela di reazione di amplificazione e amplificazione.
    3. Aggiungere 2 μL di DNA stampo (il DNA del campione da analizzare (cioè il surnatante nella provetta di estrazione dell'acido nucleico), prodotti di controllo positivo o prodotti di controllo negativo) nell'area di preparazione del campione. Assicurarsi che il volume totale di ciascun sistema di reazione PCR raggiunga i 20 μL.
      NOTA: Utilizzare prodotti a controllo positivo e prodotti a controllo negativo ogni volta durante l'amplificazione. Il prodotto a controllo positivo può essere utilizzato per il controllo di qualità nei processi di amplificazione e ibridazione PCR e il prodotto a controllo negativo può essere utilizzato per monitorare l'ambiente e il processo operativo.
  2. Amplificazione
    1. Posizionare le provette da centrifuga o le strisce a otto pozzetti contenenti i reagenti nello strumento di amplificazione PCR. Assicurarsi che lo strumento sia preriscaldato alla temperatura richiesta. Condurre la reazione di amplificazione della PCR secondo il seguente programma di cicli termici: denaturazione iniziale a 94 °C per 600 s (1 ciclo); 35 cicli di denaturazione a 94 °C per 30 s, ricottura a 60 °C per 30 s ed estensione a 72 °C per 40 s; un'estensione finale a 72°C per 420 s (1 ciclo); mantenere a 4 °C indefinitamente (1 ciclo).

6. Ibridazione dei chip

NOTA: Prima che la reazione di amplificazione PCR termi, eseguire le seguenti operazioni:

  1. Impostare la temperatura del bagnomaria a temperatura costante a 50 °C e preriscaldarlo.
  2. Preparazione delle patatine
    1. Aggiungere 200 μL di acqua distillata (o acqua purificata, come mostrato nella Figura 2A) sul fondo della scatola di ibridazione del chip del microarray genetico. Posizionare la staffa tra le due colonne di posizionamento all'interno della scatola.
    2. Posizionare con cura il chip con il lato anteriore rivolto verso l'alto sulla staffa e coprire il chip con il vetrino coprioggetti con le quattro sporgenze rivolte verso il basso (come mostrato nella Figura 2B).
      NOTA: Assicurarsi che la direzione di posizionamento corretta del vetrino coprioggetto sia in modo che la sua estremità sia allineata con l'etichetta all'estremità del chip.
  3. Preparazione, denaturazione e raffreddamento della miscela di reazione di ibridazione
    1. Preparare provette da centrifuga da 200 μl o strisce da otto pozzetti in base al numero di campioni ed etichettarle correttamente.
    2. Estrarre il tampone di ibridazione dal kit e riscaldarlo a 50 °C fino a quando non sarà completamente sciolto. Dopo un'accurata miscelazione, centrifugarlo rapidamente in una microcentrifuga. Aliquotare 9 μl del tampone di ibridazione in ciascuna provetta da centrifuga da 200 μl preparata o striscia a otto pozzetti. Quindi, aggiungere 6 μl del prodotto PCR corrispondente a ciascuna provetta, ottenendo un volume totale di 15 μl per miscela di reazione di ibridazione.
    3. Riscaldare la miscela di reazione di ibridazione (compreso il tampone di ibridazione e il prodotto della PCR) a 95 °C (in uno strumento PCR o in un bagno d'acqua) e denaturarla per 5 minuti. Estrarre la miscela di reazione di ibridazione che ha subito il trattamento di denaturazione nella fase precedente e immergerla immediatamente in una miscela di acqua e ghiaccio per 3 minuti.
  4. Reazione di ibridazione
    1. Estrarre la miscela di reazione di ibridazione dal bagno di ghiaccio, pipettarla su e giù 2 volte con una micropipetta per mescolarla uniformemente. Dopo che il precipitato di flocculante bianco (se presente) è scomparso, aggiungere 13,5 μl della miscela di reazione di ibridazione attraverso il foro di caricamento del vetrino coprioggetti (come mostrato nella Figura 2C), coprire rapidamente la scatola di ibridazione e sigillarla (come mostrato nella Figura 2D). Registrare il numero del chip, la posizione del microarray e il numero di campione corrispondente.
      NOTA: È possibile aggiungere un solo campione a ciascun microarray.
    2. Posizionare immediatamente le scatole di ibridazione sigillate orizzontalmente nel bagno d'acqua a temperatura costante che è stato preriscaldato a 50 °C. Avvia il timer per 120 minuti dopo che tutte le scatole di ibridazione sono state inserite.
      NOTA: Evitare di introdurre bolle d'aria durante il processo di caricamento. In tutte le fasi, dall'inizio del caricamento fino all'essiccazione dei chip, evitare che il liquido sui microarray di chip sia esposto direttamente all'aria per lungo tempo per evitare che lo sfondo del chip diventi troppo alto a causa dell'essiccazione e interferisca con l'interpretazione del risultato.
  5. Lavaggio e asciugatura delle patatine
    1. Al termine della reazione di ibridazione, estrarre le scatole di ibridazione orizzontalmente, smontarle ed estrarre i trucioli per il lavaggio. Posizionare immediatamente le patatine sulla griglia per vetrini nel contenitore (ad esempio un bicchiere) riempito con la soluzione per il lavaggio dei trucioli I che è stata bilanciata a temperatura ambiente (10-30 °C). Lavateli ad una velocità di 80-100 giri/min su agitatore a temperatura costante per 3 min a temperatura ambiente.
    2. Lavare le patatine con Chip Washing Solution II bilanciato a temperatura ambiente a una velocità di 80-100 giri/min su agitatore a temperatura costante per 3 minuti a temperatura ambiente.
    3. Mettere le patatine in una centrifuga e centrifugare a 100 × g a temperatura ambiente per 5 minuti. Scansionali dopo l'asciugatura.
      NOTA: Non lasciare che i trucioli si scontrino o sfreghino l'uno contro l'altro.

7. Scansione del chip e interpretazione dei risultati

NOTA: Utilizzare lo scanner di chip microarray e il software corrispondente per leggere i segnali e interpretare i risultati. Vedere anche la Tabella 1 per risultati anomali e risoluzione dei problemi. Seguire questi passaggi per eseguire l'operazione (fare riferimento ai manuali dell'utente dello scanner e del software).

  1. Accendere lo scanner e il software corrispondente, quindi fare clic sul pulsante Controllo laser per lasciarlo preriscaldare per 10 minuti.
  2. Immettere vari tipi di informazioni relative ai campioni, ad esempio il numero di campione.
  3. Dopo che lo scanner ha terminato il preriscaldamento, fare clic sul pulsante Espelli e posizionare il chip in modo stabile sul piccolo pezzo della staffa. Spingere delicatamente e orizzontalmente il chip nell'apertura dello scomparto dello scanner e fare clic sul pulsante Carica .
  4. Inserire il numero del chip, fare clic per selezionare l'area di rilevamento (microarray 1-4), quindi fare clic su Seleziona campione per scegliere i campioni corrispondenti per ciascun microarray. Quindi, fare clic sul pulsante Avvia rilevamento per eseguire la scansione del chip. I risultati della scansione verranno visualizzati sullo schermo e salvati automaticamente.
  5. Dopo aver scansionato un chip, ripetere i passaggi 7.3 e 7.4 per eseguire la scansione del chip successivo. Seguire questa procedura fino a quando tutti i chip non sono stati scansionati.
  6. Utilizzare la pagina Query dati per eseguire query di dati e operazioni di stampa.
  7. Dopo aver completato tutte le operazioni, spegnere prima il laser, quindi uscire dal software e infine spegnere lo scanner.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Risultati positivi
Per le sonde del genere Mycobacterium (controllo interno, IC) e Mycobacterium tuberculosis, i loro valori di risultato positivi sono determinati con il metodo Receiver Operating Characteristic (ROC). Per le sonde utilizzate per rilevare gli altri 16 NTM, i valori dei risultati positivi sono determinati con il metodo percentile.

Controllo di qualità sperimentale
Il risultato della rilevazione del prodotto di controllo ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il metodo del chip DNA microarray introdotto in questo articolo è in grado di rilevare direttamente gli acidi nucleici in campioni clinici (tra cui espettorato, pus, liquido di lavaggio broncoalveolare, liquido cerebrospinale e liquido di puntura) di pazienti con sospetto di tubercolosi e micobatteriosi non tubercolare e può ridurre significativamente il tempo per la diagnosi confermata. Il metodo del chip DNA microarray presentato in questo studio rappresenta un progresso significativo ...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto della Fondazione provinciale per le scienze naturali del Fujian (2024J011521) e dal Progetto del piano scientifico e tecnologico di Quanzhou (2024NY006).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9% (NaCl)FuZhou HAIWANGFUYAOH35020289
Apparecchi di amplificazione Applied BiosystemsThermo Fisher ScientificoTermociclatore a 96 pozzetti Veriti
CapitalBio LuxScan10K/BCapitale BioLuxScan10K/B
CapitalBio SlideWasher 24 Capitale BioRondella scorrevole 24 
  Centrifuga Eppendorf5424RVelocità massima 15000 min-1
Buffer di ibridazione
Chip e coperchio del microarray genetico HybSet
Kit di identificazione delle specie di MycobacteriumCapitale Bio301030
Controlli negativi, controlli positivi
Estrattore di acidi nucleiciTIANLONGGeneRotex 96
Reagente di amplificazione per PCR
tampone fosfato pH 6,8Bio-tecnologia di ShangHai yuanyeCodice: R20029-10
pipettatori e punteTermo Scientifico0,1 - 10 μ L, 2 - 20 μ L, e 20 - 200 μ L, 100-1000 μ L
qEx-DNA/RNA Kit di estrazione o purificazione dell'acido nucleicoTIANLONGqEx-DNA/RNA
SDSCapitale Bio441060
Idrossido di sodio (NaOH)XILONGS  ScientificoXK13-011-00027
SSCCapitale Bio441050
bagnomaria termostaticoSURUIHH-W600

Riferimenti

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