Questo protocollo descrive la perfusione a macchina normotermica ex vivo di un rene di ratto per il successivo trapianto in un ratto ricevente.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
* These authors contributed equally
Questo protocollo descrive la perfusione a macchina normotermica ex vivo di un rene di ratto per il successivo trapianto in un ratto ricevente.
La tecnica di perfusione con macchine normotermiche (NMP) è una promettente tecnologia di conservazione degli organi che fornisce una piattaforma di valutazione e intervento degli organi ex-vivo . A causa della limitata disponibilità di organi scartati clinicamente e dell'alto costo dei modelli animali di grandi dimensioni, il modello NMP per piccoli animali è stato considerato un'alternativa promettente per la ricerca. Qui abbiamo stabilito un protocollo standardizzato di NMP e trapianto per i reni dei ratti, fornendo una guida passo dopo passo per l'approvvigionamento renale, la conservazione della NMP e il trapianto. I dettagli e i parametri NMP venivano registrati. Tutti i riceventi di ratti sono sopravvissuti con successo a questa procedura chirurgica e alla tecnica NMP, e la funzione renale dell'innesto è rimasta normale dopo il trapianto. Il tasso di sopravvivenza e l'istologia dell'innesto della NMP non hanno mostrato differenze significative rispetto a quelle della conservazione statica a freddo (SCS) al settimo giorno postoperatorio. Questa nuova strategia NMP nei modelli animali di piccole dimensioni potrebbe essere utile a studi di base relativi alla conservazione, valutazione e intervento degli organi in futuro. Inoltre, questo modello offre una piattaforma conveniente e scalabile per test preclinici di terapie, tecniche di imaging e interventi correlati alla perfusione.
La malattia renale in fase terminale (ESKD) rappresenta un onere in rapida crescita per la salute e i sistemi sanitari in tuttoil mondo 1,2,3. Sebbene la dialisi sia la terapia predominante per l'ESKD nella maggior parte dei paesi, il trapianto renale rimane il trattamento di riferimento ideale, offrendo una migliore qualità della vita e migliorando la sopravvivenza e la prognosi rispetto alladialisi 1,3,4,5. Tuttavia, la carenza di reni donatori limita la diffusione ulteriore del trapianto renale e porta all'aumento dell'uso di innesti donati dopo la morte circolatoria (DCD) o prelevati da donatori a criterio esteso (ECD)6,7,8.
La conservazione statica a freddo (SCS) è attualmente il metodo standard per la conservazione degli organi, ma l'ischemia fredda prolungata aumenta il rischio di ritardo nella funzione dell'innesto (DGF) e provoca rigetto acuto e cronico, specialmente negli innesti DCDo ECD 9,10,11,12. Pertanto, è fondamentale cercare un metodo di conservazione degli organi che minimizzi i danni da ischemia da freddo e migliori la prognosi dell'innesto. La perfusione normothermica delle macchine (NMP) è una tecnica emergente per la conservazione degli organi che può imitare condizioni fisiologiche facendo circolare il perfuso riscaldato e ossigenato attraverso l'organo 12,13,14,15. Questo può anche mantenere uno stato metabolico quasi fisiologico, rendendo possibile valutare la vitalità degli organi, migliorare la lesione ischemica da freddo e persino riparare i danni agliorgani 16,17,18,19,20. Rispetto al SCS, la NMP comporta una percentuale ridotta di DGF e una migliore prognosi del trapianto sia nei DCD che negli innestiECD 17, 21, 22.
I reni suini e i reni clinici umani scartati sono attualmente utilizzati nella ricerca di base sullaNMP 20,23,24. Tuttavia, va notato che i modelli suini affrontano limitazioni significative, tra cui alti costi di allevamento, elevati requisiti di dosaggio di farmaci e scarsità di reagenti specifici perspecie 25. Inoltre, l'uso di organi umani scartati comporta una disponibilità limitata e processi di revisione etica complessi. Questi vincoli ne limitano collettivamente la diffusione nella ricerca di base. Al contrario, i modelli animali di piccolo taglio (in particolare quelli di ratti), sebbene attualmente sottorappresentati nella letteratura, offrono costi operativi sostanzialmente inferiori e abbondanti reagenti commercialmente disponibili. Questi vantaggi li posizionano come piattaforme promettenti per l'avanzamento degli studifondamentali 26,27,28. Sulla base di questa logica, abbiamo sviluppato e validato un modello NMP e trapianto basato su ratti in questo manoscritto.
Questo articolo mostra un protocollo dettagliato per stabilire la NMP e il trapianto nei reni dei ratti. Include la preparazione del sistema di perfusione e del perfuso, oltre a una descrizione completa della procedura chirurgica sia per i reni del donatore che per quelli riceventi. Questo modello dimostra il potenziale di essere un modello animale ideale per studiare il trapianto renale, in particolare come piattaforma per l'elaborazione e il monitoraggio dell'efficacia dei farmaci rilevanti 19,29,30,31.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali del Centro per Animali da Laboratorio dell'Università Sun Yat-sen (n. SYSU-IACUC-2023-000717). Tutti gli animali in questo studio erano maschi di ratti Sprague–Dawley di età compresa tra 7 e 8 settimane (250–300 g), senza patogeno specifico (SPF) e soddisfacevano i requisiti standard per la sicurezza degli animali da laboratorio (vedi l'elenco di esclusione dei patogeni nella Tabella Supplementare S1). Venivano nutriti con una dieta standard e ospitati in una stanza priva di patogeni presso il Laboratory Animal Center dell'Università Sun Yat-sen.
Sterilizza tutti gli strumenti chirurgici tramite autoclaving (121 °C, 30 min) prima degli esperimenti. Utilizzare esclusivamente consumabili sterili monouso durante tutte le procedure e rispettare rigorosamente i protocolli asettici durante tutte le operazioni.
1. Preparazione del perfuso base
2. Procuramento renale
NOTA: Usa 8-0 Suture chirurgiche per tutte le legature.
3. Preparazione del sistema NMP e perfusione


4. Trapianto di rene di ratto
NOTA: Usa 8-0 suture per tutte le legature e le suture 11-0 per l'anastomosi del vaso renale e dell'uretere. Usa le suture 3-0 per eseguire l'anastomosi della pelle e dei muscoli addominali.
5. Somministrazione perioperatoria e rilevamento post-operatorio
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Con il metodo descritto, i reni isolati del ratto possono rimanere validi per la perfusione normothermica ex vivo per almeno 3 ore. Durante la NMP, la resistenza alla perfusione dei reni (Figura 3A, il dataset completo sottostante della Figura 3 e della Figura 4 è disponibile nella Tabella Supplementare S6.) viene mantenuta stabilmente a 5,958 ± 1,106 mmHg/(mL/min), dimostr...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
La NMP può ridurre la durata dell'ischemia dell'innesto e consentire la valutazione e il trattamento della qualità dell'innesto ex vivo 16,17,18,19,20,32,33. Tuttavia, non esiste uno standard uniforme per il NMP del modello ratto. In questo articolo...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (Programma Generale, Grant n. 82470778); la National Natural Science Foundation of China (Progetto della Youth Science Foundation, Grant No. 82201961); la Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia del Guangdong (Programma Generale, Grant No. 2024A1515011447); e il Laboratorio Chiave Provinciale del Guangdong per la Donazione di Organi e l'Immunologia dei Trapianti (Grant No. 2023B1212060020); il Laboratorio Congiunto di Rigenerazione e Ricostruzione dei Reni Sun Yat-sen - ARM University (Grant No. SYSU-50000-20240428-0001).
Gli autori desiderano ringraziare il Laboratory Animal Center dell'Università Sun Yat-sen per aver fornito animali da laboratorio, strutture e strumentazione. La Figura 1 e la Figura 2 sono state preparate usando FigDraw; Graphpad Prism offriva servizi di data graphing, mentre Biossci (Hubei) Biotechnologies Company Limited si occupava di sezionamento con paraffina e colorazione patologica.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alcol (75%) | MUSIYAN | JJ-75-1 | |
| Apparecchiature per la trasfusione del sangue | Foshan Youzhan Tech Co., Ltd | YZDW-15-5 | |
| Albumina Sirica Bovina (BSA) | Aladdin Scientific Corp. | B265991-100g | |
| Filtro cellulare (70 e mu; m) | Corning Life Science (Wujiang) Co., Ltd | 352350 | |
| Tubo centrifuga (1,5 mL) | Corning Life Science (Wujiang) Co., Ltd | MCT-150-C-1 | |
| Tubo centrifuga (15 mL) | Biografia ExCell | CS015-0001 | |
| Pallina di cotone | Henan PiaoAn Group Co., Ltd | Dimensioni ridotte | |
| Cotton fioc | Foshan Shunde Kangzheng Sanitary Material Co., Ltd | KZ3-12 | |
| Creatinina | Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd | S20198-100g | |
| Sutura in nylon con doppio ago circolare (11-0) | Ningbo Medical Needle Co., Ltd | SYZ-11-0 | |
| Scala elettronica | SENSSUN | EHA17 | |
| Distributore di liquidi | Zhiyu Medical | YZ-00-0231 | |
| Garza | ZITTAR | C11001-001 | |
| Cuscina riscaldante | Guangzhou Dewei Biological Technology Co., Ltd | DK0032 | |
| Iniezione di eparina sodica (12500 U, 2 mL) | Chengdu Hepatunn Pharmaceutical Co., Ltd | H51021209 | |
| Termometro a infrarossi | Gastronomia | DL333380 | |
| Siringa per iniezione (1 mL) | Vincitore Medical (Human) Co, Ltd. | ZT-ZS 1ml | |
| Siringa iniezione (10 mL) e nbsp; | Vincitore Medical (Human) Co, Ltd. | ZT-ZS 10ml | |
| Siringa per iniezione (20 mL) | Vincitore Medical (Human) Co, Ltd. | ZT-ZS 20ml | |
| Isoflurano | RWD Life Science Co., LTD | R510-22-10 | |
| i-STAT 1 Analizzatore del sangue | Abbott | 04P75-03 (USA) | |
| Cartuccia i-STAT CG4+ | Abbott | 03P85-25 | |
| Cartuccia i-STAT CHEM8+ | Abbott | 09P31-25 | |
| Tubo di estensione liquida | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD | ZJ983 | |
| Micro-1 Ossigenatore per ratti | Dongguan Kewei Medical Instrument Co-, Ltd | Micro-MO | |
| Micropompa | EDCAPTAIN | SYS-3011 | |
| Filtro a ago (0,22 & mu; m) | Merck millipore | SLGPR33RB | |
| Soluzione per la conservazione degli organi | Gruppo Farmaceutico del Fiume Yangtze | HCA II | |
| Ossigenatore | Owgels | OZ-3-02HWO | |
| Penicillina-Sreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140122 | |
| Pompa peristaltica | Kamoer Fluid Tech (Shanghai) Co., Ltd. | LLS Plus V2 | |
| Tubo della pompa peristaltica | Foshan Youzhan Tech Co., Ltd | LG-1-14 | |
| Piastra di Petri | BKMAM | BKM001 | |
| Sensore di pressione | Edwards Lifesciences Corporation | JIBPT-A-01-EDW | |
| Ricevitore sensore di pressione | Singolarità Medica | CB-202309001 | |
| RPMI 1640 (1x, 500 mL) | Corning Life Science (Wujiang) Co., Ltd | R10-040-CV | |
| Soluzione salina | FARMACIA YXH | A1001346 | |
| Ratti SD | Centro per gli Animali da Laboratorio dell'Università Sun Yat-Sen | NA | |
| Rasoio | Beyotime | FS600 | |
| Sutura in nylon con ago singolo (3-0) | Ningbo Medical Needle Co., Ltd | DJZ-3-0 | |
| Ago circolare singolo Sutura in nylon (8-0) | Ningbo Medical Needle Co., Ltd | DYZ-8-0 | |
| Macchina per anestesia per piccoli animali | RWD Life Science Co., LTD | R500 | |
| Macchina per perfusione multiorgano per piccoli animali | Vita Perfusor Mediche | PU-100 | Includono piatti metallici, bagni d'acqua, pompa di riscaldamento e sensore di temperatura |
| Kit per Chirurgia per Piccoli Animali | Beyotime | FS500 | |
| Soluzione di bicarbonato di sodio (NaHCO3, 5%) | Dongguan Puji Medical Technology Co., Ltd | H20064480 | |
| Foglio chirurgico sterile | Tecnologia HengAo | SKR-BY-DD0001 | |
| Acqua sterile | Biografia di Haiwang | H35021140 | |
| Catetere endovenoso a impugnatura dritta (24 G) | Foshan Youzhan Tech Co., Ltd | 20230816-1 | |
| Microscopio chirurgico | Murzider | MSD203 | |
| Nastro | Minnesota Mining and Manufacturing Co,. Ltd | 1527C-0 | |
| Connettore a T | Foshan Youzhan Tech Co., Ltd | WGST-10 | |
| Ago per catetere intravenoso di tipo Y (24 G) | JIANGXI FENGLIN | YZDW-7-5 | |
| Ago per catetere intravenoso di tipo Y (26 G) | JIANGXI FENGLIN | YZDW-7-6 |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.