Articolo metodologico

Elastomeri magnetoreologici microstrutturati per guidare i cambiamenti nell'allineamento dei cardiomiociti

DOI:

10.3791/68271

⸱

10 giugno 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware, 4Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo una piattaforma di saggi di rigidità dinamica e reversibile fabbricata utilizzando un elastomero siliconico ultra-morbido (polidimetilsilossano, PDMS) con particelle di ferro incorporate. Questo nuovo test è adatto per studiare i cambiamenti fisici emergenti dipendenti dal tempo nei fenotipi cellulari, compresa la guida al contatto. Qui, misuriamo l'allineamento dei cardiomiociti di ratto neonatale dopo l'irrigidimento della matrice utilizzando il magnetismo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I segnali associati al substrato, come quelli meccanici e topografici, influenzano profondamente la risposta cellulare. Tuttavia, gran parte della ricerca di base impiega effetti statici o isolati. La direzione e la scala temporale di questi effetti meccanici sulle risposte cellulari emergenti rimangono in gran parte inesplorate. Gli strumenti per esaminare il modo in cui gli stimoli associati al substrato variabili nel tempo guidano i processi fisiologici e patologici possono sbloccare il livello successivo di intuizione meccanobiologica. Qui, utilizziamo elastomeri magnetoreologici micro-strutturati (MRE) che possono irrigidirsi e ammorbidirsi rapidamente in risposta a un campo magnetico esterno, consentendo un'indagine più rigorosa degli effetti della stimolazione meccanica (rigidità) e guidata dal contatto (topografica) sull'orientamento e l'allineamento dei cardiomiociti del ratto neonatale. Integrando il controllo dinamico della rigidità meccanica che può essere regolato e invertito temporalmente, possiamo testare rigorosamente gli effetti del carico (1) pre-condizionamento in condizioni identiche e (2) modificando acutamente la biomeccanica in vitro per imitare correttamente la fenomenologia clinicamente rilevante, come l'infarto del miocardio. Questo approccio ci permette di studiare l'impatto del carico sulle risposte cellulari in modo più realistico e controllato.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacità del cuore di pompare il sangue in modo efficiente si basa sull'architettura e sulle proprietà meccaniche (rigidità) del suo miocardio, dove l'organizzazione precisa delle cellule e dei tessuti è essenziale per la contrazione coordinata e la funzione generale. Il miocardio è composto principalmente da cardiomiociti (CM), che, negli adulti, mostrano una morfologia allungata, quasi a bastoncello, con sarcomeri (l'unità contrattile dei CM) allineati lungo la lunghezza della cellula. Al contrario, i CM derivati da cellule staminali pluripotenti fetali o indotte (iPSC) differiscono significativamente dai CM adulti. Tendono ad avere una forma più arrotondata, un nucleo unico, una struttura sarcomerica disorganizzata o non allineata e una frequenza di battimento irregolare. La somiglianza strutturale dell'organizzazione in vivo del miocardio consente la sincronia della contrazione e della trasmissione della forza; Questo è fondamentale ed essenziale per ricapitolare il miocardio naturale attraverso un modello in vitro. Per generare CM con caratteristiche strutturali simili al miocardio maturo, studi precedenti hanno dimostrato strategie di successo per migliorare la maturazione, tra cui la manipolazione della rigidità del substrato 1,2, l'applicazione di una deformazione meccanica3, l'utilizzo della guida a contatto 4,5 o l'impiego della stimolazione elettrica 6,7.

È stato a lungo compreso che la rigidità dell'ambiente extracellulare influisce sulle cellule. Esiste una vasta diversità di rigidità in tutto il corpo umano, che va da centinaia di pascal (Pa) nel cervello e fino a decine di gigapascal (GPa) nell'osso 8,9,10. È stato riscontrato che durante lo sviluppo, i tessuti cambiano rigidità e questa alterazione regola la differenziazione e la maturazione a livello cellulare nei fenotipi adulti necessari per la normale funzione 11,12,13,14. I cambiamenti nella rigidità sono stati anche collegati agli stati patologici e alla progressione di specifiche patologie 15,16,17,18. Nello specifico, la rigidità del miocardio cambia con lo sviluppo e la progressione delle malattie; ad esempio, un miocardio sano ha un modulo elastico di ~ 10 kPa in contrasto con un cuore in insufficienza cardiaca, che ha un modulo elastico di 35-70 kPa o più19. Inoltre, numerosi studi in vitro hanno riportato che i cardiomiociti coltivati su un substrato simile alla rigidità del miocardio nativo avevano una migliore organizzazione del sarcomero20, generavano una contrazione ottimale 1,19 e avevano la durata del potenziale d'azione più lunga21.

Inoltre, è diventato più noto che le cellule in vivo sono esposte a una complessa varietà di segnali topografici all'interno del loro microambiente che guidano la forma e la funzione. Questi indizi topografici sono disponibili in varie dimensioni e geometrie, dalla disposizione casuale delle integrine a livello molecolare all'allineamento a livello di micron delle cellule nei tessuti muscolari 22,23. Simile ad altri regolatori meccanici, la topografia è importante per la morfologia cellulare, come la diffusione, l'allungamento, l'allineamento, la motilità, la differenziazione e l'apoptosi 24,25,26. Con l'introduzione di substrati di coltura sintetici, sono stati sviluppati metodi per creare una topografia superficiale controllata per la coltura di cellule e tessuti 27,28,29. Ad esempio, nano e microsolchi micromodellati sono stati utilizzati per fornire una guida di contatto per le cellule di mammifero in modo che le cellule orientino e rimodellino il loro citoscheletro per seguire le strutture topografiche del substrato di coltura.

Qui, introduciamo un metodo di coltura in vitro che integra sia la guida strutturale (segnale di contatto) che quella meccanica (rigidità) utilizzando un substrato di elastomero magnetoreologico modellato (MRE), un materiale sintonizzabile che può essere irrigidito o ammorbidito regolando l'intensità del campo magnetico 17,30,31,32. Posizionando i magneti vicino al substrato di coltura, è possibile aumentare la rigidità, con il grado di irrigidimento modificabile variando la distanza tra il campione e il magnete. Al contrario, la rigidità può essere ridotta rimuovendo completamente il magnete. Questo approccio fornisce un metodo robusto, dinamico e controllabile per replicare le condizioni meccaniche in vivo, mentre il micropatterning di superficie introduce anisotropia, consentendo la creazione di substrati di colture cellulari 2D più biomimetici.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione del timbro PDMS modellato

NOTA: Un timbro PDMS è essenziale per la sua flessibilità, consentendo una facile manipolazione e un contatto preciso durante la preparazione della superficie MRE modellata. La natura flessibile del timbro consente inoltre una rimozione senza sforzo dallo strato MRE PDMS senza danneggiare il modello, garantendo sia un trasferimento accurato del modello che la conservazione della superficie MRE.

  1. Preparare 10 g di 184 PDMS 10:1 (base: agente indurente).
  2. Versare 5 g di 184 PDMS in una piastra Petri da 35 mm e degassare in un essiccatore per ~5-10 minuti, fino a quando tutte le bolle si sono dissipate.
  3. Lasciare indurire parzialmente 184 PDMS in forno a 60 °C per 30 minuti.
  4. Quando rimangono 5 minuti per l'indurimento parziale del 184 PDMS, aggiungere uno strato sottile del 184 PDMS extra al reticolo di diffrazione e degassare nell'essiccatore per ~5 minuti.
  5. Sfornare la pirofila da 35 mm con il PDMS 184 parzialmente indurito.
  6. Capovolgere il reticolo di diffrazione con PDMS sul PDMS 184 parzialmente polimerizzato in un piatto da 35 mm.
    NOTA: Assicurarsi che il reticolo di diffrazione sia rivolto verso il basso nel PDMS 184 parzialmente polimerizzato nel piatto da 35 mm.
  7. Premere leggermente il reticolo di diffrazione fino a quando una piccola quantità di 184 PDMS circonda il reticolo.
  8. Utilizzare il PDMS 184 non polimerizzato rimanente per riempire la piastra che circonda la griglia per assicurarsi che rimanga in posizione durante l'indurimento.
  9. Mettere la pirofila contenente la griglia di diffrazione nel forno impostato a 60 °C per 1,5 h.
  10. Dopo che il 184 PDMS è completamente indurito, rimuovere la piastra da 35 mm con la griglia di diffrazione dal forno.
  11. Incidere intorno alla griglia di diffrazione con un bisturi.
  12. Applicare una piccola quantità di alcol isopropilico (IPA) per penetrare sotto il reticolo di diffrazione.
  13. Estrarre la griglia dal PDMS 184 nella direzione parallela ai modelli.
  14. Rimuovere il PDMS 184 in eccesso, lasciando solo la sezione modellata.
  15. Tagliare il timbro 184 PDMS alla dimensione necessaria.
    NOTA: Questo studio utilizza un timbro di 1 cm × 1 cm per i dispositivi.

2. Rivestimento superficiale del timbro PDMS

NOTA: Un trattamento silano crea un rivestimento superficiale che impedisce l'adesione indesiderata tra gli strati PDMS durante lo stampaggio, garantendo una separazione regolare e preservando la qualità del trasferimento del modello.

  1. Trattamento con silani (metodo preferito)
    1. Posizionare il timbro 184 PDMS fabbricato in un pulitore al plasma O2 con la superficie modellata rivolta verso l'alto. Trattare la superficie PDMS con 45 W di plasma O2 per 30 s.
      NOTA: Una volta rimosso dal pulitore al plasma, posizionare immediatamente un coperchio (o un coperchio) sui timbri per assicurarsi che non si depositino detriti sui timbri puliti.
    2. Posizionare 184 timbri PDMS in un essiccatore in una cappa aspirante.
    3. Strappare il coperchio di una provetta da microcentrifuga.
    4. Posizionare il coperchio della provetta per microcentrifuga accanto ai 184 timbri PDMS nell'essiccatore.
    5. Aggiungere 20 μL di tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano al coperchio della provetta per microcentrifuga.
      ATTENZIONE: Questa sostanza chimica è pericolosa per la salute e quindi deve essere utilizzata solo in una cappa chimica.
    6. Chiudere l'essiccatore e aspirare.
    7. Lasciare che il silano ricopra i timbri da 1 ora a tutta la notte.

3. Preparazione di elastomeri magnetoreologici

NOTA: Per creare MRE regolabili e reversibili, un rapporto preciso tra particelle di ferro carbonilico ed elastomero, combinato con l'applicazione di un campo magnetico, consente la regolazione della rigidità in un intervallo di valori. Variando la frazione di particelle, il modulo dell'elastomero di base e l'intensità del campo magnetico, la rigidità del materiale può essere regolata con precisione per soddisfare requisiti specifici.

  1. Preparazione MRE con intervallo dinamico più morbido (vedere la tabella 1 per esempi di pesi)
    1. Misurare la quantità desiderata di diluente siliconico ed Eco elastomero parte B e mescolare a 2500 giri/min in un miscelatore a velocità per 1 minuto.
    2. Aggiungere l'elastomero ecologico parte A e le particelle di ferro carbonilico alla soluzione e mescolare a 2500 giri/min in un miscelatore a velocità per 1 minuto.
      NOTA: L'ordine di miscelazione è fondamentale per garantire i tempi di polimerizzazione desiderati.
    3. Utilizzando una pipetta di trasferimento con la punta tagliata, aggiungere 5 g di MRE a una nuova piastra di Petri da 35 mm e degassare in un essiccatore per ~5 minuti, quindi lasciare polimerizzare parzialmente in forno a 60 °C per ~10 minuti.
      NOTA: Assicurarsi che il forno e l'essiccatore siano correttamente livellati è essenziale per ottenere un campione piatto, che è fondamentale per la facilità di imaging.
    4. Una volta rimanenti 5 minuti, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere ulteriore MRE non polimerizzato per rivestire la superficie del timbro 184 PDMS. Posizionare il timbro rivestito nell'essiccatore per degassare per 5 minuti.
      NOTA: Fare attenzione a non usare troppo MRE perché se copre i bordi del timbro, renderà più difficile la rimozione del timbro una volta che l'MRE è completamente indurito. Inoltre, assicurati di indicare la direzione del modello in ogni passaggio in modo che quando rimuovi il timbro dall'MRE, possa essere tirato nella direzione parallela ai modelli.
    5. Rimuovi l'MRE dal forno e usa un paio di pinze per spostare con cautela il timbro rivestito. Capovolgerlo a faccia in giù sulla MRE parzialmente polimerizzata e premere leggermente. Rimettere l'MRE e lo stampo patinato in forno a 60 °C per altri 25 minuti.
    6. Una volta completamente indurito, utilizzare un bisturi per incidere l'MRE nella parte inferiore del timbro, perpendicolarmente ai modelli.
    7. Applicare una piccola quantità di IPA sull'area tagliata intorno al timbro.
      NOTA: L'alcool isopropilico dovrebbe penetrare nel taglio e iniziare a muoversi sotto il timbro.
    8. Usando una pinza, estrarre il timbro dall'MRE nella direzione parallela ai modelli.
  2. Range dinamico più rigido Preparazione MRE (vedi tabella per esempi pesi)
    1. Preparare il PDMS 30:1 184.
      NOTA: Prepara di più perché alcuni rimarranno attaccati al contenitore di miscelazione.
    2. Aggiungere la quantità desiderata di 527 PDMS parte A e parte B, quindi particelle di ferro carbonilico e 30:1 184 PDMS in rapporti basati sull'esempio nella tabella.
    3. Mescolare a 2500 giri/min in un mixer a velocità per 1 minuto.
    4. Utilizzando una pipetta di trasferimento con la punta tagliata, aggiungere 5 g di MRE in una nuova capsula di Petri da 35 mm e degassare in un essiccatore per ~5 minuti, quindi lasciare polimerizzare parzialmente in forno a 60 °C per ~40 minuti.
    5. Una volta rimanenti 5 minuti, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere ulteriore MRE non polimerizzato per rivestire la superficie del timbro PDMS. Posizionare il timbro rivestito nell'essiccatore per degassare per 5 minuti.
      NOTA: Fare attenzione a non usare troppo MRE perché se copre i bordi del timbro, renderà più difficile la rimozione del timbro una volta che l'MRE è completamente indurito. Inoltre, assicurati di indicare la direzione del modello in ogni passaggio in modo che quando rimuovi il timbro dall'MRE, possa essere tirato nella direzione parallela ai modelli.
    6. Togliete l'MRE dal forno.
    7. Utilizzare un paio di pinze per spostare con cautela il timbro rivestito, capovolgerlo a faccia in giù sull'MRE parzialmente polimerizzato e premere leggermente.
    8. Mettere in forno a 60 °C per una notte l'MRE con il timbro patinato sul ripiano superiore.
    9. Una volta completamente indurito, utilizzare un bisturi per tagliare l'MRE nella parte inferiore del timbro, perpendicolarmente ai modelli.
    10. Applicare l'alcool isopropilico sull'area tagliata intorno al timbro.
      NOTA: L'alcool isopropilico dovrebbe penetrare nel taglio e iniziare a muoversi sotto il timbro.
    11. Usando una pinza, estrarre il timbro dall'MRE nella direzione parallela ai modelli.
Gamma di rigiditàMaterialiEsempio di peso
Morbida10-80 kPaEco (A+B)11,25 g (A)11,25 g (B)
Diluente siliconico22,5 g
Particelle di ferro45 g
Più rigido60-120 kPa527 PDMS (A+B)18,75 g (A)18,75 g (B)
Particelle di ferro37,5 g
184 PDMS (Base+Cura)14,5 g (Base)0,5 g (Cura)

Tabella 1: Esempi di pesi di tutti i materiali per la fabbricazione di MRE sia più morbidi che più rigidi. I pesi nella tabella si riferiscono a un totale di 90 g di materiale MRE. La preparazione di meno può essere ottenuta mescolando tutti i costituenti negli stessi rapporti dei pesi di esempio nella tabella.

4. Preparazione della coltura cellulare

NOTA: La preparazione delle colture cellulari comporta la selezione della linea cellulare appropriata, la preparazione dei terreni di coltura con i nutrienti e i fattori di crescita necessari e la garanzia di condizioni sterili per prevenire la contaminazione. Le cellule vengono piastrate in recipienti di coltura e incubate in condizioni ottimali (di solito 37 °C con CO2 controllata). Per mantenere una crescita cellulare sana, vengono eseguiti il monitoraggio regolare, i cambi di terreno e il passamento.

  1. Sterilizzare la superficie dell'MRE lavandola con etanolo al 70% 3 volte e lasciare riposare il terzo lavaggio per 20 minuti.
  2. Lavare la superficie MRE 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) aggiungendo un volume sufficiente a coprire completamente il piatto, quindi aspirare tutto il liquido.
  3. Rivestire la superficie dell'MRE con fibronectina (10 μg/mL) in PBS per 1 ora a 37 °C per favorire l'adesione delle cellule al dispositivo.
  4. Lavare la superficie MRE 3 volte con PBS, in modo simile al passaggio 4.1.2.
  5. Seminare i cardiomiociti di ratto neonatale a una densità di 20.000 cellule/cm2.
  6. Aggiungere magneti ai dispositivi temporalmente per irrigidire la matrice durante la coltura cellulare.
    NOTA: Prestare attenzione quando si posizionano dispositivi con magneti nell'incubatrice. I dispositivi devono essere posizionati molto distanti tra loro per garantire che i magneti non interagiscano. Questo studio raccomanda l'uso di incubatrici rivestite in acciaio inossidabile rispetto a quelle rivestite in rame, poiché vi è meno interazione.

5. Colorazione e imaging

  1. Imaging cellulare fisso
    NOTA: L'imaging cellulare fisso prevede diversi passaggi chiave per visualizzare componenti cellulari specifici. Innanzitutto, le cellule vengono fissate per preservarne la struttura. Successivamente, la membrana cellulare viene permeabilizzata per consentire la penetrazione della colorazione, seguita da una fase di blocco per prevenire il legame non specifico di anticorpi o colorazioni in siti non intenzionali, come altre proteine o detriti cellulari. Le cellule vengono quindi colorate con coloranti o anticorpi mirati a molecole specifiche e l'eventuale colorazione in eccesso viene rimossa attraverso il lavaggio. Infine, le cellule colorate vengono visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza per l'analisi delle strutture cellulari.
    1. Lavare una volta con 1x PBS aggiungendo un volume sufficiente a coprire completamente il piatto, quindi aspirare tutto il liquido.
    2. Fissare le cellule utilizzando paraformaldeide al 4% (v/v) per 10 minuti.
    3. Lavare tre volte con 1x PBS (simile al passaggio 5.1.1).
    4. Aggiungere lo 0,1% di Triton X (in 1x PBS) e incubare per 5 minuti per permeabilizzare.
    5. Lavare tre volte con 1x PBS (simile al passaggio 5.1.1).
    6. Aggiungere NH4Cl (50 mM in 1x PBS) e incubare per 15 minuti per estinguere.
    7. Lavare tre volte con 1x PBS (simile al passaggio 5.1.1).
    8. Aggiungere il tampone bloccante (5% BSA in 1x PBS) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
    9. Combinare l'anticorpo primario anti-α-actinina a 1:200 in BSA al 5% (in 1x PBS).
      NOTA: Mescolare accuratamente l'anticorpo.
    10. Aggiungere la soluzione di anticorpi primari al campione.
      NOTA: Aggiungere abbastanza per coprire l'intero campione.
    11. Incubare per una notte a 4 °C.
      NOTA: Prendere in considerazione la possibilità di posizionare il campione sul bilanciere a bassa velocità per aiutare le soluzioni a mescolarsi.
    12. Lavare tre volte con 1x PBS (simile al passaggio 5.1.1).
    13. Diluire l'anticorpo secondario (555 Alexa Fluor goat anti-mouse) in 1x PBS (1:2000).
      NOTA: Gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce (fluorofori). Quando non sono direttamente in uso, assicurarsi che siano coperti e al riparo dalla luce.
    14. Aggiungere la soluzione di anticorpi secondari al campione.
    15. Incubare a RT per 2 ore.
    16. Lavare tre volte con 1x PBS (simile al passaggio 5.1.1).
    17. Aggiungere DAPI (1 μg/mL in acqua deionizzata sterilizzata) e incubare per 5-10 minuti al buio.
    18. Immagini delle cellule con un microscopio verticale con una lente a immersione 20x.
    19. Scatta 50 immagini per dispositivo.
    20. Elaborate le immagini utilizzando un plug-in ImageJ chiamato Directionality.
      NOTA: Opzioni di direzionalità: Questo studio ha utilizzato n = 45 contenitori, che vanno da 0° a 176° per evitare un effetto di avvolgimento. Il metodo impiegato era l'orientamento del gradiente locale ed è stata selezionata la tabella di visualizzazione. L'output di direzione corrisponde all'angolo vettoriale medio (che indica l'angolo di allineamento), mentre l'output di bontà rappresenta la lunghezza vettoriale media (che indica il grado di allineamento).
  2. Imaging di cellule vive
    NOTA: L'imaging di cellule vive consente di tracciare i processi cellulari dinamici in tempo reale, mantenendo le cellule nel loro stato naturale e vivente. Questa tecnica prevede l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza dotato di una camera di incubazione per acquisire immagini o video ad alta risoluzione delle cellule mentre crescono, si dividono o rispondono agli stimoli. Consentendo lo studio del comportamento e delle interazioni cellulari nel tempo e fornendo preziose informazioni sulla funzione e le dinamiche cellulari.
    1. Incubare le cellule con SiR-actina in rapporto 1:1000 con terreno di coltura per 1 ora a 37 °C.
    2. Aspirare il fluido e sostituirlo con uno in scala 1:2000 (SiR-actina: Fluido).
      NOTA: Questa diluizione serve a ridurre la tossicità cellulare per l'imaging dal vivo prolungato.
    3. Raccogli immagini in immunofluorescenza ogni 15 minuti per 5 ore su un microscopio verticale con camera di incubazione, tavolino automatizzato e lente dip-in 20x.
      NOTA: Per l'esperimento di imaging su cellule vive, il magnete è stato aggiunto non appena l'MRE è stato inserito nel sistema di imaging dal vivo.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli elastomeri magnetoreologici (MRE) ultramorbidi a base di silicone hanno moduli elastici che possono essere regolati con precisione applicando un campo magnetico. Ciò consente regolazioni rapide e bidirezionali all'interno di un intervallo fisiologico, con un controllo preciso sia sulla velocità che sull'entità delle variazioni (Figura 1). La meccanica del gel è stata valutata misurando il modulo elastico come descritto in precedenza, e il modulo elastico...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa tecnica è stata rigorosamente testata, ma un'attenta attenzione ai diversi passaggi è essenziale per un esperimento di successo.

In questo protocollo, utilizziamo un reticolo di diffrazione commerciale come stampo master per la modellizzazione. Tuttavia, è possibile utilizzare anche stampi con modelli alternativi, come stampi in silicone o microprodotti SU8, per creare un'ampia varietà di modelli in diverse dimensioni33,35

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata in parte supportata dal Delaware Center for Musculoskeletal Research COBRE (P20 GM139760), con sovvenzioni del National Institute of General Medical Science, del National Institutes of Health e dello Stato del Delaware. Vorremmo esprimere la nostra sincera gratitudine a Sagar Doshi del Center for Composite Materials (CCM) e Ashika Singh del laboratorio Dhong dell'Università del Delaware per il loro inestimabile supporto nel permetterci di utilizzare i loro microscopi confocali laser e per aver fornito l'esperienza necessaria per la caratterizzazione superficiale dei nostri materiali. Il loro contributo ha migliorato notevolmente la qualità del nostro lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
555 Alexa Fluor anti-anti-topo anti-anticorpo secondario per la capra  ThermoFisher ScientificA-21422https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Mouse-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-21422
Obiettivo a immersione 20xZeiss421452-9800-000https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm
Antenne da 35 mmThermoFisher Scientific130180https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&focusarea=Search%20All
Anticorpo primario anti-alfa actininaabcamEP2528Yhttps://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq
VVbjJ3ogKUmZxa4GtG
3SyllFzWvb5XPnwgB
Microsfere in polvere di ferro carbonilicochemicalstore.comCIPMShttps://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/
Colorazione DAPIThermoFisher ScientificD1306https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306
EssiccatoreFisher Scientific08-642-7https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword=
Griglia di diffrazioneThor LabsGR2550-45031https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031
Ecoflex Gel parte A & BLiscioEcoflex  GELhttps://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/
Detergente al plasma espanso per tavoloSigma AldrichZ561657-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657
Fibronectina dal plasma bovinoSigma AldrichF1141https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141
Flacktek DAC150 SpeedMixer FlacktekDAC150https://flacktek.com/products/small-flacktek/
ImageJ SoftwareNIHhttps://imagej.net/ij/download.html
Alcol isopropilicoAmazonhttps://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz
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