Tomografia seriale ad alta velocità utilizzando un robot automatico per cambio campioni

Summary

I dettagli di implementazione e la procedura di raccolta dati per la tomografia a raggi X basata su sincrotrone utilizzando il robot automatico di cambio campione presso la linea di fascio I13-2 Diamond Light Source (DLS) I13-2 sono presentati e discussi. Questo migliora drasticamente la capacità di produzione e l'efficienza della raccolta dati della linea di fascio.

Abstract

Questo manoscritto descrive un flusso di lavoro per la raccolta automatica dei dati che utilizza un braccio robotico per lo scambio di campioni, migliorando significativamente l'efficienza della raccolta dati. L'installazione, implementata per l'imaging a raggi X sincrotroni presso la Diamond Light Source (DLS) I13-2, Imaging beamline, utilizza un robot per ottenere tomografia seriale ad alta velocità (3D) o imaging (2D). Attualmente, per molti esperimenti, il tempo necessario per lo scambio e l'allineamento manuale del campione è paragonabile, o addirittura supera, la durata stessa della tomografia. Per massimizzare l'uso efficiente del tempo di fascio disponibile e aumentare la capacità sperimentale, è essenziale automatizzare lo scambio e l'allineamento dei campioni. L'uso del robot come rilevatore di campioni può aumentare la capacità di rendimento di almeno 4-10 volte rispetto alle procedure manuali, a seconda della dimensione del pixel scelta. Con la macchina Diamond II e gli aggiornamenti I13L beamlines Operando Coherent TOmography e Ptychographic Imaging (OCTOPI), l'aumento del flusso di raggi X ridurrà ulteriormente i tempi di scansione sperimentale, rendendo il sistema ancora più efficiente. Inoltre, l'automazione consente la raccolta dati a distanza, incluso un servizio opzionale per gli utenti tramite posta. Il centraggio automatico dei campioni consente una scansione completamente incustodita, che può essere eseguita da remoto. Questo rappresenta una caratteristica unica e innovativa del sistema. Questo manoscritto descrive l'intera procedura, inclusa la preparazione del campione, il montaggio su supporti specializzati, il trasporto alla linea di fascio e il posizionamento su vassoi dedicati per lo scambio robotico dei campioni. Vengono presentate la procedura per il centraggio automatico del campione e la successiva pipeline di ricostruzione della tomografia.

Introduction

L'automazione è stata ampiamente utilizzata nelle industrie manifatturiere pesanti per^{decenni 1, 2, 3}. Tuttavia, lo sviluppo di hardware e software robotico è maturato abbastanza da poter gestire compiti molto delicati come il sequenziamento genomico, l'esecuzione di interventi medici in ospedale o l'assistenza nell'esecuzione di esperimenti^chimici 4,5,6,7. L'automazione non solo elimina gli errori umani, ma migliora anche la capacità di throughput e^{l'efficienza 4}.

Una sorgente di raggi X sincrotrone genera radiazioni elettromagnetiche estremamente luminose e altamente coerenti nell'ampia gamma spettrale che va dall'infrarosso ai raggi X duri. Queste fonti consentono esperimenti di imaging ad alta capacità e alta risoluzione con tempi di scansione molto brevi e statistiche elevate. La coerenza parziale può essere utilizzata per ottenere un contrasto migliore per materiali morbidi che assorbono debolmente come polimeri o campioni di tessuto ^8,9,10 rispetto alle sorgenti a raggi X di laboratorio. Un set completo di dati per tomografia a raggi X – che consente la visualizzazione di un oggetto in 3D reale – richiede l'acquisizione di proiezioni del campione da angolazioni diverse. I progressi nella luminosità della sorgente, nell'hardware sperimentale e nei controlli permettono tempi di raccolta dati nell'intervallo di decine di secondi fino a⁸ minuti. Di conseguenza, il carico e l'allineamento del campione sono diventati più dispendiosi in termini di tempo rispetto alla scansione tomografia^{stessa 11,12}. È importante notare che cambiare manualmente i campioni in un esperimento di tomografia sincrotrone può richiedere un tempo significativo (rispetto al tempo di scansione), poiché è necessario seguire una procedura di sicurezza radiologica durante l'ingresso e la chiusura della cabina sperimentale. Questa procedura richiede solitamente diversi minuti. Inoltre, l'allineamento del campione può richiedere anche alcuni minuti.

Se questo processo di cambio e allineamento del campione viene automatizzato, si risparmierà molto tempo. Pertanto, un robot scambiatore campione è stato implementato sulla linea di fascio I13-2 Imaging della struttura del sincrotrone DLS. Questo manoscritto descrive il protocollo completo per eseguire un esperimento di microtomografia a raggi X sincrotroni con più campioni utilizzando un robot scambiatore di campioni alla linea di fascio di imaging^{I13-2 11,12}. Questa implementazione non solo migliora l'efficienza del tempo sperimentale, ma consente anche di condurre esperimenti a distanza. L'alternativa è il funzionamento manuale o semi-automatizzato, entrambi significativamente più lenti. Qui, semi-automatico significa utilizzare il robot solo per lo scambio di campioni senza allineamento del campione.

L'importanza dell'automazione è sottolineata dai progetti di automazione su altre linee di fascio di imaging sincrotroni, con i progetti più simili alla linea di fascio 2BM dell'APS¹³, alla linea di fascio SLS^{TOMCAT 14}, alla linea EMBL P14 su PETRA III¹⁵ e alla linea di fascio IMAGE presso la fonte luminosa 16 dell'Istituto di Tecnologia di Karlsruhe (KIT).. Nell'APS 2-BM, i campioni che richiedono la scansione con un robot sono montati su un supporto cinematico standard, che viene posizionato in un vassoio per cambiatore campioni con capacità massima di 60 campioni alla volta. Un braccio di presa prende quindi il campione e lo monta sullo stadio di rotazione. Tuttavia, l'allineamento del campione avviene offline utilizzando uno stereoscopio. Un sistema simile è stato installato nella linea di fascio TOMCAT in SLS, tranne che qui il processo è completamente automatizzato, che può eseguire carico di campione, allineamento, scansione di una corretta regione di interesse e ricostruzione. Il numero totale di campioni che possono essere scansionati contemporaneamente è di 60. Recentemente, la linea di fascio P14 sulla PETRA III¹⁵ ha installato un sistema di cambio campioni in grado di gestire campioni biologici morbidi dell'ordine di 1 mm. Il posizionamento e il centramento sono effettuati tramite la procedura di centratura a tre clic. Alla linea di fascio IMAGE del KIT, una stazione terminale di imaging e tomografia ad alta produttività consente la misurazione di fino a 1.500 campioni entro due^{giorni 16}. Diversamente dai sistemi robotici sopra menzionati, il sistema a linea di fascio I13-2 Imaging può attualmente gestire campioni fino a 8 mm di diametro e misurare fino a 112 campioni in un turno di otto ore, senza intervento umano, incluso il centramento automatico del campione.

L'attuale sistema tomografico su I13-2, Diamond-Manchester Imaging beamline, è stato riportato nella pubblicazione^{menzionata 17}. Per completezza, qui sono riassunti gli aspetti chiave degli esperimenti tomografici; si prega di fare riferimento anche alla Figura 1. Lo stack della fase tomografia consiste in un esapode (PI miCos) per la manipolazione del campione e per l'allineamento dell'inclinazione dell'asse di rotazione. Un stadio di rotazione a supporto d'aria è montato sopra l'esapode. Lo stadio di rotazione presenta eccellenti movimenti di oscillazione (<2,4 μrad) e di errore assiale (<100 nm). Il sistema di rilevamento tomografico è dotato di quattro diversi ingrandimenti (o campo visivo). Per lo studio attuale, sono stati utilizzati obiettivi di 1,25× (dimensione effettiva dei pixel di 2,6 μm con campo visivo di 6,7 mm x 5,6 mm) e 4× (dimensione effettiva dei pixel di 0,81 μm con campo visivo di 2,1 mm x 1,8 mm). L'obiettivo 1,25× aveva uno scintillatore LuAg:Ce da 500 μm, mentre l'obiettivo 4x aveva uno scintillatore LuAg:Ce da 100 μm (Crytur). Un rivelatore sCMOS (pco.edge 5.5) registra l'immagine dello schermo a scintillazione ingrandita tramite un ulteriore oculare fotooculare 2x (tutte le ottica del microscopio provengono da Olympus). I pixel efficaci variano da 2,6 μm a 0,33 μm, con una risoluzione di circa 1 μm al massimo ingrandimento utilizzato. Il chip rivelatore è composto da 2560 x 2160 con una dimensione di pixel di 6,5 μm, e la velocità massima di lettura dell'array di pixel è di 100 Hz.

Protocol

NOTA: Questo studio utilizza esemplari di insetti provenienti dal Natural History Museum (NHM) di Londra per un'analisi fenotipica comparativa. Gli esemplari erano stati acquisiti dal Museo di Storia Naturale, seguendo le procedure standard di acquisizione per garantire che gli esemplari fossero stati raccolti e donati legalmente.

1. Pianificazione dell'esperimento

1. Verifica la fattibilità di eseguire esperimenti di tomografia o imaging con il campione di interesse sulla linea di fascio I13-2 contattando il personale della linea di fascio tramite il seguente link: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. Invia una proposta per ottenere una fascia oraria per eseguire l'esperimento pianificato utilizzando il seguente link: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. Discutere la preparazione del campione e il processo di misurazione del campione con il personale della linea di fascio una volta accettata la proposta e programmato l'esperimento. Gli esperimenti condotti con il robot hanno determinati requisiti, che sono forniti nella sezione successiva (sezione 2).
4. Discutere le dimensioni e la composizione del campione con il personale della linea di fascio per verificare che l'esperimento possa essere eseguito con successo sulla linea del fascio.
5. Inizia a prepararti per la visita sperimentale con largo anticipo seguendo le istruzioni sul sito web (https://www.diamond.ac.uk/Users.html).
6. Completare l'addestramento sulla sicurezza prima della sessione sperimentale.

2. Preparazione del campione (per esperimenti robotici)

1. Preparare le basi campione^{SPINE-Compatibili 18} per il montaggio del campione. Montare ogni campione su una base standard in stile SPINE dotata di un codice a barre Data Matrix per consentire il tracciamento automatico dei campioni.
2. Attacca il campione alla base usando una di due configurazioni. Montaggio del pin: Fissare il campione su un pin in stile SPINE (vedi Figura 1C, inserito). Contenitore o montaggio diretto: Posizionare il campione all'interno di un contenitore compatibile, come un tubo micro-centrifuga/tubo di poliimide, oppure direttamente sulla base del campione.
3. Verifica la compatibilità dimensionale con la presa robotica verificando che il campione montato rientri nelle dimensioni consentite per garantire una maneggevolezza robotica sicura ( vedi Figura 2):
   Opzione A: Si inserisce in un cilindro di 8 mm di diametro x 20 mm di altezza.
   Opzione B: Si adatta all'interno di un cilindro di 3,5 mm di diametro x 33 mm di altezza.
4. Assicurati che entrambe le configurazioni siano centrate sulla base campione. Assicurati che l'altezza totale (campione + montaggio + base) non superi 27 mm o 40 mm, a seconda della configurazione scelta.
5. Quando monti i campioni su perni SPINE, assicurati che il campione sia posizionato sopra il perno, senza che nessuna parte di esso venga oscurata dall'albero del perno. Il campione deve essere montato verticalmente e centralmente sulla base del perno per evitare il contatto con la presa robotica. Questo è particolarmente importante per il montaggio dell'Opzione B descritto nella sezione 2.3 del protocollo, così come per i campioni allungati montati sopra i pin del campione.
6. Quando si monta all'interno di contenitori o tubi, fissa il campione saldamente all'interno del contenitore in modo che non si sposti durante il trasporto o la maneggiazione robotica. Assicurati che il contenitore stesso rimanga allineato verticalmente sulla base del campione.
7. Fissare l'elemento di montaggio scelto (perno o contenitore) in modo sicuro e verticale sulla base del campione per garantire la stabilità posizionale durante tutto l'esperimento.
8. Utilizzare un metodo di adesivo o di fissaggio affidabile per prevenire distacco durante la spedizione e la manipolazione automatica, poiché entrambi i processi possono introdurre sollecitazioni meccaniche.
   NOTA: Gli adesivi comuni includono cianoacrilato (supercolla), cera di paraffina e colla termofusibile. Consulta il personale della linea di fascio se non sei sicuro della compatibilità dei materiali.
9. Controlla che tutti i campioni siano posizionati a un'altezza costante dal bordo superiore del contenitore o sul perno del campione. Per i campioni montati all'interno dei contenitori, assicurati che la distanza laterale dalla parete del contenitore sia la stessa su tutti i campioni.
   NOTA: Un posizionamento costante è essenziale per un allineamento automatico affidabile. Campioni più piccoli rispetto al campo visivo permettono una maggiore tolleranza.
10. Documenta il codice Data Matrix associato a ciascun campione per garantire una corretta identificazione del campione durante l'analisi dei dati.
11. Generare un file samples.csv per collegare ogni nome campione al codice matriciale dei dati di base del campione e per trasmettere i parametri rilevanti per l'esecuzione delle scansioni tomografiche.

3. Confezionamento e consegna campioni

1. Non oltre 15 giorni lavorativi prima della sessione sperimentale, presentare la valutazione del rischio sperimentale (ERA) e dichiarare tutti i campioni presenti. Questa ERA deve essere approvata dal gruppo di salute e sicurezza (HSE) del DLS prima che i campioni possano essere spediti/portati in loco.
2. Usa la base universale del campione con il contenitore combinato di stoccaggio e/o spedizione montato a perno per il campione, chiamato anche Uni-puck. Questo è piuttosto importante se si invia per posta.
3. Se i campioni non entrano nelle fessure del contenitore di stoccaggio menzionate al passo 3.2, si prega di prevedere disposizioni alternative di montaggio, ad esempio l'uso di cappucci protettivi magnetici che si adattino alla base del campione e portino direttamente i campioni per le misurazioni.

4. Configurazione sperimentale

1. Regolare i parametri della sorgente a raggi X per massimizzare il contrasto nel campione. Per ottenere ciò, sposta l'intero spettro e/o filtra lo spettro dei raggi X.
2. Ottimizza la fotocamera per la distanza di campionamento basandosi sullo spettro dei raggi X e sul grado di contrasto di fase desiderato per un dato campione.
3. Seleziona l'ingrandimento del microscopio in base alla dimensione del campione e al campo visivo richiesto, e seleziona l'obiettivo corrispondente del microscopio.
4. Allinea la posizione orizzontale della telecamera (asse x in laboratorio) rispetto al fascio di raggi X.

5. Carico e allineamento del campione

1. Controlla accuratamente i campioni e il montaggio del campione all'inizio di ogni sessione sperimentale per eventuali campioni che sembrano danneggiati o montati in modo debolle. Informare gli utenti su eventuali campioni di questo tipo.
   NOTA: Attualmente, la linea di fascio è dotata di supporti per un massimo di 7 dischi, e ogni disco può contenere fino a 16 campioni. Un totale di 112 campioni possono essere misurati durante una singola corsa robotica. Si prega di consultare la Figura Supplementare 2, che illustra come identificare le posizioni dello slot (birilli) del disco.
2. Montare i campioni sui rispettivi slot di disco e di disco (pin) identificati nel file samples.csv. Esegui una prova generale della procedura di scambio campioni robotico su alcuni campioni per testare il funzionamento del robot e assicurarti che i campioni rientrino nelle specifiche richieste.
3. Utilizzare una base campione con un perno di campione (senza campione) per allineare l'asse di rotazione dello stadio di rotazione al centro del rivelatore in direzione orizzontale.
4. Sposta la parte superiore del perno al centro della telecamera a raggi X (Figura 3A). Allineare la telecamera del telescopio (TC), che è posizionata a 90° rispetto al fascio, come mostrato nell'immagine (Figura 3), al centro del campo visivo (FOV). Determina le coordinate di questa posizione nelle coordinate del pixel TC.
5. Aggiorna la posizione target del campione nello script che gestisce l'allineamento del campione.
6. Monta un campione rappresentativo. Esegui lo script automatico di allineamento del campione per posizionare il campione al centro di rotazione sul TC. Il collegamento allo script è fornito nel File Supplementare 1.
7. Controlla se la regione campionaria di interesse (ROI) è centrata nel campo visivo (FOV) della telecamera a raggi X.
8. Se il ROI non è centrato nel campo visivo, ripeti i passaggi da 5.5 a 5.7 e affina l'allineamento del campione cambiando le coordinate per la posizione target.
   NOTA: Le sezioni 4 e 5 sono eseguite dal contatto locale eccetto la sezione 4.2.

6. Configurazione dell'acquisizione dati

1. Controlla che la struttura file/cartella richiesta sul file system DLS sia stata creata per memorizzare dati grezzi, file di metadati e risultati di analisi.
2. Copia il file samples.csv nella cartella menzionata nel passo 6.1.
3. Aggiorna il tempo di esposizione della fotocamera e il numero di proiezioni da acquisire nel samples.csv, in base alla struttura del campione e al contrasto desiderato.
4. Definisci due gruppi di posizioni motorie chiamate Posizione di Carico (LP) e Posizione di Scansione (SP). LP è il set in cui gli stadi sono ottimizzati per il carico del campione, mentre lo SP è per la scansione tomografia del campione.
   NOTA: La Sezione 6 è eseguita dal contatto locale o creata automaticamente dai sistemi DLS.

7. Esecuzione della raccolta dati

1. Monta tutti i campioni nelle posizioni corrette di disco e perno, come indicato nel file samples.csv.
2. Per la raccolta dati, si utilizza il workbench Generic Data Acquisition (GDA), un software open-source sviluppato da DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html). È un sistema basato su Java utilizzato in DLS per controllare esperimenti e raccogliere dati. Uno screenshot è fornito nella Figura Supplementare 1.
3. Usa un oggetto chiamato tomomatic in GDA per il cambio automatico del campione, l'allineamento del campione e la misurazione della tomografia.
4. Emetti il comando tomomatic.load (/dls/i13/data/year/... samples.csv) nel terminale GDA per caricare il file. Poi emettere il tomomatic. scansiona () per eseguire il comando.
5. Il robot prende prima il campione dal vassoio di carico e lo porta al lettore di codici laser a barre. Una volta che il codice a barre è stato letto, il campione viene spostato nella fase di tomografia e lo monta. Assicurati che l'intero processo funzioni senza intoppi.
   NOTA: Qui viene utilizzato un robot Yaskawa con il gripper a flessione sviluppato internamente.
6. Una volta effettuato il caricamento del campione, gli stadi si spostano nella posizione SP. Successivamente, viene eseguita la funzione autoCentrePin all'interno dello script tomomatic, che posiziona il campione nel Centro di Rotazione (COR). La misurazione della tomografia a raggi X con un robot cambiatore di campioni è ora pronta per essere eseguita.
   NOTA: Si prega di controllare il File Supplementare 1 per il pseudocodice della scrittura tomomatica.
7. Eseguire la funzione TomoFlyscan per la misurazione della tomografia. La funzione raccoglie innanzitutto 40 immagini di proiezione senza fascio di raggi X, chiamate immagine scura (DI), e 40 immagini con fascio di raggi X ma senza un campione nel fascio, chiamate immagine a campo piatto (FI). Queste immagini saranno utilizzate per la normalizzazione durante la ricostruzione dei dati.
8. Raccogli immagini di proiezione (PI) con il campione nel fascio agli intervalli di angolo di rotazione del campione, come indicato nel file samples.csv. Nel caso in esame, dispone di 3001 immagini PI.
   NOTA: Tutti i passaggi, dal 7.5 al 7.8, procedono uno dopo l'altro senza alcun intervento umano.

8. Accesso ai dati e analisi

1. Accedi ai dati salvati navigando nel file system e nella cartella appropriati. I dati scansionati menzionati nella sezione precedente sono salvati in due file diversi, uno con *.nxs e *.hdf con * come numero numerico, ad esempio: 123456.nxs e 123456.hdf. L'NXS contiene i metadati per la scansione, mentre l'HDF contiene tutti i dati dell'immagine proiettiva (dati collegati da NXS).
2. Usa la pipeline di ricostruzione^{Savu 19} per generare slice 2D da immagini di proiezione.
3. Accedi e visualizza le immagini ricostruite utilizzando software di rendering 3D, come AVIZO/ImageJ.
   NOTA: Il completamento delle sezioni 7 e 8 richiede azioni coordinate sia da parte degli utenti che dei contatti locali, con singoli sotto-passaggi eseguiti da ciascuno.

Results

La Figura 1 mostra il robot cambiacampioni Yaskawa GP7 installato sulla linea di fascio Diamond I13-2 Imaging. La Figura 1A mostra il robot (1) e il gripper di flessione progettato internamente (2). Questa pinza può contenere un campione con un diametro di ≤ 8 mm. La Figura 1B mostra il robot (1) e il sistema di ottiche/radiocamere (4) e (6) utilizzati per l'acquisizione dei dati tomografici. Il robot pinzatore preleva il campione dal vassoio del campione (3), che può contenere 7 uni-puck con 16 campioni ciascuno, come mostrato nella Figura 1C. I campioni sono montati sul perno in alluminio (5) e l'acquisizione dei dati della tomografia viene effettuata tramite il sistema di rivelazione (6). I dettagli di (5) e (6) sono forniti nell'ultimo paragrafo della sezione introduttiva. La linea rossa interrotta nella Figura 1B indica la direzione del fascio di raggi X.

I dettagli dello schema di montaggio del campione e del design del gripper a flessione sono illustrati nella Figura 2. La Figura 2A mostra un campione di plastica cilindrica, realizzato tramite stampa 3D, incollato alla base del campione. Il bordo del campione rappresenta l'inviluppo dell'altezza massima del campione e il diametro. Le frecce rosse indicano la posizione in cui la pinza a flessione tiene la base del campione per spostarlo dal vassoio al stadio della tomografia e viceversa. Un disegno 3D della pinza a flessione è mostrato nella Figura 2B. Le dita del gripper sono azionate da un tubo di trasmissione controllato pneumaticamente (Figura 1B, punto 2). Lo spazio centrale nel gripper ha un diametro di 8,9 mm, come mostrato nella Figura 2C, permettendo una dimensione massima del campione di 8 mm con un margine di ~1 mm. La Figura 2D mostra l'immagine della parte superiore della fase tomografica. Un perno in alluminio è montato sopra i due stadi ortogonali e un disco magnetico, che ha un diametro esatto tale che la cavità sul fondo della base del campione si adatta. Poiché questo disco è magnetico, mantiene saldamente la base del campione montata in posizione durante le misurazioni tomografiche.

Per questo esperimento rappresentativo, sono stati selezionati 64 campioni di insetti forniti dal Natural History Museum (NHM) di Londra. I campioni sono stati selezionati per rappresentare una gamma di fenotipi di artropodi rispettando i limiti di dimensione del gripper. Poiché gli artropodi, in particolare gli insetti, rappresentano la stragrande maggioranza della diversità di specie conosciuta, con oltre 1 milione di specie nominate, è particolarmente difficile campionarli per studi comparativi sul fenotipo. Il campione attuale dimostra quindi il potenziale di questo approccio campionando tre cladi di artropodi a livello di classe: Arachnida, Entognatha e Insecta, oltre a campionare più finemente all'interno degli insetti per catturare variazioni in sette ordini, inclusi quattro degli ordini più ricchi di specie esistenti oggi. Gli esemplari venivano fissati su un cartoncino con adesivo. Le schede venivano poi montate sui pin campione. Si evita di montare i campioni (insetti) direttamente sui perni del campione poiché una struttura altamente assorbente nel fascio con campioni a bassa assorbimento creerà artefatti di striatura durante le ricostruzioni, oltre alla difficoltà di montarli in modo sicuro sui perni del campione. La Tabella 1 mostra il file samples.csv modello che l'utente completerà con i parametri richiesti per la tomografia (colonne A, B, C, E, F, G, H, K). La descrizione di ciascuna colonna è fornita nella tabella. Le colonne D, I, J e L nella input_file vengono riempite dopo l'allineamento e l'ottimizzazione dei parametri tomografici sulla linea del fascio. Tutti i 64 campioni sono stati inizialmente misurati con un obiettivo 1,25x (FOV di 6,7 mm x 5,6 mm) a una distanza di propagazione ottimizzata dei raggi X (dal campione al rivelatore), e successivamente gli stessi campioni sono stati misurati con un obiettivo 4x utilizzando i propri parametri ottimizzati. Una volta caricati i campioni sul vassoio e fissato il contenitore sperimentale, la scansione viene avviata con GDA.

L'allineamento automatico del campione veniva eseguito tramite uno script scritto in Python (Posizione del file su GitHub: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). All'inizio, l'allineamento del campione viene impostato usando una base campionaria e una combinazione di pin senza il campione. La Figura 3 mostra il perno del campione, visto dalla telecamera laterale del telescopio (camera posizionata a 90° rispetto al fascio di raggi X - Figura 1B, punto 4), che viene utilizzato come campione standard di allineamento. L'immagine della telecamera del telescopio è binarizzata in modo che il campione possa essere rilevato dallo sfondo. I bordi del campione sono determinati e segnati come un confine bianco, come mostrato nella Figura 3. La posizione delle coordinate di riferimento del campione è la parte superiore del perno segnata come un cerchio bianco nell'inserito della Figura 3A. Osservando l'immagine a raggi X, il ROI del campione è posizionato sul COR, e la posizione richiesta delle coordinate del bersaglio, contrassegnata come una freccia blu a doppia punta con un punto rosso (Figura 3B), è determinata sulla telecamera laterale. Questa impostazione di posizione target permette di posizionare il campione non solo sul COR, ma anche qualche millimetro più in alto/in basso o un po' fuori centro, se necessario. Dopo che il campione è stato caricato sulla fase di tomografia, viene eseguita la funzione di centramento automatico. Lo script prima sposta il campione nella posizione target (Figura 3B) e poi passa a 0°. Successivamente, sposta il campione a 90° (Figura 3C) e determina quanta quantità di campione deve essere spostata per inserire il campione nel centro di rotazione (COR). Di solito ci vogliono circa 15-20 secondi. Il campione ora è sul COR (Figura 2D), e il COR è già stato allineato con il centro della telecamera. Il sistema è ora pronto per l'acquisizione di tomografie.

In questo studio sugli insetti NHM, sono state eseguite 128 tomografie senza intervento umano. La misura ha richiesto un totale di 17 ore. Ogni scansione durava circa 8 minuti. Un esperimento del genere senza l'uso del robot avrebbe richiesto circa 20-25 minuti per ogni tomografia. Ciò implica che le tomografie con robot sono 3-4 volte più veloci rispetto a quelle manuali nel caso in questione. La Tabella 2 mostra un tipico file di log generato alla fine di una scansione batch robotica, inclusi i parametri necessari per collegare ogni numero di scansione al suo campione corrispondente. Ulteriori dettagli sono forniti nella leggenda della Tabella 2 .

La Figura 4 mostra immagini di proiezione normalizzate di uno dei campioni, un insetto (Classe – Insecta, ordine – Coleotteri), fotografato durante l'esperimento tomografico menzionato sopra con ingrandimento 1,25x e 4x. La riga superiore, Figura 4A-C, mostra un campione immaginato con 1,25x, e poi lo stesso campione è stato immagineggiato con 4x, cioè Figura 4D-F. La Figura 4 A–F mostra le immagini proiettate acquisite a 0°, 90° e 180°. Il rettangolo giallo mostra il campo visivo delle immagini di proiezione ingrandite acquisite con un obiettivo 4x. È importante notare che, una volta caricati i campioni sul vassoio mostrato nella Figura 1C, tutti i processi procedevano senza alcun intervento umano. Si noti che queste due scansioni sono state acquisite a ~8,5 ore di distanza. Questo indica la stabilità e la riproducibilità dell'allestimento.

La Figura 5 mostra le fette orizzontali o trasversali dal set di fette di ricostruzione tomografica del campione menzionato nella Figura 4. Sia le fette 1,25x (Figura 5A) che quelle 4x (Figura 5B) sono tracciate senza ritagliare le immagini e hanno una dimensione di 2510 x 2510 pixel. Le fette sono ben centrate all'interno del campo visivo, il che dimostra che è possibile zoomare in una regione con ingrandimento maggiore senza necessità di interventi fisici.

I risultati qui presentati dimostrano che l'implementazione di un sistema robotico per lo scambio di campioni negli esperimenti di microtomografia a sincrotrone offre diversi vantaggi significativi. Questi includono un aumento della produttività, una maggiore efficienza operativa e la capacità di effettuare scansioni a ingrandimenti multipli (zoom-in) senza necessità di intervento umano. Considerando il numero di campioni da scansionare, come nello studio NHM presentato qui, sarebbe impossibile ottenere conclusioni statisticamente robuste e coerenti tramite scansione manuale.

Figura 1: Immagine del robot e dell'impianto sperimentale di tomografia installato nella linea del fascio I13-2. (A) Il robot (1) con una presa a flessione progettata internamente (2). (B) Il vassoio di carico del campione (3) e la fase di tomografia (5). La telecamera ottica (camera telescopica), indicata come (4), viene utilizzata per allineare i campioni sul COR. Il sistema di rivelatori (6) utilizzato per la misurazione contiene molteplici obiettivi motorizzati per modificare automaticamente il campo visivo e un rivelatore pco.edge 5.5. La freccia tratteggiata rossa rappresenta la direzione del fascio di raggi X. (C) Immagine del vassoio di carico campioni con 7 disci, e ogni disco può contenere fino a 16 campioni montati su una combinazione di base e perni campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dettagli dello schema di montaggio del campione e del design del gripper a flessione. (A) Immagine di un campione fittizio in plastica stampato in 3D montato su una base di campione, che rappresenta l'inviluppo massimo del campione che può essere gestito dal gripper a flessione. Le frecce rosse indicano la posizione in cui il pinzaglio tiene la base del campione. (B) Progettazione 3D della presa a flessione. Le dita del gripper sono azionate per tenere o rilasciare la base del campione. (C) Disegno della sezione verticale della presa con le dimensioni. L'apertura massima al centro è di 8,9 mm; pertanto, la dimensione massima ammissibile del campione è ≤ 8 mm. (D) Immagine della parte superiore della fase tomografia. Un perno in alluminio (indicato dalla freccia blu) è montato in cima ai due stadi ortogonali. Un disco magnetico è fissato sulla sommità del perno su cui la base del campione (insieme al campione) è posizionata dal gripper. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Istantanee dal grafico video della procedura di allineamento COR usando la telecamera del telescopio laterale. (A) Immagine del perno di allineamento poco prima che inizi la routine di allineamento. La posizione del bersaglio è una croce blu a doppia testa con punto rosso centrale, che coincide con la COR della fase di rotazione della tomografia. L'inserimento mostra l'immagine ingrandita della parte superiore del perno che mostra il centro del campione rilevato, sia in altezza che in larghezza. (B) Perno allineato alla posizione bersaglio a 0°. (C) Perno ruotato a 90°, ed è fuori posizione bersaglio. (D) Perno allineato alla posizione bersaglio a 90°. Ora il perno è allineato in entrambe le direzioni ortogonali; Pertanto, il campione ruoterà al centro della telecamera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini di proiezione normalizzate di un insetto raccolto con un obiettivo 1,25x e un 4x. L'insetto apparteneva alla classe degli Insetti, ordine dei Coleotteri. Questo rappresenta due delle 128 tomografie. L'insetto fu incollato su una carta e fissato al spillo campione. Le immagini proiettate con obiettivo 1,25x sono a (A) 0°, (B) 90°, (C) 180° e 4x a (D) 0°, (E) 90° e (F) 180°. Il set di tomografie 1,25x e 4x è stato raccolto in un'unica seduta senza alcun intervento umano. Un set di immagini a 1,25x offre una visuale completa del campione, mentre un set 4x di immagini mostra la capacità di zoom. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Confronto di una fetta tomografica identica acquisita utilizzando due campi visivi differenti. Una singola fetta ricostruita dalla tomografia delle immagini proiettate nella Figura 4 per (A) ingrandimenti 1,25x e (B) 4x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: File samples.csv tipico che l'utente fornisce contenente parametri di tomografia. Questo file viene letto dallo script tomomatic Python utilizzato per l'acquisizione dei dati. Le colonne A (descrizione del campione), B (ID disco), C (slot nel puck), E (passo di rotazione della tomografia), F (numero di FI), G (numero di DI), H (ingrandimento da usare) e K (priorità di slot) vengono inserite dall'utente. Le colonne D (tempo di esposizione), I (distanza di propagazione a raggi X tra campione e fotocamera), J (movimento della telecamera attraverso il fascio per posizionare il COR al centro della fotocamera) e L (codice a barre della base del campione) vengono inserite dopo l'allineamento e l'ottimizzazione preliminare. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Tipico file di log di output salvato come Output_file.txt dopo che tutti i campioni sono stati scansionati. Il file riporta tutti i parametri di input e, inoltre, fornisce il codice a barre del campione scansionato (colonna M), il percorso verso i metadati scansionati e i file immagine (colonna N) e la posizione del motore utilizzato per la raccolta FI (colonna O). Fondamentalmente, questo file di output fornisce le informazioni necessarie per la ricostruzione e l'analisi dei dati. Poiché non è stato fornito alcun input nella colonna A del file di input, questa colonna è riempita con il conteggio attuale della scansione, insieme ai numeri di puck e pin. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Pseudocodice che descrive lo script usato per far funzionare il robot come cambiatore di campioni. Il file delinea la routine per il montaggio automatico del campione, la lettura del codice Data Matrix, l'allineamento automatico del campione e l'esecuzione di una scansione tomografia. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 1: Screenshot della GUI generica per l'acquisizione dati. Questa interfaccia consente l'adattamento dei parametri base della telecamera, la visualizzazione in tempo reale del campione e l'avvio delle acquisizioni tomografiche. Le scansioni possono essere avviate utilizzando il pulsante a schermo (solo scansione manuale) oppure tramite l'interfaccia a riga di comando, indicata dal rettangolo giallo in basso al centro dello screenshot. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Fotografia del Puck standard SPINE (a sinistra) e al Puck Cap (a destra). Le posizioni dei perni, mostrate in rosso, su cui sono montate le basi campioni sono numerate partendo dalla posizione opposta alla tacca sul palo centrale di contenimento. Il numero 7267 (contrassegnato in bianco) è il numero identificativo del disco. Il Puck Cap può essere montato sul Puck per proteggere i campioni durante il trasporto o la conservazione. Si prega di assicurarsi che le dimensioni dei campioni siano compatibili prima di tentare di montare il cappuccio. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

La preparazione e l'allineamento del campione sono due passaggi critici affinché il robot automatico di scambiacampioni funzioni correttamente ed^{efficacemente 11}. La dimensione del campione e i requisiti di montaggio sono indicati nella Sezione 2 (Protocollo). Fondamentalmente, il diametro del campione deve essere di 8 mm o meno ed essere ben centrato sulla base del^{campione 12}. Questo vincolo è stabilito dalle dimensioni della presa. Inoltre, tutti i campioni in una singola misurazione devono essere alla stessa altezza in modo che la posizione dei campioni al centro di rotazione sia coerente su tutti i campioni. Se il robot è stato allineato per un esperimento, allora eseguire un altro esperimento con il robot scambiatore di campioni è completamente automatizzato, tranne per impostare la regione di interesse per il campione. Questo è spiegato nella sezione dei risultati rappresentativi, Figura 3. Inoltre, è importante notare che questo fa parte del processo di allineamento eseguito dal personale della linea di fascio (contatto locale). Una volta impostato questo parametro, tutte le misurazioni del campione vengono eseguite senza intervento umano. Dal punto di vista dell'utente, le misurazioni sono completamente automatizzate. Ad oggi, vengono utilizzate solo basi campione e perni di campione di Molecular Dimensions Ltd; tuttavia, ci sono altri fornitori, come MiTeGen e Hampton Research, che producono le basi campioni e i perni in stile SPINE.

Presse per campioni più grandi, progettate per contenere campioni fino a 12 mm di diametro, sono attualmente in fase di sviluppo e test. Questo permetterà al robot di maneggiare campioni più grandi, come quelli posti all'interno di tubi microcentrifughe e montati su una base per campioni. Un design migliorato del gripper potrebbe coinvolgere un meccanismo che si avvicini al campione di lato, eliminando così le attuali restrizioni sulla dimensione del campione. Inoltre, l'aggiornamento della linea di fascio aumenterà la capacità di un ordine di grandezza, permettendo la scansione di oltre 3.000 campioni al giorno. Questo, a sua volta, permetterà la raccolta di dataset statisticamente significativi che comprendono circa 30.000 campioni entro 10 giorni dal tempo del fascio. Nel prossimo futuro implementeremo una nuova pipeline di ricostruzione della tomografia, chiamata HTTomo.

Va notato che parametri come la distanza di propagazione del fascio (distanza del campione al rivelatore), il tempo di esposizione, il numero di proiezioni, ecc., devono essere ottimizzati in anticipo, come in ogni altro esperimento di tomografia a raggi X di sincrotrone. Un altro vincolo è che le fasi coinvolte nell'esperimento, come la manipolazione del campione a 6 assi, le fasi di tomografia e le fasi di manipolazione della camera, dovevano trovarsi in una certa posizione definita per il carico e lo scarico del campione. Ciò implica che le fasi devono essere spostate avanti e indietro durante il caricamento e lo scarico del campione.

In conclusione, la tomografia ad alta produttività può essere eseguita con l'aiuto del robot per il cambio campioni, rendendo il processo almeno 4-10 volte più veloce e riducendo o eliminando il tempo morto rispetto all'operazione manuale. L'automazione sperimentale con i robot ci permette anche di schierare il personale in modo più efficiente, poiché sono necessarie meno persone per eseguire le misurazioni. Misurare insiemi di dati statisticamente significativi è importante per molti campi scientifici in cui è necessario un volume di dati affidabile e sufficiente per affrontare il caso scientifico. Usare un robot può aiutare molto in questi compiti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-bearing rotation stage	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	Stativo di rotazione a cuscinetti aerei
AVIZO	ThermoFisher scientific		Software commerciale per la visualizzazione e l'analisi dei dati
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	Fornitore alternativo di CryoCap
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	Fornitore alternativo di CryoCap
Cryocaps( MD7-401) and Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	Usato per il montaggio dei campioni
Detector Optics	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	Obiettivo e foto-oculare
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	Software di acquisizione dati generico
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	Stativo a 6 assi per l'allineamento della tomografia e la manipolazione del campione
ImageJ	Sviluppato presso il National Institutes of Health, University of Wisconsin	https://imagej.net/ij/	Software open source per l'elaborazione e la visualizzazione delle immagini
pco.edge 5.5 sCMOS camera	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	Fotocamera a raggi X utilizzata per l'imaging tomografico
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	Pipeline di ricostruzione tomografica
Scintillators	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	Ottica scintillante
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	I campioni vengono montati su Uni-puck per il prelievo del robot